| 标题 | 蘑菇种植中污染菌产黄青霉的拮抗菌筛选及中药和多菌灵对其抑制作用的研究 |
| 范文 | 王艺璇 吴文杰 戴斯婷 摘 要：本实验为减少蘑菇种植中产黄青霉的污染，进行了从土壤中分离纯化出了产黄青霉的拮抗菌，及中药黄柏、苦参及多菌灵和中药正交对污染菌的抑制作用等实验。从而需找一种生物防治或中药和农药结合防治的环保方法，以此来解决农药对环境造成的污染及食用菌上的农药残留问题。实验结果表明，中药与多菌灵结合使用，比中药单独使用对产黄青霉的抑制效果更明显。其中，黄柏与多菌灵的最佳组合浓度是黄柏浓度为0.25g/mL，多菌灵浓度为0.1%。苦参与多菌灵的最佳组合浓度是苦参浓度为0.016g/mL，多菌灵浓度为0.1%。土壤中通过直接堆砌法分离出的接抗菌经镜检，可以初步确定是属于根霉属。 关键词：蘑菇；产黄青霉；中药；拮抗菌；抑制 蘑菇，是人们较为熟知一种食用菌。各地的叫法都不同，统称为蘑菇。蘑菇富含18种氨基酸和多种维生素，矿物质、蛋白质、无机质等营养成分。具有益气开胃，拖痘疹，抗癌及降血糖等作用。蘑菇是冬季种植的食用菌[1]，蘑菇还是有一定的经济价值及营养食用价值。但在种植食用菌的时候，其最大的敌人是杂菌污染，轻则减产，重则绝收，会给菇农造成不小的经济损失。其中，产黄青霉的污染是在众多污染中比较严重的杂菌污染。一般菇农采取的措施都是喷洒农药，虽能使污染得到有效的处理，但往往都会造成农药残留，直接影响到质量。随着人们环保意识的增加，还有对农药负面影响的了解，既能达到高效杀死作物污染菌又能维护生态平衡以得到安全优质的农产品称为人们关注的焦点[3][4]。寻求中药或中药与农药相结合，通过减少农药含量来减少对环境的污染是本研究的目的。 1 材料与仪器 1.1 材料与试剂 广东省微生物菌种保藏中心购买的产黄青霉真空冷冻干燥菌种；白蘑菇；泉州市区中药店购买的黄柏、苦参；有效成分为50%的可湿性粉剂多菌灵；PDA培养基、牛肉膏蛋白胨培养基、高氏一号培养基，实验室自备；碱性品红、美蓝晶体，氢氧化钾等，购于泉州化学药品店。 1.2 仪器 培养基制备需要的各种玻璃器材[5]，移液枪，水浴锅（数显恒温水浴锅 HH-6国华企业），恒温箱（生化培养箱SPX-25OB-Z，上海博讯实业有限公司医疗设备厂），高压蒸汽灭菌锅（YXQ-LS-30 SII立式压力蒸汽灭菌器），恒温振荡器（国华企业SHA-B），无菌台（SW-CJ-IF洁净工作台）等。 2 实验方法与结果 2.1 产黄青霉真空冷冻干燥菌种的菌种活化 菌株恢复培养：用无菌的移液枪吸取适宜无菌水滴入安瓿瓶管内，轻轻震荡，使冻干菌体溶解呈悬浮状。后吸取该菌液滴加在已无菌PDA平板上，涂布，在28℃的恒温箱中培养，获得纯种产黄青霉[6]。 2.2 拮抗菌的筛选及鉴别 土壤分离微生物：選取土样，然后参考《现代食品微生物学实验技术》中的土壤微生物分离、纯化的实验方法，获得各种微生物[5]。 拮抗实验：采用直接堆砌法观察抑菌圈的大小进行筛选：获得纯种产黄青霉后挑取单个菌落于液体培养基进行恒温振荡培养，24h后分别稀释成10倍、100倍、1000倍制成不同稀释倍数的菌悬液，再用移液枪分别吸取产黄青霉的菌悬液100μL均匀涂布在PDA平板上，依次挑取从土壤中分离、纯化的单个菌落放入已经涂布了产黄青霉的PDA平板中，在适宜的温度下培养。观察有无拮抗现象，有无抑菌圈，来筛选出拮抗菌[7]。因实验器材有限，且分离、纯化的微生物种类又多，所以最初筛选时，每种从土壤中分离出的菌落做一个平板，有疑似拮抗效果的在做3个重复。 鉴别：通过形态的观察[7]以及镜检，确定拮抗菌所在的属，进行初步确定。 2.3 中药浓度的确定及制备 中药的熬煮：称取100g中药（黄柏/苦参），加适量蒸馏水浸泡30min，用大火煮沸，在小火保持微沸30min，过滤，滤液备用。药渣再加适量蒸馏水煎煮30min，滤过，将两次的滤液合并，用水浴锅浓缩至100mL，此时的中药生药量为1g/mL[8]。 