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基于正交实验双指标法优化麻蛇子粉水提工艺

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陈美琦毛会秀李佳怿王舒玉郝普雨王俊香

摘 ?????要：研究了麻蛇子粉中蛋白质和多糖的最佳提取工艺。通过超声水提的方法，以蛋白质和多糖得率为指标，考察提取时间、pH值、料液比对提取物中蛋白和多糖得率的影响。在单因素实验的基础上进行正交实验，得到麻蛇子粉的最佳提取工艺。结果麻蛇子粉中蛋白质和多糖的最佳提取工艺为提取时间30 min，pH=9，料液比1∶40 g/mL，在这个条件下，蛋白质得率为12.48%，多糖得率为0.55%，且综合评分最高。通过双指标优化麻蛇子粉水提工艺，可以同时兼顾蛋白及多糖两种抗肿瘤有效成分，获得具有优良抗肿瘤活性的水提液，可为后续抗肿瘤实验的深入研究提供基础。

关 ?键 ?词：麻蛇子粉;超声提取;正交实验;蛋白质;多糖

中图分类号：R360.4010 ??????文献标识码： A ??????文章编号： 1671-0460（2019）06-1213-04

Abstract： The optimum extraction technology of protein and polysaccharide from lizard powder was studied. The effects of extraction time， pH value and solid-liquid ratio on the yields of protein and polysaccharide by using ultrasonic water extraction method were investigated. On the basis of single factor experiment， orthogonal experiment was carried out to obtain the best extraction technology of lizard powder. The optimal extraction conditions of protein and polysaccharide in lizard powder were determined as follows： extraction time 30min， pH=9， solid-liquid ratio 1：40. Under above condition， protein yield was 12.48%， polysaccharide yield was 0.55%， and the comprehensive score was the highest. By optimizing the water extraction process of lizard powder with two indexes， effective anti-tumor components of protein and polysaccharide can be taken into account at the same time， and the water extract with excellent anti-tumor activity can be obtained. The paper can provide a basis for the further study of anti-tumor experiments.

Key words： Lizard powder;Ultrasonic extraction;Orthogonal test;Protein;Polysaccharide

麻蛇子又名馬蛇子、蜥蜴[1]，蛇狮子、石龙子。为蜥蜴科麻蜥属动物丽斑麻蜥（Eremias argus Peter）的全体。生活于干燥地区，行动迅速，捕食昆虫，分布于东北及河北、山西、内蒙古、江苏、安徽、山东、河南、陕西、甘肃、青海、宁夏等地区。在中药古典文献中有许多关于麻蛇子的记载，如：“消瘿散瘰，治淋巴结结核。”[1]“镇静，滋阴止咳。主治癫痫，喘咳，慢性湿疹，淋巴结核。”“活血祛瘀，消瘿散结，解毒、镇静。治骨折，淋巴结核，气管炎，羊痫风等。”[2]“（治）骨结核及骨髓炎等。”[3]等。现代对麻蛇子的研究在调研方面较多，实验方面研究很少，正因如此，对麻蛇子实验研究具有现实的意义。传统上麻蛇子煎煮口服，但麻蛇子是虫类中药，含蛋白较多，煎煮温度太高，蛋白质易被破坏，为此研究超声水提工艺，有利于提高药物抗肿瘤效果。本课题运用超声水提的方法，采用紫外可见分光光度法，以麻蛇子粉中蛋白质和多糖得率为指标优化水提工艺。

1 ?实验部分

1.1 ?仪器

超声波清洗器KQ-500E型：昆山市超声仪器有限公司;循环水式真空泵SHB-III：郑州长城科工贸有限公司; PHS-25pH计：上海仪电科学仪器股份有限公司;数显恒温水浴锅HH-6：上海梅香仪器有限公司;电子天平A1004N：上海精密科学仪器有限公司等。

1.2 ?试剂

麻蛇子（安徽亳州中药材市场）经山东中医药大学药学院高德民副教授鉴定为正品;BSA牛血清蛋白、福林酚（BR，国药集团化学试剂有限公司）;酒石酸钾钠、苯酚、氢氧化钠、无水碳酸钠、硫酸铜等试剂。

2 ?实验方法

2.1 ?蛋白质含量测定[4]

