南海刺参皂苷的分离纯化及其抑瘤活性研究
张蕊 孙宏伟 徐成
南海刺参皂苷的分离纯化，分析和评价南海刺参皂苷的对肿瘤的抑制效果，为利用海参皂苷研制高效抗肿瘤药物创造条件。方法：先后利用大孔树脂柱层析、硅胶柱层析和HPLC对南海海参皂苷进行了纯化，并利用肿瘤细胞培养的方法对纯化组分的抗肿瘤活性进行了测定。结果：海参皂苷对小鼠肉瘤细胞系S180、人结肠癌细胞系Caco- 2和人宫颈癌细胞系Hela的均有明显的生长抑制作用。结论：本研究为南海海参皂苷在预防和治疗肿瘤中的应用提供了理论依据，同时也为南海海参中生物活性物质利用提供了新的思路。
海参具有较高的营养价值和膳食补充。在海参的壁和内脏中，可分泌一些活性物质，即海参皂苷。海参皂苷是海参的主要次生代谢产物，是化学防御的物质基础。具有抗肿瘤、抗真菌、抑制细胞生长、免疫调节和溶血等多种生理和藥理活性。海参皂苷的分离纯化及其药物研究已引起人们的广泛关注。采用大孔树脂柱层析、硅胶柱层析和半制备型HPLC对刺参皂苷进行分离纯化，并对纯化组分的抗肿瘤活性进行了研究。
材料与方法
材料。南海海参市售，由中国青岛海洋大学对样品进行种属鉴定。癌细胞是由北京维通利华动物有限公司提供的小鼠肉瘤S180细胞株、人结肠癌细胞系Caco- 2和人宫颈癌细胞系Hela。
实验方法
（1）南海海参总皂苷的制备
10kg粉碎de 新鲜南海海参，用60%乙醇冷浸5次，每次3天，减压回收乙醇提取物得清膏。将流浸膏均匀分散于水中，装入预处理后的HP - 20大孔树脂柱中，分别用水、80 %乙醇溶液和95 %乙醇溶液洗脱，收集80%乙醇洗脱液，减压回收得到粗总皂苷。 粗总皂苷通过氯仿∶甲醇∶水梯度洗脱的正相硅胶柱层析进一步纯化， 溶液的梯度为10∶1∶0.1到7 ：3 ：0.3。用硅胶板薄层色谱法检测洗脱组分后，再用半制备型HPLC对流动度相同的洗脱组分进行合并纯化。色谱柱为：A A 12S0 5- 2510W T O D S C 8，流动相为甲醇：水，流速为1.5毫升，最小检测波长为205nm。
（2）细胞培养
S180和Hela细胞培养于含10%新生牛血清的RPMI-1640培养基，Caco- 2培养于含10%胎牛血清的MEM培养基，其中均含2%的青/链霉素。细胞置于37℃、5% CO2饱和湿度的培养箱内培养，取对数生长期的细胞进行实验。
（3）肿瘤细胞活力测定
收集对数生长期的肿瘤细胞，按照S180（5×04/mL）、Caco-2（2.5×104/mL）和Hela（2×104/mL）调整细胞密度，96孔板每个孔100μL/，对照组用水培养，每组3个重复，培养时间为48、72h。采用MTT法测定吸光度OD570值。细胞存活率（%）=（样品组OD570/正常对照组D570）×100。
统计学方法。统计学处理数据以平均数±标准差表示，采用R3.4.1软件t检验进行组间差异分析，以p<0.05为差异有显著性。
结果
采用质谱法测定了南海海参5.47%的皂苷含量。高子阳研究了11种市售海参和8批干海参中总皂苷的含量。结果表明，海参总皂苷含量在3.16 %～5.27%之间，结果显示南海海参总皂苷含量明显高于其他种类的海参。南海海参皂苷对3种肿瘤细胞活力的影响见表1所示。经4μg/mL以上的海参皂苷处理后，三种癌细胞的生长均受到显著的抑制，抑制作用与处理时间成正比。其中，在样品作用72h后，海参皂苷对三种癌细胞细胞存活率的半数抑制浓度（IC50）分别为7.17、9.78和8.03μg/mL，是一种优良的海参皂苷来源物种。
结果表明，南海海参皂苷含量丰富，体外增殖抑制活性显著高于其他海参，可作为海参皂苷的良好生物来源。海参皂苷在南海的抗肿瘤作用可能与提高机体免疫力和抗氧化水平有关。本研究为海参皂苷在肿瘤防治中的应用提供了理论依据，也为低值海参生物活性物质的高价值利用提供了新的思路。海参的抗肿瘤作用的分子机制仍需进一步研究。
