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基于网络药理学的连翘治疗肾小球肾炎潜在靶点的研究

范文

陈璟聂锐单鑫陈静汪洁吕志阳

摘要：基于网络药理学方法研究连翘治疗肾小球肾炎潜在靶点。采用中药系统药理学数据库及技术平台（TCMSP）按照口服生物利用度（OB）≥30%和类药性（DL）≥0.18筛选出连翘的活性成分及其作用靶点，通过Uniprot数据库找出官方基因名称。利用Genecards数据库检索与肾小球肾炎相关的靶点基因。将活性成分所对应的基因靶点与肾小球肾炎相关靶点基因交集，获得两者的共同基因即为连翘治疗肾小球肾炎的关键靶点。用Cytoscape软件构建中药-活性成分-关键靶点网络。将关键靶点导入String数据库获得蛋白质互作关系，结果导入Cytoscape软件进行可视化。利用DAVID数据库及ClueGo插件对关键作用靶点进行GO注释分析和KEGG通路分析，进而探究连翘治疗肾小球肾炎的生物过程及作用通路。筛选得到连翘24个活性成分及478个潜在作用靶点，其中与肾小球肾炎重复的有217个关键靶点。通过网络药理学预测连翘防治肾小球肾炎的关键靶点及其相关信号通路，推测该方剂对肾小球肾炎的潜在作用机制，为阐明中药治疗肾小球肾炎提供了科学依据。

关键词：连翘；肾小球肾炎；网络药理学；关键靶点

基金项目：国家自然科学基金（81073111，81374029，81874359）；江蘇省自然科学基金（BK20161371）；江苏省高校自然基金（18KJB36011）；江苏省高校自然科学研究面上项目（18KJB310012）；2019江苏省中医药管理局项目（YB201997）

肾小球肾炎（acute glomerulonephritis，AGN）在临床上为常见疾病之一，多数因为链球菌和其他细菌感染，其临床表现为水肿、高血压、血尿、蛋白尿。西医一般会采用抗菌、抗感染、抗过敏等治疗措施[1]，但是这些药物会对肾脏造成巨大的毒副作用。在现代医学看来，AGN的发病机制比较复杂，治疗需要结合临床单方验方及中成药，临床效果显著。目前临床在治疗AGN时，主要采用攻补兼施的治法，虚多于实，则先补后攻。

在中医的认知中，AGN属于“水肿”等阳水范畴，其发病机制与外邪侵袭密切相关，致使肺、脾、肾三脏功能严重失调，水液代谢出现异常[2]。《医宗金鉴》所说：“风水得之，内有水气，外感风邪；皮水得之，内有水气，皮受湿邪。”明代戴思恭《证治要诀》曰：“有患实多于虚，则先攻后补。生疮，用于疮药太早，致遍身肿。因此，治疗AGN需要将利水除湿、祛风清热作为治疗原则[3]。连翘可以疏散风热，清热解毒，可以治疗AGN所导致的热毒。但是在一般研究中，都是将连翘用于麻黄连翘赤小豆汤作为整体治疗AGN。本研究将单独探索连翘治疗AGN的潜在作用机制。

中药的成分相当复杂，以往的研究模式很难说清其潜在作用机制。因而运用网络药理学研究方式解析中药及其复方中单一组分的分子作用机制。本研究以连翘为切入点，通过网络药理学的方法筛选连翘的活性成分及作用靶点，检索已知的AGN相关靶点，利用用于注释、可视化和集成发现的数据库（the Database for Annotation，Visualization and Integrated Discovery，DAVID）及ClueGo分析探究连翘治疗AGN的潜在作用机制，为临床治疗AGN提供新思路。

1 材料与方法

1.1 连翘活性成分的筛选

采用中药系统药理学数据库及技术平台（Traditional Chinese Medicine Systems Pharmacology Database And Analysis Platform，TCMSP）筛选出已知的连翘活性成分。可以选择具有良好类药性和毒药物动力学的吸收、分布、代谢和排泄（Absorption-Distribution-MetabolismExcretion，ADME）特征的化合物用于进一步研究。连翘在临床上一般用作汤剂，便于口服。按照口服生物利用度（Oral bioavailability，OB）≥30%和类药性（Drug-Like，DL）≥0.18进行筛选得出连翘有效活性成分，记录备用。

1.2 构建有效活性成分-作用靶点

经过TCMSP所得到的有效成分及其相关靶点，通过Uniprot数据库找出相应的官方基因名称，筛选出人类的基因靶点名称，将数据导入Excel中，就得到了连翘有效成分—基因靶点。之后，利用Cytoscape 3.7.0软件构建“药物活性成分-基因靶点”网络图，其中药物的活性成分与其作用的靶点会形成一个节点，而药物活性成分与其相应靶点的连线则为节点的度值（Degree）。