2.1.1 ?牛血清白蛋白溶液对照品的配制

用小烧杯精密称取牛血清白蛋白对照品20.00 mg，用蒸馏水溶解后放入100 mL容量瓶中，得到200μg/mL标准蛋白质溶液，保留备用。

2.1.2 ?碱性铜溶液的配置

首先配置0.1 mol/L的酒石酸钾钠，0.04 moL/L的硫酸铜，4%碳酸钠，0.8%氢氧化钠，然后取0.1 mol/L酒石酸钾钠0.5 mL， 0.04 mol/L硫酸铜0.5 mL， 4%碳酸钠25 mL， 0.8%氢氧化钠25 mL，混合均匀，得到堿性铜溶液，现用现配。

2.1.3 ?标准曲线的绘制

精密量取样品0，0.2，0.4，0.6，0.8，1.0 mL，然后分别放入具塞试管中，加入蒸馏水，使所有试管中的液体均为1 mL，分别加入2.1.2项下配置好的碱性铜溶液5.0 mL，混合均匀，室温放置10 min，快速精密加入避光密封保存的福林酚试剂0.5 mL，室温放置30 min后，在紫外分光光度下650 nm测定其吸光度。

2.1.4 ?样品中蛋白质含量的测定

精密吸取样品溶液2 mL，置于具塞试管，加入配置好的碱性铜溶液5.0 mL，混合均匀，室温放置10 min，精确快速加入福林酚试剂0.5 mL，室温放置30 min，在紫外分光光度下650 nm测定吸光度。用以下公式测定样品中蛋白得率：

2.2.1 ?葡萄糖对照品溶液的配制

将葡萄糖用105 ℃的烘箱干燥至恒重，称取对照品10.00 mg，加水溶解后，放入100 mL容量瓶中，即得0.1 mg/mL的葡萄糖对照品溶液。

2.2.2 ?标准曲线的制备

分别精密量取对照品溶液0，1，2，3，4，5 mL，分别放入10 mL容量瓶中，加水稀释至刻度，分别量取2 mL，放入10 mL具塞试管中。分别加入5%的苯酚溶液1 mL，混合均匀，迅速精密加入浓硫酸 5 mL，混合均匀，室温放置10 min后，置40 ℃水浴锅中保温15 min，取出后冷却至室温，在490 nm波长处测定吸光度。

2.2.3 ?样品中多糖含量的测定

取2 mL麻蛇子粉水提液于试管中，加入5%的苯酚溶液1 mL，混合均匀，快速精密加入浓硫酸5 mL，混合均匀，室温放置10 min，置40 ℃水浴锅中保温15 min，取出后冷却至室温，在紫外分光光度490 nm波长处测定吸光度。用以下公式测定样品中多糖得率：

2.3 ?提取流程

精密称取麻蛇子粉1.000 0 g，按照料液比加入一定量的蒸馏水，调节pH值，在一定温度，时间下超声提取，提取液离心、抽滤，药渣重复提取一次，将两次所得上清液定容到容量瓶中，保存备用。

2.4 ?单因素实验的设计

2.4.1 ?超声时间对蛋白质和多糖得率的影响

以蛋白及多糖的得率为指标，精密称取麻蛇子粉1.000 0 g，在固定料液比1：20、pH=9、温度40 ℃的条件下，提取两次，将两次麻蛇子粉上清液混合在100 mL 容量瓶中，吸取少许上清液，按2.1.4和2.2.3项下的方法，分别测出麻蛇子粉中蛋白质和多糖的含量，改变超声时间，考察不同超声时间（30、40、50、60、70、80、90 min）对蛋白质和多糖得率的影响。

2.4.2 ?pH对蛋白和多糖得率的影响

以蛋白质和多糖得率为指标，精密称取麻蛇子粉1.000 g，在固定料液比1：20、超声时间50 min、温度40 ℃的条件下，提取两次，将两次麻蛇子粉上清液混合在100 mL 容量瓶中，吸取少许上清液，按2.1.4和2.2.3项下的方法，分别测出麻蛇子粉中蛋白质和多糖的含量，改变提取时的pH值，考察不同pH（7、8、9、10、11、12）对蛋白及多糖得率的影响。

2.4.3 ?料液比对蛋白和多糖得率的影响

以蛋白质和多糖为指标，精密称取麻蛇子粉1.000 0 g，在固定超声时间50 min，pH=9，温度40 ℃的条件下，提取两次，将两次麻蛇子粉上清液混合在100 mL 容量瓶中，吸取少许上清液，按2.1.4和2.2.3项下的方法，分别测出麻蛇子粉中蛋白质和多糖的含量，改变提取的料液比，考察不同料液比（1∶20、1∶30、1∶40、1∶50、1∶60、1∶70 g/mL）对蛋白质和多糖提取率的影响。

