江汉平原猪场仔猪黄白痢的诊断及防治

    刘攀 李鹏

    

    

    

    摘要：从江汉平原部分猪场严重腹泻的仔猪中采集24份仔猪黄痢、白痢粪便样品，共分离鉴定出8株大肠杆菌。药敏试验结果表明，所分离到的8株大肠杆菌对氧氟沙星、头孢噻肟、磺胺六甲、头孢拉啶等药物最敏感。利用强毒分离菌株研制成油乳剂灭活菌苗对产前15 d母猪和初生仔猪进行免疫，疫苗对仔猪保护率达到100%，结果表明利用地方流行强毒分离菌株作为抗原制备疫苗进行免疫可有效预防猪场仔猪黄白痢的发生。

    关键词：仔猪黄白痢；分离鉴定；药敏试验；江汉平原

    中图分类号：S858.28 文献标识码：A 文章编号：1007-273X（2018）03-0010-03

    仔猪黄白痢是仔猪黄痢和仔猪白痢的合称，是由致病性大肠杆菌引起的哺乳仔猪常见肠道传染性疾病。仔猪黄痢主要发生于出生后数小时至7日龄内的仔猪，以1～3日龄内的最常见，一周龄以上很少发病， 病猪主要表现为排黄色糊状粪便；仔猪白痢一般发生于10～30日龄的仔猪，尤以10～20日龄的仔猪发病最多，也最为严重，1月龄以上则很少发生，病猪主要表现为排乳白色或灰白色腥臭糊状粪便[1，2]。无论是现代集约化养猪场还是传统式家庭养殖场，仔猪黄白痢都时有发生，其发病率和死亡率均较高，是造成仔猪育成成活率低，影响养猪业效益的主要疾病之一。由于近几年大量抗生素滥用，导致致病性大肠杆菌耐药谱广泛，因其血清型众多，变异频繁，对生猪疫病防控工作造成严重威胁。

    本试验对江汉平原猪场腹泻严重的仔猪黄白痢病料进行了细菌分离鉴定、药敏试验和自家灭活苗的制备及应用，以期为仔猪黄白痢的有效防治提供理论依据和参考借鉴。

    1 材料与方法

    1.1 材料

    1.1.1 样品采集 江汉平原猪场严重腹泻仔猪中采集的24份粪便样品。

    1.1.2 培养基 TSA培养基、TSB培养基、麦康凯琼脂培养基、伊红-美蓝琼脂培养基，购自国药集团化学试剂有限公司。

    1.1.3 药敏纸片 杭州天和微生物试剂公司生产。

    1.1.4 白油 生物制品用10号白油，购自杭州炼油厂，长江大学动物科学学院动物传染病实验室保存。

    1.1.5 试验动物 12只清洁级昆明小鼠，每只20 g左右，购自湖北省预防医学科学院实验动物中心。

    1.2 方法

    1.2.1 培养基制备 按照所购培养基使用说明制备好相应的培养基。

    1.2.2 病原分离鉴定 从江汉平原各地猪场无菌采集具有黄痢、白痢症状的仔猪粪便24份，分别接种于麦康凯琼脂培养基上，置37 ℃温箱中培养24 h。挑取红色中等大小光滑菌落，接种于TSB培养基增菌，置37 ℃温箱培养16～18 h，然后将培养物分别划线接种于TSA培养基和伊红-美蓝琼脂平板进行细菌培养，18～24 h 后挑取平板上可疑菌落抹片染色镜检， 后将疑似菌落少许再接种于TSB培养基， 供以后试验用。

    1.2.3 生化试验 按照文献[3]方法进行糖发酵试验、M.R试验、H2S试验、V-P试验、吲哚试验等生化试验，做好试验结果记载。

    1.2.4 药敏试验 挑选临床中常用的药物如青霉素、链霉素、头孢噻肟、卡拉霉素及恩诺沙星等按常规药敏纸片法进行，详细记录试验结果。

    1.2.5 致病试验 将分离菌的TSB纯培养物稀释至统一浓度后分别腹腔接种10只健康小鼠，剂量为0.2 mL/只，另设5只小鼠为对照。24 h内死亡的小鼠弃掉并做无害化处理。24～48 h 死亡或发病者无菌采集其心血抹片，进行革兰氏染色、镜检。并取病料接种于TSA琼脂，增殖后保存备制苗使用[4]。

    1.2.6 灭活疫苗的制备 用上述步骤分离鉴定的高致病性大肠杆菌作为菌种，接种TSB培养基，37 ℃培养36 h，采用无菌生理盐水洗下培养平板上的菌苔，制成分离菌混悬液，活菌计数后将其稀释至浓度为12 亿CFU/mL，加入甲醛，37 ℃灭活48 h，经无菌检验合格后再加入白油佐剂进行乳化制成油乳剂灭活苗，疫苗中抗原的终浓度为3 亿CFU/mL。