南海刺参皂苷的分离纯化，分析和评价南海刺参皂苷的对肿瘤的抑制效果，为利用海参皂苷研制高效抗肿瘤药物创造条件。方法：先后利用大孔树脂柱层析、硅胶柱层析和HPLC对南海海参皂苷进行了纯化，并利用肿瘤细胞培养的方法对纯化组分的抗肿瘤活性进行了测定。结果：海参皂苷对小鼠肉瘤细胞系S180、人结肠癌细胞系Caco- 2和人宫颈癌细胞系Hela的均有明显的生长抑制作用。结论：本研究为南海海参皂苷在预防和治疗肿瘤中的应用提供了理论依据，同时也为南海海参中生物活性物质利用提供了新的思路。
海参具有较高的营养价值和膳食补充。在海参的壁和内脏中，可分泌一些活性物质，即海参皂苷。海参皂苷是海参的主要次生代谢产物，是化学防御的物质基础。具有抗肿瘤、抗真菌、抑制细胞生长、免疫调节和溶血等多种生理和藥理活性。海参皂苷的分离纯化及其药物研究已引起人们的广泛关注。采用大孔树脂柱层析、硅胶柱层析和半制备型HPLC对刺参皂苷进行分离纯化，并对纯化组分的抗肿瘤活性进行了研究。
材料与方法
材料。南海海参市售，由中国青岛海洋大学对样品进行种属鉴定。癌细胞是由北京维通利华动物有限公司提供的小鼠肉瘤S180细胞株、人结肠癌细胞系Caco- 2和人宫颈癌细胞系Hela。
实验方法
（1）南海海参总皂苷的制备
10kg粉碎de 新鲜南海海参，用60%乙醇冷浸5次，每次3天，减压回收乙醇提取物得清膏。将流浸膏均匀分散于水中，装入预处理后的HP - 20大孔树脂柱中，分别用水、80 %乙醇溶液和95 %乙醇溶液洗脱，收集80%乙醇洗脱液，减压回收得到粗总皂苷。 粗总皂苷通过氯仿∶甲醇∶水梯度洗脱的正相硅胶柱层析进一步纯化， 溶液的梯度为10∶1∶0.1到7 ：3 ：0.3。用硅胶板薄层色谱法检测洗脱组分后，再用半制备型HPLC对流动度相同的洗脱组分进行合并纯化。色谱柱为：A A 12S0 5- 2510W T O D S C 8，流动相为甲醇：水，流速为1.5毫升，最小检测波长为205nm。
（2）细胞培养
S180和Hela细胞培养于含10%新生牛血清的RPMI-1640培养基，Caco- 2培养于含10%胎牛血清的MEM培养基，其中均含2%的青/链霉素。细胞置于37℃、5% CO2饱和湿度的培养箱内培养，取对数生长期的细胞进行实验。
（3）肿瘤细胞活力测定
收集对数生长期的肿瘤细胞，按照S180（5×04/mL）、Caco-2（2.5×104/mL）和Hela（2×104/mL）调整细胞密度，96孔板每个孔100μL/，对照组用水培养，每组3个重复，培养时间为48、72h。采用MTT法测定吸光度OD570值。细胞存活率（%）=（样品组OD570/正常对照组D570）×100。
统计学方法。统计学处理数据以平均数±标准差表示，采用R3.4.1软件t检验进行组间差异分析，以p<0.05为差异有显著性。
结果
采用质谱法测定了南海海参5.47%的皂苷含量。高子阳研究了11种市售海参和8批干海参中总皂苷的含量。结果表明，海参总皂苷含量在3.16 %～5.27%之间，结果显示南海海参总皂苷含量明显高于其他种类的海参。南海海参皂苷对3种肿瘤细胞活力的影响见表1所示。经4μg/mL以上的海参皂苷处理后，三种癌细胞的生长均受到显著的抑制，抑制作用与处理时间成正比。其中，在样品作用72h后，海参皂苷对三种癌细胞细胞存活率的半数抑制浓度（IC50）分别为7.17、9.78和8.03μg/mL，是一种优良的海参皂苷来源物种。
结果表明，南海海参皂苷含量丰富，体外增殖抑制活性显著高于其他海参，可作为海参皂苷的良好生物来源。海参皂苷在南海的抗肿瘤作用可能与提高机体免疫力和抗氧化水平有关。本研究为海参皂苷在肿瘤防治中的应用提供了理论依据，也为低值海参生物活性物质的高价值利用提供了新的思路。海参的抗肿瘤作用的分子机制仍需进一步研究。
