南美白对虾致病性弧菌的鉴定及药敏分析

    高杨

    摘?要：由丹东东港市某养殖场患病的南美白对虾（Penaeus vannamei）幼虾组织体内分离出一株优势菌，通过全自动细菌分析仪及16s rDNA序列分析对该菌株进行鉴定，命名为DS180707。并进行人工感染试验和药敏实验。结果显示，本次患病幼虾致病菌为溶藻弧菌，且具有较强的致病性。该菌对氟苯尼考、氯霉素 、恩诺杀星、诺氟沙星、氧氟沙星、左氧氟沙星等6种抗生素敏感。

    关键词：南美白对虾（Penaeus vannamei）;溶藻弧菌;药敏实验

    南美白对虾（Penaeus vannamei）又叫做凡纳宾对虾或白脚虾[1]，原产于中、南美太平洋沿岸水域。1988年中科院海洋研究所首次从美国引进南美白对虾[2]，由于其生长速度快、抗病能力强[3]，成为世界养殖产量最高的品种之一。丹东地处河口地区，海、淡水资源丰富，适合南美白对虾养殖。

    随着淡水高密度养殖模式的兴起，南美白对虾的病害也频繁发生。南美白对虾细菌性疾病的主要原因是弧菌病[1]。笔者从丹东东港市某养殖场患病的南美白对虾以及池塘水样进行细菌分离与鉴定，水质理化指标测定，16s rDNA序列分析及药敏试验，为南美白对虾弧菌病的研究提供理论依据。

    1?材料与方法

    1.1?试验材料

    2018年7月，东港市某白对虾养殖户反应养殖的南美白对虾行动迟缓、生长缓慢。笔者现场取患病南美白对虾150尾，体长约3～5 cm。健康幼虾取自东港市某养殖场。

    1.2?试验方法

    1.2.1?肉眼检查及剖检?将患病幼虾通过肉眼观察体表症状，解剖头胸甲进行镜检，并记录。

    1.2.2?细菌分离?在无菌条件下[4]，将患病幼虾分为10组，分别进行组织匀浆处理。用接种针接种于胰蛋白胨大豆琼脂（TSA）培养基和硫代硫酸盐柠檬酸盐胆盐蔗糖琼脂（TCBS）培养基上，划线分离，28 ℃恒温培养箱培养24 h，挑取优势菌的单菌落，在TSA平板上纯化培养3次。

    1.2.3?细菌鉴定

    1.2.3.1?分子生物学鉴定?对分离菌株进行常规16s rDNA基因序列鉴定，将得到的产物送至上海生工生物工程有限公司进行测序。将测序结果在NCBI网站上进行BLAST比对。选取同源性较高的序列，采用 Clustal X 1.83软件进行多重序列比对分析，并通过MEGA 6软件采用邻接法构建系统发育树。

    1.2.3.2?生化鉴定?采用法国生物梅里埃公司生产的微生物自动分析系统进行生化特征分析。

    1.2.4?人工感染试验?试验虾为东港地区某养殖场健康幼虾200尾，体长2～3 cm，暂养于200 L水族箱中，温度控制在26 ℃，盐度1.5‰，连续充氧。试验组与对照组各10 L水体分别放入50尾仔虾，试验组水体中的细菌密度调至108cfu/mL，对照组不加入菌体。每日正常投喂，并观察记录发病症状及死亡情况。

    1.2.5?药敏试验?采用药敏纸片法。

    1.2.6?水质理化指標的测定?用水质分析仪（YSI）检测水体水温、溶解氧、盐度、pH。用7500仪器检测氨氮、亚硝酸盐、磷酸盐、化学耗氧量。

    2?结果与分析

    2.1?病原形态特征

    自南美白对虾组织中分离获得一株细菌，命名为DS180707，纯化后在TSA平板上呈现为圆形光滑、黄色突起的菌落。革兰氏染色后在显微镜下观察为革兰氏阴性菌。

    2.2?病原菌的生理、生化鉴定

    由全自动细菌分析仪对病原菌的生理生化检测结果可知，该病原菌初步鉴定为溶藻弧菌（V.alginolyticus）。

    2.3?菌株16s rDNA 基因序列分析及系统发育树的构建

    将分离菌所扩增的16s rDNA基因序列进行Blast比对结果显示，菌株 DS180707基因与溶藻弧菌相应基因相似率达99%。将分离菌所扩增的16s rDNA基因序列提交到Gen Bank，获得序列号为MK217413，所构建的系统发育树，菌株DS180707与溶藻弧菌聚为一支。