浓度的稀释：取10支无菌试管，依次编号，分别在2～10号管中加无菌蒸馏水10mL。取1g/mL的中药原液20mL于1号管中，从1号管中取10mL于2号管中，混匀，再从2号管中取出10mL稀释液加到3号管中混匀。照此方法稀释至第9号管，取出10mL弃掉。第10号管只有无菌蒸馏水做空白对照[8]。 2.4 中药对蘑菇菌丝生长的影响 蘑菇菌悬液的制备：将购买于市场上的白蘑菇，用酒精将表面清洗干净后，用灭菌的镊子将蘑菇的子实体剪碎成细小块，泡在无菌蒸馏水中，得到蘑菇的菌悬液[9]。 中药对蘑菇菌丝生长的影响：将蘑菇的菌悬液100μL涂布在PDA培养基上，后用采用打孔法，在培养基上打孔，分别在孔内注入各种浓度的中药药液100μL，并标记。接种完成后，将平板放在28℃的恒温箱中培养。每个浓度做3个平板，每个平板上有两个重复。 2.5 多菌灵与中药正交实验 多菌灵浓度的设置：根据周传富等人的研究发现，多菌灵的浓度不宜超过0.3%，否则会抑制食用菌菌丝的生长[10]。同时徐方旭、杨文钦等人的研究则表明食用菌中应首选多菌灵、克霉灵和生石灰等，其主要使用体积分数为0.07%～0.10%，对个别食用菌可选择性地使用体积分数为0.20%的药物，在生产上不能盲目使用[11][12][13][14]。根据中药对产黄青霉的抑制作用来筛选出有抑制作用的浓度，在根据文献来具体设置需要的多菌灵的浓度。一般在0.1%～0.2%之间。 正交试验的设置：根据筛选出的中药浓度，并以此设置的多菌灵浓度，参考统计书[15]上的正交表，设置正交试验。 2.6 结果与分析 （1）拮抗菌的确定。 接抗菌的筛选结果：从土壤中分离纯化的各种微生物分别接种在涂布了1*10-2浓度的产黄青霉的PDA平板上，其中编号为b的平板上有明显的抑菌圈，其余平板均无抑菌圈。 形态观察：接种在PDA培养皿上，放在28℃的恒温箱中培养24h后就发现培养基表面已经全部覆盖了白色的菌丝，且无定形菌落。继续培养一段时间以后，白色菌丝慢慢变成淡灰色的菌丝。 镜检：采用碱氏品红染液和吕氏碱性美兰两种分别对拮抗菌进行简单染色[5]，后在显微镜下由低—高倍镜观察。发现拮抗菌的菌丝无隔膜，有分枝、假根、孢子囊。 （2）拮抗菌对蘑菇菌丝生长的影响。 拮抗菌对蘑菇菌丝生长的影响：在涂布了蘑菇菌悬液的PDA平板上，接种b号平板上挑取的单个菌落，放于28℃的恒温箱中培养24h后，可观察到没有抑菌圈如图4。说明从土壤中分离出的产黄青霉的拮抗菌对蘑菇菌丝的生长并无抑制作用。 （3）中药对产黄青霉生长的影响。 黄柏对产黄青霉生长的影响：接种24h后可以观察到所有平板都布满了产黄青霉的白色菌丝，其中只有2、3号平板有明显的抑菌圈，对应的即是黄柏的浓度分别为0.5g/mL、0.25g/mL。 苦参对产黄青霉生长的影响：在涂布了10-2浓度的产黄青霉的平板上，经过24h可以观察到同样布满了白色菌丝，其中只有6、7、8三个平板有明显的抑菌圈，即对应苦参的浓度为0.016g/mL、0.008g/mL、0.004g/mL。 （4）中药对蘑菇菌丝生长的影响。 黄柏对蘑菇菌丝生长的影响：接种24h后，可以明显看到PDA平板上布满菌丝，在注满黄柏药液的孔洞周围有明显的抑菌圈，但黄柏浓度不同，抑菌圈的大小也不同。黄柏浓度为0.25g/mL时，蘑菇菌丝的抑菌圈直径为1.12cm左右，而浓度为0.5g/mL时，蘑菇菌丝的抑菌圈直径为1.32cm左右。 苦参对蘑菇菌丝生长的影响：同样接种24h后可以明显看到PDA平板上布满菌丝，孔洞的周围同样有明显的抑菌圈。接种六号管苦参的平板上抑菌圈的直径大小大概为1.23cm，接七号管苦参的抑菌圈直径在1.48cm左右，而接八号管苦参的抑菌圈直径大概在1.30cm。 （5）多菌灵与中药正交对产黄青霉生长的影响。 结果表明：在黄柏与多菌灵正交中，P=0.001<0.01，所以黄柏与多菌灵共同作用中最佳组合浓度对产黄青霉的抑制具有极显著影响，即黄柏浓度为0.25g/mL，多菌灵浓度为0.1%。 