1.3 AGN疾病靶点的收集

采用GeneCards数据库收集AGN的疾病靶点，将数据收集到Excel中。

1.4 关键靶点的GO注释及KEGG通路福集

采用DAVID数据库对关键作用靶点进行GO注释分析，将筛选条件设置为细胞的组成（cellular component）、分子的功能（molecular function）和生物的过程（biological process）3个筛选条件，点击“Functional Annotation Table”，得到GO注释结果。利用 Cytoscape 3.7.0 软件中的ClueGo插件对关键作用靶点进行京都基因与基因组百科全书（Kyoto Encyclopedia of Genesand Genomes，KEGG）通路分析，将关键作用靶点输入到“GENES”一栏，选择物种为人类，再设定P<0.05，选择KEGG通路，最后点击“start”开始分析，得到连翘对治疗AGN的潜在作用通路。

2 结果

2.1 连翘-有效成分-靶点

通过TMCSP数据库收集24个有效成分及其516个基因靶点，最后得到477个有效基因靶点。用Cytoscape 3.7.0软件进行可视化构建“活性成分-作用靶点”网络图（见图1）。其中按度值排名前10的有PTGS2、SCN5A、ADRB2、NCOA2、PTGS1、CALM、F10、KCNH2、HSP90、PPARG，这些靶点是连翘发挥作用的中药靶点。

2.2 关键靶点的生物功能预测及作用通路分析

对关键靶点基因进行GO富集分析，通过ClueGo插件对关键靶点进行分析。网络中的关键靶点通过调控DNA重组，调节苏氨酸激酶活性，激活MAPK活性，使其在血管生成、血管发育、核心启动特异性DNA结合的环节发挥作用。

采用Cytoscape中的插件ClueGO来对关键靶点进行通路富集分析。关键靶点主要集中在白细胞介素17（IL-17）信号通路、Cancer信号通路、Tuberculosis信号通路、Toll-like receptor等信号通路。

3 讨论

AGN的发病率逐年上升，现代分子学研究表明，不同信号通路及其相关蛋白、基因参与调控该疾病的发生与发展，相互作用机制复杂，单纯通过使用“点对点”的药物干预方式，很难改善AGN，临床效果较差。所以本研究将目光转移到传统的中药复方上。

通过网络药理学方法对连翘进行研究，最终找到了24个活性成分，预测了478个潜在靶点。在“活性成分-靶点”网络图中quercetin（槲皮素）、kaempferol（山奈酚）等活性成分可作用于多个靶点，槲皮素的活性较强，具有很好的抗炎作用，有效缓解AGN的发生发展。在对靶点的预测过程中，发现PTGS2、SCN5A等靶点可作用于多个活性成分，这体现了中药多成分协同作用的特点。通过GeneCards平台收集AGN相关靶点基因，与活性成分作用靶点取交集后最终获得217个关键靶点基因。其中NOS2、CDK2、BAX、NF-kB、EGF、PTGS1、PIK3CG、KDR、PCNA、ELK1这10个关键靶点在治疗疾病方面具有重要的作用。这些发现不仅加深了研究人员对疾病发病机制的认识，还为治疗这种疾病提供了新的策略。

在GO富集分析结果中，发现预测的关键靶点主要通过调控DNA重组，调节苏氨酸激酶活性，激活MAPK活性，使其在血管生成、血管发育、核心启动特异性DNA结合的环节发挥作用。在KEGG通路分析结果中，发现预测的关键靶点主要集中作用在白细胞介素17（IL-17）、Cancer、Tuberculosis、Toll-like receptor等信号通路。这些通路主要在氧化应激、炎症等方面具有良好的作用，并且上述通路与目前相关研究结果具有一致性，证明本研究预测出的结果具有可靠性，主要表现在：（1）白细胞介素17（IL-17）信号通路：IL-17介导了一些炎性疾病，IL-17在肾脏中免疫复合物沉积后促进AGN。（2）Toll样受体信号通路：抑制Toll样受体信号传导，这可能导致先天免疫反应的损伤，是导致AGN的重要因素之一。

4 结语

通过网络药理学，预测连翘防治AGN的关键靶点及其相关信号通路，推测该药对疾病的潜在作用机制，可能主要参与抗炎、调节免疫及氧化应激等过程，为阐明中药治疗AGN的作用機制提供了科学依据。

[参考文献]

[1] 刘阳.麻黄连翘赤小豆汤加减治疗肾小球肾炎的临床观察[J].中国处方药，2016（8）：99-100.

[2] 张新莲.麻黄连翘赤小豆汤合当归饮子加减治疗慢性荨麻疹疗效观察[J].实用中医药杂志，2017（6）：628-629.

[3] 王敏，李树君.麻黄连翘赤小豆汤治疗荨麻疹临床体会[J].实用中医药杂志，2016（11）：1136-1137.

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