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标题 一种光合细菌生长特性及其修复富营养化水体参数优化研究
范文 秦宇胜+张君枝+马文林+符其实


摘要：通过选择培养基从北京城市河道水体中分离富集光合细菌。然后，采用单因素实验观测其细菌生长曲线，得出其生长周期为4 d，培养过程中培养液pH总体趋势上呈现出相对升高的变化态势；对不同初始总氮（TN）水平下的降解曲线进行拟合，得出不同初始浓度的降解动力学方程，其中总氮初始浓度为20 mg/L的体系去除率最高。最后，采用正交实验方法研究得出对光合细菌去除氮、磷效果影响程度由大到小的因子排序为温度、pH、光合细菌添加量。在最优条件下，本实验所分离光合细菌对培养体系中总氮（TN）和总磷（TP）浓度的去除率分别为61.28%和41.21%。实验证明所分离出的光合细菌对控制水体TN和TP具有显著成效，本研究得出的参数优化结果可为进一步开发城市富营养化水体治理修复剂提供一定的理论和实践依据。
关键词：光合细菌；生长特性；富营养化水体；修复；参数优化
中图分类号：X171文献标志码：A文章编号：
1672-1683（2015）001-0037-05
Growth characteristics and parameter optimization to control water eutrophication of a photosynthetic strain
QIN Yu-sheng1，2，ZHANG Jun-zhi1，2，MA Wen-lin1，2，FU Qi-shi1，2
（1.Beijing Climate Change Response Research and Education Center，Beijing University of Civil Engineering and Architecture，Beijing 100044，China；2.Key Laboratory of Urban Stormwater System and Water Environment ，Beijing University of Civil Engineering and Architecture，Ministry of Education，Beijing 100044，China）
Abstract：At present，eutrophication problems of water body is becoming more and more serious in China.Firstly，the photosynthetic bacteria were separated and enriched from river water in Beijing City by selective culture medium.Secondly，their growth curves were determined using the single factor experiment.It was concluded that their growth cycle was 4 days，and the pH of the cultivation liquids were up during cultivating period.The degradation curves under the different initial total nitrogen （TN） levels were fitted，by which degradation kinetics equation to different initial concentration was obtained.There was the highest TN removal rate at 20 mg/L of initial TN concentration.Finally，the factors order from stronger effect to weaker to remove TN and TP by photosynthetic bacteria were temperature，pH and photosynthetic bacteria adding amount using orthogonal experimental method.Under the optimal culturing conditions，the removal rates of TN and TP were 61.28% and 41.21%，respectively.So，it was effective to control TN and TP concentrations in water body by the photosynthetic bacteria isolated in this Experiments.The experimental results could provide a help to develop microorganism remediation agent to control eutrophication in city water body.