结果表明：在苦参与多菌灵正交中，P=0.993>0.05，所以苦参和多菌灵共同作用的最佳对产黄青霉的抑制没有显著影响。 3 结论 黄柏和苦参在一定浓度的时候对产黄青霉还是有一定的抑制作用，并且特定浓度的抑制效果还是很明显的。黄柏的十个浓度梯度中，只有0.5g/mL、0.25g/mL两个浓度对产黄青霉有抑制效果，其中0.5g/mL的效果最好，抑菌圈的直径大小平均达到1cm，0.25g/mL的抑制效果略差些。而苦参的只有0.016g/mL、0.008g/mL、0.004g/mL三个浓度对产黄青霉有抑制效果，其中效果最好的是0.004g/mL，抑菌圈平均直徑达到2.0cm。黄柏与农药多菌灵共同作用的效果会明显些，其最佳浓度组合为黄柏浓度为0.25g/mL，多菌灵浓度为0.1%。拮抗菌对产黄青霉的抑制效果，从抑菌圈来看，平均直径是1.6cm，而药剂对产黄青霉作用产生的抑菌圈的平均直径是1.85cm。从数据上来看，还是药剂对污染菌的抑制效果强些。但效果并不会差太多，如果从环境保护方面来说，使用拮抗菌来减少污染菌产黄青霉更为理想。 参考文献： [1]丁宝玲.蘑菇的栽培技术[J].现代农业科技，2007，（20）：42-44. [2]夏子贤.食用菌的大敌--杂菌污染[J].四川农业科技，2002，11：22. [3]Cook，R.J.1993.Making greater use of introduced microorganisms for biological control of plant pathogens.Annu.Rev.Phytopathol.31：53-80. [4]Cook RJ，and Backer KF 1983.The role of bacteria in the biological control of plant pathogens，Ann.Phytopathol.Soc.St.Paul.MN. [5]刘慧，张红星，张海予，易欣欣，高秀芝，熊利霞，等.现代食品微生物学实验技术[M].中国轻工业出版社，2011.7：8-10，20，30-36，260-261，265-266. [6]邱贵根，张斌，沈爱喜，涂寿兰，龙荣俄，等.江西为害食用菌3种霉菌的生物学特性及综合防治技术[J].植物保护学报，1996，23（2）：121-125. [7]向晶晶，陈静鸿，丁成祥，张斌，葛绍荣.食用菌种植中污染菌青霉的拮抗菌筛选[J].中国食用菌，2006，25（6）：39-41. [8]田健，晁青.黄柏等几种中草药对葡萄球菌的体外抗菌作用[J].中国现代药物应用，2008，2（15）：21-23. [9]沙涛，程立忠，张汉波，丁骅孙.一种简易的松茸担孢子收集方法[J].中国食用菌，2002，22（3）：15. [10]周传富，何云霞，王杰.多菌灵对几种食用菌霉菌抑制作用的研究[J].安徽农业大学学报，1999，26（4）：457-460. [11]徐方旭，刘诗扬，贺海升，王升厚.食用菌栽培中有效抗霉药物的筛选[J].河南农业科学，2010（4）：66-69. [12]杨文钦.食用菌栽培要慎用多菌灵[J].福建农业，1994，（12）：10. [13]温玉奎.食用菌生产中常用的三种杀菌剂[J].食用菌，2011（1）：13. [14]王慧阳.七种食用菌消毒剂抑制霉菌效果的比较研究[J].中国食用菌，2006，（3）：29-31. [15]王钦德，杨坚，等.食品试验设计与统计分析[M].中国农业大学出版社，2010，2：459-460. [16]魏景超.真菌鉴定手册[M].上海科学技术出版社，1979，9：62. 项目名称：福建省中青年教师教育研究课题“泉州市食用菌栽培中有效抗霉抗菌的绿色防控技术研究”项目编号：JA12276 |
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