| 标题 | 二代测序在法医遗传学实践问题中的应用 |
| 范文 | 褚旭峰 黄桂炀 熊博 摘 要 现阶段在法医实践工作中，传统的手段虽然已能满足大部分鉴定的需要，但在处理某些特殊问题时依旧存在着局限性。对比传统基于PCR-CE（capillary electrophoresis，毛细管电泳）的鉴定技术，二代测序技术具有高测序深度、高并行性以及高准确性的特点，能够更充分地挖掘有效的遗传信息以提高个案效能，同时为遗传标记的筛选提供了高效的途径。本文的主要目的在于探讨二代测序技术在法医遗传学几个主要实践问题中的应用，为从事相关领域研究的技术人员提供参考。 关键词 法医 遗传学 二代测序 作者简介：褚旭峰、黄桂炀、熊博，华中科技大学同济医学院法医学系。 中图分类号：D919 ???????????????????????????????????????????????????????????文献标识码：A ???????????? ???????????DOI：10.19387/j.cnki.1009-0592.2019.03.167 隨着生物技术的发展，各种新的技术成果被引入到法医领域中，使得法医学的鉴定手段实现了从宏观到微观的跃迁。而衡量一个新技术是否适用于法医实践的标准在于其能否为法医鉴定中的实际问题提供新视角，新思路。 近十年，二代测序技术发展迅速 ，各类测序方法和平台历经多次改良更新，现技术已趋于稳定，被引入各类领域。在法医遗传学实践中，测序是一种检测遗传物质序列信息的方法，过去的主要手段是Sanger测序。二代测序技术相较于Sanger测序，测序深度高，并行性强，且能保证较高的准确率。二代测序技术对比传统的基于PCR-CE的检测长度多态性的鉴定技术，能够从有限的生物检材中挖掘出更多的遗传学信息。这也是二代测序技术被研究者用于解决法医遗传学实践问题的主要原因。 一、混合样本鉴定 混合样本即包含两名或两名以上个体的混合生物检材。可分为混合样本中某种低含量组分的遗传信息分析，以及混合样本中各组分遗传信息的分析。在涉及多个犯罪人员的群体强奸案件和杀人案件中，确定犯罪者个人遗传信息能够为案件的侦破提供线索。 针对混合样本鉴定，使用传统的基于PCR-CE的STR分型技术存在优势扩增的缺陷，易丢失次要成分信息。二代测序技术高测序深度，结果可数字化呈现的特点，能有效地提高分析的灵敏度以及结论的可读性。目前研究人员使用二代测序技术对STR，SNP以及线粒体DNA（mitochondrial DNA，mtDNA）等多种遗传学标记进行检验，均已能将混合样本分型的灵敏度从传统方法的1：10提高到1：100的水平 。混合样本中各成分在某一位点上分型结果不同时，更有力于混合样本组分的区分，这需要位点更高的多态性。二代测序技术在检测较长片段的重复序列时可能存在测序错误，但检测获得的位点的序列多态性信息能为传统STR长度多态性的补充，有效提高位点的多态性，为混合样本的分析提供了助力 。 二、降解检材鉴定 高度腐败和降解检材的检验一直是法医实践工作中的挑战，由于检材的高度腐败和降解，可用的生物学信息很少，可供扩增的片段含量很低。常规的STR分型试剂盒有时无法完全分析高度降解的法医DNA样本。 对于这些检材，降解造成了片段的断裂，使得部分引物无法与模板结合并扩增出目标片段。研究者们比较二代测序技术与PCR-CE，发现后者检测STR位点检出率更高。与此同时，二代测序可用于筛选更适用于降解检材的遗传标记位点。Dong等 根据与核小体紧密结合的DNA不易降解的特点，通过二代测序技术筛选出四个与传统STR基因座匹配且适用于降解检材的位点。mtDNA是一种在降解检材中表现良好的遗传标记，二代测序能检测包括控制区域（HVS I和HVS II）在内的全线粒体基因组的变异位点 。Templeton 等 利用靶向捕获的二代测序技术成功还原了二战士兵骨骼中提取的mtDNA信息。另一种遗传标记SNP位点的检测，对片段长度的依赖较小，但其多态性较差，需要大量检测才能达到鉴定要求。二代测序可一次检测远高于鉴定需要的SNP位点数目，保证了获得的有效的遗传信息足够完成鉴定。 三、无创产前亲子鉴定 为了解决某些需要在孕妇孕期鉴定肚中胎儿与嫌疑人父子关系的特殊强奸案件或民事纠纷，产前亲子鉴定被提出。孕妇产前亲子鉴定在过去通常采用侵入性方法，对胎儿和孕妇产生不必要的风险。1997年Lo等在孕妇外周血中发现胎儿游离DNA，但其含量低且受到母源游离DNA的干扰，难以用常规方法完成鉴定。孕妇外周血中的胎儿游离DNA，片段长度多在143bp附近，且与母源游离DNA构成了混合物，兼具了上述两类问题的难点。 二代测序技术可通过提高测序深度直接检测胎儿与母亲基因型不同的位点，并通过设定阈值从中直接读取胎儿游离DNA的位点信息。Qu等，Jiang等分别通过二代测序技术成功在34个和17个真实家庭样本中使用母体血浆样品完成亲子鉴定，且后者对有效SNP数，测序深度以及胎儿分数这三个影响因素进行了系统评估。基于二代测序技术的产前亲子鉴定目前依旧缺乏广泛认可的标准，成本也居高，但其可行性和研究前景不可置否。 四、个体表型特征刻画 个体表型特征刻画即通过各种遗传学标记来还原个体的肤色，面部容貌，发色和身高等可见特征，从而缩小犯罪嫌疑人的侦查范围或还原严重受损尸体的生前特征。目前对肤色，发色以及眼睛颜色的检测体系已经较为成熟。身高预测的精度也在不断增加，Liu等通过180个身高相关SNP位点的检测，利用加权等位基因求和（weighted allele sums，WAS）算法对欧洲极高个体进行定性预测，其预测准确性AUC值达到0.75。 