Key words：photosynthetic strain；growth characteristics；water eutrophication；bioremediation；parameter optimization
随着社会经济的飞速发展，工农业和城市废水剧增，导致受纳水体的富营养化程度呈加重趋势[1]。水体富营养化引起藻类等水生植物大量繁殖，水体透明度和溶解氧下降，水质恶化，最终爆发水华，导致除藻类以外的其他水生生物大量死亡，水体生态系统及其功能受到严重阻碍和破坏[2]。
目前对水华现象的治理方法较多，但各有利弊。物理方法工程量大、耗能高且不彻底[3]。投加化学药剂短期效果明显，但容易发生水质反弹并造成水体二次污染，会对水体的整体生态环境造成一定的不良影响[4]。微生物可以利用水体中的营养物质进行自我代谢，既达到了去除污染的目的，又能让生态系统更加稳定，治理效果可持续，所以利用微生物方法进行水污染治理是比较理想的方法[5]。但不同种类微生物对各类物质的代谢和利用能力相差较大，所以应从环境中选取环境友好且治污能力强的微生物进行研究。
光合细菌均为革兰氏阴性细菌，无芽孢，其形态和生理类型具有多样性，广泛存在于自然界的水体、土壤及活性污泥内。光合细菌在厌氧光照、好氧光照或好氧黑暗的条件下都能利用有机酸、硝酸盐、氨氮、活性磷酸盐及糖类等小分子有机物进行营养生长和生殖生长，使水体得以净化。光合细菌处理废水具有有机负荷高、脱氮除磷效果好等特点，已被广泛用于各种食品、工业废水和水产养殖的净化处理研究和实践中[6]。近年来，国内外学者研究发现，光合细菌不仅能够降解简单的有机化合物，而且对环境中较难降解的卤代化合物和芳香化合物也有一定的降解能力[7]，应用前景广阔。
研究表明，光合细菌在水产业、农业、畜牧业、废水处理、新能源开发等应用领域具有十分广阔的前景。20世纪70年代，日本开始发展光合细菌，多年来先后成功地对粪尿、皮革、食品、淀粉和豆制品加工废水进行处理[8]。韩国也有污水处理厂使用光合细菌处理生活污水的先例。我国在20世纪开始研究光合细菌治理养殖废水等方面的应用，刘慧玲[9]等利用光合细菌来降解养殖水体中的亚硝酸盐，效果良好。
近年来，光合细菌开始被用于治理富营养化水体。常会庆[10]对光合细菌的生长、光合细菌在自然水体对水中总氮、总磷、COD等指标的影响、培养基优化等方面做了一定的研究。但是在治理水体富营养化的作用机理方面的研究还不够透彻，环境条件对其治理富营养水体方面影响程度也有待探索。所以光合细菌作用机理方向上的研究对解决日益严重的水体富营养化问题提供了一条生物治理的道路，具有一定的指导作用。
本研究中，首先将北京城市河道水取回实验室，从中分离富集光合细菌。然后，采用单因素实验方法，以河道天然水作为基础培养液，研究所分离光合细菌的脱氮除磷能力。最后，采用正交实验方法，研究优化光合细菌用于治理富营养化水体的参数条件，为其在实际应用中提供理论依据。
1实验设计
1.1培养基与实验用水
本研究中采用的光合细菌选择培养基的配方为：NaCl 2 g， CH3COONa·3H2O 5 g， NH4Cl 1 g， NaHCO3 2 g，KH2PO4 1.75 g，MgSo4·7H2O 0.2 g，酵母粉 1 g，1000 mL蒸馏水，使用浓度为0.1 mol/L的稀盐酸调pH到7.0。各类化学药品均为分析纯。
取北京城市河道水作为实验用水，其水质指标为：pH为8.0～8.5、TN为5.87 mg/L，TP为2.77 mg/L。TN、TP均超过我国湖泊富营养化标准[11]。
1.2实验设计
1.2.1菌种的分离富集和鉴定方法
取5 mL河道水加入装有30 mL灭菌液体培养基的磨口试管中，塞紧瓶塞，放入光照培养箱中，培养条件为温度25 ℃、光照强度2 500 Lx。待培养液变为红色后，取1 mL菌液转接到新鲜培养液中，连续转接3次，分离得到光合细菌混合菌液。使用前对该菌液进行稀释，并测定稀释液在660 nm波长下的吸光度。如果吸光度超过1.5，表明其中细菌活体数达到3.0×1010mL以上，可以用于实验。