2.5 ?数据处理

实验数据用Excel进行数据处理，然后用SPSS19.0进行方差分析。

3 ?结果与分析

3.1 ?蛋白质标准曲线

牛血清蛋白标准溶液在吸光度线性范围内成良好线性关系，回归方程为：

3.2 ?多糖标准曲线

葡萄糖标准溶液在吸光度线性范围内成良好线性关系，线性回归方程：

3.3 ?单因素实验

3.3.1 ?超声时间对蛋白和多糖得率的影响

由图1可知，在30～90 min的时间段内，多糖和蛋白出现先升高后减少然后缓慢升高又减少的趋势，在30～40 min蛋白质的含量显著升高，可能是因为超声时间的延长，造成细胞的破坏，有利于蛋白质的溶出[6]。40～50 min蛋白质的含量减少可能原因是超声时间的增加，对蛋白质也起到一定的破坏作用，继而使水溶性蛋白质降低，50 min后蛋白质增长的比较缓慢。多糖先升高后减少，综合双指标和经济效益选取30， 40， 50 min进行正交实验。

3.3.2 ?pH对蛋白和多糖得率的影响

由图2可知，pH在7～13之间呈现先减少后增长的趋势，虽然pH在11～13之间显著增高，但是蛋白质在此条件下容易水解破坏，所以综合蛋白质和多糖两个因素考虑选pH=8～9进行正交工艺的优化。

3.3.3 ?料液比对蛋白质和多糖得率的影响

由图3可知，在料液比1∶20到1∶70之间多糖得率一直在减少，可能由于麻蛇子粉中的多糖含量不高，僅需少量的溶剂就可以完全溶出，在料液比1：20到1∶70之间蛋白质得率先增加后减少，可能是由于蛋白的含量比较高需要更多的溶剂才可以溶出，综合考虑，选取料液比为1∶30， 1∶40， 1∶50，进行工艺优化。

3.4 ?正交实验

3.4.1 ?正交工艺评价指标

多糖与蛋白质均为麻蛇子粉水提液中主要有效成分，两者无主次顺序，设定两者权重系数均为1。在提取工艺过程中，先分别计算出多糖和蛋白质得率，然后根据下列公式计算综合评分[7]方差表明A、B两因素对麻蛇子粉水提液中的蛋白和多糖影响不显著，C因素有极显著的影响。根据R值极差分析各因素对麻蛇子粉水提液的影响大小为料液比>pH值>超声时间，综合考虑经济和得率等因素，最佳工艺为A1B2C2，即超声时间30 min，pH为9，料液比1：40。在此工艺下进行三次平行实验，得到综合评分为1.628 131，多糖得率为0.55%，蛋白质得率为12.48%，工艺稳定性较好。

4 ?结论

回流提取和超声提取均为传统的提取方法，回流提取温度较高，蛋白质容易被破坏，超声提取温度低，效率高[8，9]。本实验通过超声水提的方法，保留了蛋白质的活性，又综合了蛋白质和多糖两个抗肿瘤的有效成分，考察了提取时间，温度，料液比对麻蛇子粉水提液中蛋白和多糖的影响，在单因素实验的基础上进行正交实验，得到在超声时间30 min，pH为9，料液比为1：40的条件下，蛋白质和多糖的提取率最高，且工艺稳定性良好，为后续抗肿瘤活性的研究提供了基础。

参考文献：

[1]长春中医学院编.吉林中草药[M].长春：吉林人民出版社，1970-06.

[2] 纪加义，赵玉清，编著.山东药用动物[M]. 济南：山东科学技术出版社，1979-08.

[3]邓明鲁.中国动物药资源[M]. 北京：中国中医药出版社，2007-08.

[4]国家药典委员会. 中华人民共和国药典，一部[M]. 北京：中国医药科技出版社， 2015： 283.

[5]毛淑敏，许家珍，周帅飞，等. 苯酚-硫酸法联合DNS 法测定金银花不同花期多糖的含量[J]. 中南药学， 2015， 13（1）： 65-67.

[6]曹广超，刘金虎，等. 超声法提取虻虫水溶性蛋白质的工艺研究[J].当代化工，2018（5）.

[7] 秦超，容蓉，杨勇等.多指标正交试验优选麻黄附子细辛汤提取工艺[J].中国实验方剂学杂志，2012，18（9）：35-39.

[8] 万水昌，王志祥，乐龙，等.超声提取技术在中药及天然产物提取中的应用[J].西北药学杂志，2008，23（1）：60-62.

[9]翟庆洲，张晓霞，杨锡厅.蛋白质分析进展[J].长春理工大学学报，2009，32（1）：165-169.

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