    1.2.7 疫苗免疫试验 取制成的油乳剂灭活菌苗，按2 mL/只剂量接种产前10～15 d的母猪，详细记载免疫母猪后代的黄白痢发病率，判断其免疫效果。按1 mL/只剂量接种非免母猪生产的初生仔猪，详细记载免疫仔猪的黄白痢发病率，判断其免疫效果。

    2 结果与分析

    2.1 病原菌分离结果

    24份粪便样品中有8株疑似菌株在麦康凯琼脂培养18 h后均为红色菌落，在伊红-美蓝琼脂上培养18 h后均为紫黑色带金属光泽的中等大小圆形菌落，革兰氏染色镜检均为红色中等大小杆菌。

    2.2 生化鉴定

    分离到的8株细菌都能发酵乳糖、麦芽糖和葡萄糖，产酸产气；仅有部分菌株不分解蔗糖，不产生硫化氢，V-P 试验为阴性，吲哚和甲基红试验（M.R）均为阳性，根据文献[3]可判定分离菌株为大肠杆菌。

    2.3 药敏试验

    所有分离菌均对氧氟沙星、头孢噻肟、磺胺六甲、头孢拉啶等药物敏感， 而对其他药物则产生了不同程度的耐受性。结果见表1。

    2.4 致病性试验

    8组试验组中均有小鼠死亡，对照组小鼠不发病。发病及死亡小鼠的心血抹片经革兰氏染色镜检为红色中等大小的杆菌，与致病试验所用菌株一致。从表2中可知第6、7、8组分离菌对小鼠的致死率很高，这3组死亡小鼠心血分离菌可用作疫苗抗原。

    2.5 疫苗免疫效果

    根据致病试验结果，选取3株强毒力菌株作为抗原制苗，取制备的油乳剂灭活菌苗，随机选取9个猪场进行试验，结果见表3、表4。由表3、表4数据可知，按2 mL/只剂量接种产前10～15 d的母猪，免疫母猪后代无黄白痢发生，而对照组仔猪的发病率为70%～90%。按1 mL/只剂量接种非免母猪生产的初生仔猪，仔猪无黄白痢发生，而对照组仔猪的發病率为60%～100%。无论是免疫产前母猪还是免疫初生仔猪，以分离株作为抗原制备的疫苗对仔猪的免疫保护效果都非常好。

    3 小结与讨论

    （1）对从猪场粪便采样分离到的8株细菌，经培养特性、显微镜检、生化试验及致病试验鉴定，证实所分离到的细菌均为致病性大肠杆菌，且其中有3株毒力非常强。

    （2）药敏试验结果表明8株大肠杆菌对氧氟沙星、头孢噻肟、磺胺六甲、头孢拉啶等药物敏感，而对青霉素、链霉素和痢特灵等药物产生了严重的耐药性。

    （3）根据药敏试验结果，选择敏感药物磺胺六甲、头孢噻肟对猪场病猪进行了治疗，取得了很好的疗效。但是在停药后大约1周左右部分猪又开始出现腹泻症状，表明仅仅依靠药物治疗很难彻底控制该病，主要原因是猪场在临床上滥用抗生素，导致大肠杆菌的耐药性在不断增强。因此，仔猪黄白痢防治的重点是预防为主，应通过加强日常饲养管理，做好环境卫生，管理好母猪，做好其他猪病的防控，来提高仔猪的抵抗力。

    （4）目前防治仔猪黄白痢最有效的措施仍然是免疫接种，通常是给临产母猪注射市售的大肠杆菌基因工程菌苗。即便如此，免疫后母猪所产仔猪仍然会有黄白痢发生， 表明免疫用菌苗的抗原血清型与临床上引起仔猪黄白痢的大肠杆菌血清型不一致。在本试验中，根据猪场实际情况，从猪场分离病原，通过致病试验，再从分离株中挑选强毒株作为抗原制备成油乳剂灭活苗，经猪场应用试验，免疫母猪的后代及免疫仔猪不再发生黄白痢，而对照组组仍有60%以上的发病率。结果提示各猪场应使用与本场流行的血清型一致的菌株制苗进行群体免疫，可以非常有效地防治黄白痢的发生。

    （5）本次采用分离到的3株强毒株制苗免疫结果表明对非分离株猪场的免疫保护率也达到了100%，说明目前在江汉平原猪场流行的毒株以分离到的毒株为主，该毒株血清型具有地方流行性特点。另外5株分离株血清型是否与3株强毒株的血清型相同还有待进一步研究。

    参考文献：

    [1] 陈溥言.兽医传染病学[M].第六版.南京：江苏科学技术出版社，2015.

    [2] 陆承平.兽医微生物学[M].第五版.北京：中国农业出版社，2013.

    [3] 姚火春.兽医微生物学实验指导[M].第二版.北京：中国农业出版社，2012.

    [4] 陈溥言.兽医传染病学实验指导[M].北京：中国农业出版社，2015.