菌种鉴定按照《伯杰细菌鉴定手册（第8版）》的常规观察方法来鉴定。
1.2.2单因素实验
利用单因素实验方法研究菌剂投加量、初始pH和TN条件对光合细菌生长曲线、培养液TN浓度、TP浓度、和pH值变化趋势的影响。
实验中保持培养温度、光照强度和培养液初始TP浓度恒定，分别为25 ℃、2 000 Lx和约2.5 mg/L，其它实验条件见表1。
表1单因素试验条件
实验目的
实验条件
pHTN/（mg·L-1）菌剂投加量（%）
菌剂投加量对光合菌生长曲线和培养液TP浓度变化的影响7.05
0.1
0.2
0.3
初始pH条件对培养液pH变化的影响6.5
7.0
7.550.2
初始TN条件对培养液TN浓度变化的影响7.05
10
200.2
1.2.3正交实验
利用正交实验方法，固定光照强度为2 000 Lx，研究温度、pH值、菌液添加量等三个因素对光合细菌修复营养化水质的影响情况，正交实验条件见表2。
表2正交实验设计表
水平温度（℃）pH值菌液添加量（%）
1206.50.1
2207.00.2
3207.50.5
4256.50.2
5257.00.5
6257.50.1
7306.50.5
8307.00.1
9307.50.2
1.3实验步骤
将300 mL富营养化城市河道水装入500 mL锥形瓶中，使用0.1 mol/L的HCl溶液调节pH至设计水平，然后在瓶口覆盖透气孔膜，放入高压灭菌锅中灭菌30 min。取出自然冷却后，向锥形瓶中按照设计比例添加菌剂，放入光照培养箱中，在设计温度和光照条件下连续培养7 d。每个实验条件做3个平行，每24 h从各个锥形瓶中取少量水样，根据实验需要分别测定菌体生长量、总氮、总磷、pH和OD等指标。
2实验结果与分析
2.1菌种的分离和富集
在温度25 ℃、光照强度2 500 Lx的光照培养箱中进行富集培养7 d后，菌液呈现棕红色，经3次转接和纯化，得到图1所示的菌液。使用显微镜，对所分离细菌进行观测，得到如图2所示的图像。显微镜下菌体呈现卵形，厌氧液体培养物最初呈现淡粉色，随后出现深棕色，好氧情况下呈现无色或淡粉色。通过《伯杰细菌鉴定手册（第8版）》[12]初步鉴定，该细菌属于红假单胞菌属。
图1光合细菌的分离纯化
图2光合细菌显微镜观测图
2.2细菌生长曲线
不同菌剂投加量下光合细菌的生长曲线见图3。
图3光合细菌生长曲线
通过观察图3所示的生长曲线，可以得出该菌的生长周期为4 d，且添加量对菌的生长周期有影响。当添加量为01%时，第6天菌的生长达到最高浓度，相应的吸光值DO660为0.014 3；当添加量为0.2%和0.5%时，在9 d的培养期内，可以发现，菌的生长周期都为4 d，在第一个生长周期内，分别在第3天和第2天达到菌的最高生长浓度，相应的吸光值为0.019 7和0.022 7。由此得出，菌的添加量越高，达到最大菌量的培养期越短，实现的最大菌量浓度也越高。
对于添加量少导致生长周期延长或不明显的原因，目前尚无定论。有一种观点认为，细胞在开始分裂增殖前需要达到最低临界起始密度，即细胞内一种称为条件因子的物质需要达到一定的内源水平，细胞分裂才能启动[13]。在培养基营养全面丰富，且细胞接种密度相对较高的条件下，条件因子较易与周围环境实现动态平衡，达到细胞分裂所需的内源水平，使细胞数量增长迅速[14]。从图3可以看到，随着接种量的增大，迟缓期呈现相应缩短的趋势。可见，细胞密度确实对分裂启动存在一定的影响。