    2.4?人工感染试验

    人工感染48 h后，南美白对虾开始出现死亡，72 h死亡率达50%。取感染后死亡幼虾匀浆处理后进行细菌分离，并进行革兰氏染色镜检、生化鉴定及分子生物学鉴定，结果显示分离菌株与原感染菌株为同一种致病菌。

    2.5?药敏试验

    药敏试验结果显示，溶藻弧菌DS180707对氟苯尼考、氯霉素 、恩诺杀星、诺氟沙星、氧氟沙星、左氧氟沙星等抗生素敏感，对庆大霉素、多西环素、青霉素、制霉菌素耐药（表1）。

    2.6?水质理化指标测定结果

    南美白对虾养殖最适[5]温度为 24～32 ℃，pH为7.5～8.5，溶解氧 5 mg/L以上。根据水质理化指标质量标准[4]可知，该养殖水质中氨氮和活性磷含量超标（表2）。

    3?讨论

    作者首次从丹东地区患病的南美白对虾体内分离出溶藻弧菌，并命名为DS180707。该菌对多种水生生物[6]均能造成危害。通过人工感染试验可知，该菌是致病菌，也是对虾细菌病的主要病原之一，能引起对虾摄食率下降，烂鳃黑鳃[7-9]，游动缓慢等症状。该病多发在夏秋季节[10]，温度在25～28 ℃易暴发流行。该养殖池塘发病时已进入夏季，是全年气温、水温较高时期，随着温度的上升水产病害明显增加。且氨氮和活性磷含量过高，氨氮[11]作为养殖水体重要的胁迫因子，含量过高会造成对虾免疫力及抗病力下降，增加对弧菌的感染性。活性磷[12]过高易造成水体富营养化，研究表明，虾病暴发前养殖池中的无机磷含量通常超过阈值。

    由药敏试验结果可知，溶藻弧菌DS180707对氟苯尼考、氯霉素、恩诺杀星、诺氟沙星、氧氟沙星、左氧氟沙星等6种抗生素敏感。在防治水产生物细菌性疾病时不要滥用[13]抗生素类药物，避免细菌耐药性的产生，增加病害控制的难度。确定药物的最低有效浓度及菌株的耐药性是下一步工作的方向。

    

    综上所诉，造成南美白对虾养殖池发病的主要病原是溶藻弧菌。针对氨氮和磷酸盐过高的情况应及时采取措施调节。经常泼洒碘液和微生态制剂可以调节水质，同时确保充足优质的饵料供应，是提高对虾抗病力的主要手段。

    参考文献：

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    [3] 邬国民.南美白对虾养殖技术（上）[J].科学养鱼，2000（8）：8-9.

    [4] 郑斌，邹绍林，姚洪，等.池塘养殖海蜇疾病的病因分析[J].中国水产，2016（04）：82-87.

    [5] 冉永明.南美白对虾淡水养殖试验[J].农技服务，2017（17）：76.

    [6] 苗鹏飞，杨映，谭淑雯，等.罗氏沼虾致病性溶藻弧菌的鉴定及药敏分析[J].水产科学，2018，37（3）：384-388.

    [7] 胡超群，陶保华.综述：对虾弧菌病及其免疫预防的研究进展[J].热带海洋，2000，19（3）：84-94.

    [8] 赵永军，刘延鑫，徐文彦.南美白对虾淡水养殖常见细菌性病害及防制技术[J].郑州牧业工程高等专科学校学报，2006，26（1）：37-38.

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    [10] 姚刚，覃映雪，邹文政，等.致病性溶藻弧菌生物膜形成特性研究[J].水产科学，2012，31（2）：73-78.

    [11] 葛红星.两种主要无机氮胁迫下凡纳滨对虾免疫因子变化及其对副溶血弧菌易感性的研究[D].上海海洋大学，2014.

    [12] 李玉全.工厂化养殖系統分析及主要养殖因子对对虾生长，免疫及氮磷收支的影响[D].中国海洋大学，2006.

    [13] 李正义，贾俊涛，陈晓，等.养殖大菱鲆出血病病原菌的分子生物学鉴定[J].水产科学，2010，29（1）：44-47.