与身高，肤色，发色等相比，面部容貌特征更具有個体区分度，是个体表型特征刻画的重要任务。Guo等开发了一种3D面部成像技术，使得面部容貌可进行数字化描述。在此基础上Claes等建立了一种3D面部重建技术：通过性别和祖先基因信息创建基础面型，后根据24个容貌相关SNP位点信息创建预测面型，并通过两种面型的差异生成个性面型，最终将个性面型与预测面型叠加获得最终的预测面型。目前面部容貌的刻画尚在研究阶段，研究者们从全基因组关联分析（Genome-wide association study，GWAS）的数据中筛选出了一批与面部容貌相关的SNP位点，并以此结合机器学习算法，建立了容貌预测的模型。其精确度有待更多与表型相关的遗传标记加以提升。二代测序为相关位点的筛选，人群中的验证提供了技术支持。这是以往法医遗传学研究手段很难实现的，二代测序在此应用的前景是可观的。 五、总结与展望 本文主要回顾了二代测序技术在法医遗传学几个实践问题中的应用，并分析比较新旧方法各自的优缺点，以便研究人员参考。相信在未来二代测序技术的成本将进一步下降，并有望成为常规的实验检测项目，这会使法医遗传学领域的研究模式发生改变。从科研的角度出发：随着二代测序技术的推广，实验室用于获取遗传信息的成本降低了，实验便可基于更多的样本数据展开;从相关数据库建立的角度来看：二代测序技术的出现会使研究过程产生大量的遗传学数据。各种法医相关数据库得以建立并日益完善。日后研究人员的研究成果得以在最短的时间内被其他人获悉，这加速了各种鉴定体系的成熟完善。 注释： van DIJK E L， AUGER H， JASZCZYSZYN Y， et al. Ten years of next-generation sequencing technology. Trends Genet， 2014，30（9）.418-426. ZHANG S， BIAN Y， ZHANG Z， et al. Parallel Analysis of 124 Universal SNPs for Human Identification by Targeted Semiconductor Sequencing. Sci Rep-Uk， 2016，5（1）. HWA H， CHUNG W， CHEN P， et al. A 1204-single nucleotide polymorphism and insertion–deletion polymorphism panel for massively parallel sequencing analysis of DNA mixtures. Forensic Science International： Genetics， 2018，32.94-101. KIM H， ERLICH H A， CALLOWAY C D. Analysis of mixtures using next generation sequencing of mitochondrial DNA hypervariable regions. Croat Med J， 2015，56（3）.208-217. GETTINGS K B， KIESLER K M， FAITH S A， et al. Sequence variation of 22 autosomal STR loci detected by next generation sequencing. Forensic Science International： Genetics， 2016，21.15-21. DONG C， YANG Y， LI S， et al. Whole genome nucleosome sequencing identifies novel types of forensic markers in degraded DNA samples. Sci Rep-Uk， 2016，6（1）. STROBL C， EDUARDOFF M， BUS M M， et al. Evaluation of the precision ID whole MtDNA genome panel for forensic analyses. Forensic Science International： Genetics， 2018，35.21-25. TEMPLETON J E， BROTHERTON P M， LLAMAS B， et al. DNA capture and next-generation sequencing can recover whole mitochondrial genomes from highly degraded samples for human identification. Investig Genet， 2013，4（1）.26. 参考文献： [1]BOSE N， CARLBERG K， SENSABAUGH G， et al. Target capture enrichment of nuclear SNP markers for massively parallel sequencing of degraded and mixed samples. Forensic Science International： Genetics， 2018，34.186-196. |
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