对于菌剂添加量为0.2%和0.5%的情况，微生物生长曲线在第5天时候完成一次生长，之后一出现二次生长。对这种现象的解释是，细菌生长过程中可利用多种底物，当多种底物共存时，速效的底物往往先被代谢掉，接着细菌会进一步利用相对难降解的底物。细菌对难降解底物的利用有一个适应和驯化的过程，这种现象往往会导致二次生长或多次生长。对于0.2%和0.5%的菌剂添加量，细菌在还没有适应难降解底物前，就将容易利用的底物已经消耗殆尽，细菌因缺乏营养生物量开始出现下降。之后，随着对难降解底物的适应，出现了第二次生长。而对于0.1%的菌剂添加量，在细菌适应培养基中难降解底物之前，其中容易被降解的底物还没有被完全消耗掉，因而细菌对两种或多种底物的利用同时发生，不存在清晰的时间段区分，表现为细菌的生长经历一个连续的变化，没有显著的第二生长期出现，对数生长阶段也不明显。
2.3pH变化
实验水样的初始pH值分别为6.5、7.0和7.5。在25 ℃、2 000 Lx和0.2%投菌量条件下，各水样培养过程中的pH变化情况见图4。
根据图4的曲线可以看出，培养期间，各培养体系的pH值均有不同程度的上升。比较不同初始pH条件下各个培养体系的pH变化情况，初始pH为7.0、7.5两种情况下最大pH都达到了8.4，然后回落到7.8；而初始pH为6.5的培养体系，pH持续升高，最终稳定在7.8。因此，整个培养阶段，初始pH条件对培养体系最终的pH值影响不显著，而是趋于基本接近的pH值。
关于光合菌培养过程中pH升高的机理有两种，一是光合细菌生长过程中会产生碱性物质[15]，二是光合菌生长过程中利用了酸性物质，而使碱性物质残留所致[16]，具体情况因光合细菌种类不同而异。
图4pH变化
2.4总氮变化
各培养体系的初始总氮浓度分别处于不同水平，图5为各个培养液中TN随培养时间的变化情况。添加菌液后，初期呈现下降趋势，后期随着培养液中营养缺失，菌体发生自溶，总氮水平略有升高。
图5TN的变化
从图5的曲线可看出，各培养体系中总氮浓度均有下降，起始浓度为20.13 mg/L的情况下，总氮在第5天下降至最低，第6天开始升高，第7至第8天趋于稳定，总氮降低了71%。起始浓度为9.38 mg/L和5.87 mg/L的情况下，总氮也有不同程度的下降，且最低值点均出现在第6天，而后略有上升，以至趋于稳定，总氮均降低了50%左右。说明高浓度下，光合细菌降解效果较好。
在废水生物处理工程中，人们常用米式方程来描述微生物反应动力学，其表达式为：Vx=Vmax·cKs+c。式中：Vx为任意时刻的底物降解速度；c为底物浓度；Vmax为最大底物降解速度；Ks为饱和常数，又称半速度常数；Vmax和Ks均为动力学系数。根据米式方程，可得出底物降解速度与底物浓度之间的关系式，当c<lnc=k1·t+c，转化为c=ek1·t+c。式中：c为底物浓度；k1为一级降解动力学降解速度常数；t为降解时间；e为常数[17]。
在培养末期，因营养缺乏，细菌死亡，菌体破裂，胞内含氮物质向培养水中释放，造成培养体系的总氮含量出现升高现象。本论文仅对光合细菌正常生长期间，即曲线出现回升之前的过程进行拟合，也即对第一个生长周期过程中培养体系TN变化情况进行拟合。根据上述数据，对三种初始TN条件下培养体系的TN变化曲线分别进行拟合，得到降解动力学方程式见表3。三种条件下的拟合方程的相关系数都较高，表明本实验中培养体系的TN利用过程都符合一级降解动力学方程，反推得出其TN浓度相对于光合细菌的氮饱和常数，不足其1%，即本实验分离得到的光合细菌具有很高的氮饱和常数，适宜于修复高含氮的富营养化水质。
表3TN降解动力学方程
总氮初始浓度/（mg·L-1）一阶动力学方程拟合曲线R2
20.13
9.38
5.87y=32.239e-0.328x
y=11.05e-0.177x
y=7.2002e-0.219x0.946
0.9981
0.9499
2.5水质修复条件优化
设计正交实验，实验条件见表2，研究利用光合细菌控制水中TN和TP浓度的最优化实验条件。
随便看

　

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更新时间：2025/2/11 4:26:45