虾肝肠胞虫(EHP)孢子的纯化和计数

    赵若恒 高雯 邱亮 李晨 谢国驷 黄倢

    摘?要：采用差速离心和密度梯度离心，从感染虾肝肠胞虫（Enterocytozoon hepatopenaei， EHP）对虾的肝胰腺中，尝试纯化出孢子，并应用透射电镜、荧光桃红染色和血球计数板计数的方法对纯化出的孢子进行了观察和计数。结果表明，从1 g的EHP载量为（4.7±2.2）×104 copies/ng DNA的肝胰腺组织中经差速离心和密度梯度离心方法分离到EHP的孢子，电镜观察孢子为大小在0.7～1.2 μm的椭圆形，纯化孢子悬液用血球计数板计数显示孢子浓度为5.30×103个/μL，蔗糖密度梯度中的纯化孢子区带含有的孢子总数约1.06×106个。

    关键词：虾肝肠胞虫（Enterocytozoon hepatopenaei， EHP）;纯化;计数

    自从虾肝肠胞虫（Enterocytozoon hepatopenaei， EHP）在泰国养殖的生长缓慢的斑节对虾（Penaeus monodon）中被发现以来[1]，越南、印尼、马来西亚和泰国等国家均有检测出虾肝肠孢虫对凡纳滨对虾的感染，对虾感染该病原后，会导致对虾出现生长缓慢或生长停滞，并有时会出现白便等症状，但其不影响对虾的摄食和存活率[2-3]。我们最早也于2013年从浙江台州养殖的日本囊对虾、凡纳滨对虾以及罗氏沼虾样品中检出了EHP的感染，当对虾肝胰腺中EHP SSU rDNA的相对拷贝数在103 copies/（ng Hp DNA）数量级或EHP 载量指数在3以上时，对虾的生长明显较慢，表明该载量的EHP已处于一个较高的风险水平，其导致对虾生长缓慢的问题给对虾养殖业带来了巨大损失，需要引起高度重视[4]。EHP孢子是EHP发生个体和群体间传播的关键形式，其分离纯化对于查明微孢子虫寄生、感染机制及防治技术等具有重要意义。目前分离纯化微孢子虫孢子的方法有：差速离心法、蔗糖密度梯度离心法和Percoll密度梯度离心法[5]。蔗糖密度梯度离心法是纯化病毒常用的一种方法，应用十分广泛，能满足多数试验的需求。本实验以灭菌海水（pH 6.0）作为缓冲液，蔗糖为纯化介质，感染对虾的肝胰腺为材料进行分离纯化，并通过电镜观察，染色后光镜观察，血球计数板计数对纯化的EHP孢子进行评价以及孢子颗粒的结构和孢子数量等信息进行研究，以期对该病的感染机制和防控策略提供技术依据。

    1?材料与方法

    1.1?实验用虾

    实验用凡纳滨对虾于2017年10月27日购自山东日照凡纳滨对虾养殖场，参照OIE水生动物疾病诊断手册（OIE， 2017）及已发表的文献方法[4，6-7]进行主要病原检测，包括白斑综合征病毒（WSSV）、传染性皮下及造血组织坏死病毒（IHHNV）、桃拉综合征病毒（TSV）、偷死病野田村病毒（CMNV）、黄头病毒（YHV）、传染性肌坏死病毒（IMNV）、虾肝肠胞虫（EHP）和致急性肝胰腺坏死病副溶血弧菌（VpAHPND）。

    1.2?虾肝肠胞虫的分离与纯化

    1.2.1?虾肝肠胞虫孢子粗提液的制备?取EHP强阳性的凡纳滨对虾，解剖取其肝胰腺（约1 g），置于冰冷的灭菌海水（盐度25‰， pH 6.0）中，在冰浴中匀浆破碎，用高速离心机（CR21GIII，日立）在2 000 r/min，4 ℃离心10 min，收集上清液。沉淀再加冰冷灭菌海水（pH 6.0），于冰浴中匀浆破碎，再经3 000 r/min，4 ℃离心20 min，将两次上清合并，直接用有效孔径为10 μm的滤膜过滤去除残留的细胞或其他杂质。之后将过滤的上清于8 000 r/min，4 ℃离心10 min，得到的沉淀分别用200 μL的灭菌海水重悬。

    1.2.2?蔗糖密度梯度离心?用灭菌海水作为溶剂，分别按重量比配制20%、30%、40%、50%和60%的蔗糖溶液。铺设于超速离心管中，于4 ℃静置一夜，形成均匀的蔗糖密度梯度。将孢子粗提取液缓慢加到蔗糖密度梯度顶部，将各离心管重量严格配平后，使用超速离心机（CP100WX，日立，日本）于4 ℃、12 500 r/min离心30 min。将离心后的离心管放置于黑色背景下，在自然光和红色激光下观察管中条带。

    1.3?蔗糖密度梯度各区带的样品提取

    蔗糖密度梯度离心后，收集梯度中的白色条带，加入10倍体积的灭菌海水稀释，混匀，于8 000 r/min，4 ℃离心15 min，倒掉上清，用200 μL灭菌海水重悬沉淀，振荡混匀。样品悬液保存于4 ℃冰箱。

    1.4?透射电镜观察

    将最后收集到的各個条带的悬液样品，用铜网吸附后，经2%磷钨酸（pH7.0）负染，在透射电子显微镜（JEOL JEM-1200，日本）下进行观察，确定孢子形态。

    1.5?光镜观察

    取一小滴（约20 μL）纯化后的孢子悬液均匀涂布于载玻片上，滴加一小滴2%的荧光桃红B，将两者轻轻混匀，室温孵育3 min，于100倍油镜下进行观察。

    1.6?孢子计数方法

    依照姜义仁等的方法[5]，取最后离心稀释得到的孢子悬液5 μL，再加入5 μL的2%的荧光桃红B，染色后将溶液滴在血球计数板上，盖上盖片，在100倍油镜下观察、计数。按以下公式计算单位体积悬液的孢子数量。

    孢子数/mL=80小格内孢子个数/80×400×104×稀释倍数

    2?结果与分析

    2.1?EHP的TaqMan探针实时荧光PCR标准曲线

    成功的纯化工作需要优良的原材料。现已建立的方法中只有EHP的实时定量PCR方法[4，6]能准确地对EHP载量进行定量检测，为了选择带有足够EHP的肝胰腺进行EHP孢子的纯化，我们采用TaqMan探针qPCR方法对虾组织样品进行EHP定量。对该方法用质粒标准模板进行TaqMan探针qPCR进行校准（图1），质粒标准模板量在6.60×101～6.60×107copies/μL范围内，Ct值与SQ的对数值的线性关系为Ct=-3.350 log（SQ）+39.286，相关系数R2=0.990，扩增效率98.8%。

    2.2?虾样EHP载量检测

    对实验用虾进行了病原的检测，结果显示WSSV、IHHNV、TSV、CMNV、YHV、SHIV、IMNV和VpAHPND均为阴性，依照刘雅梅等的方法进行了EHP的TaqMan探针实时荧光PCR检测[6]，结果显示，实验所用凡纳滨对虾的EHP载量为（4.7±2.2）×104copies/ngDNA。

    2.3?EHP的蔗糖密度梯度离心提纯

    用1 g感染EHP载量达（4.7±2.2）×104copies/ngDNA的凡纳滨对虾肝胰腺组织，经匀浆和差速离心，通过20%～60% （W/W）蔗糖密度梯度于12 500 r/min超速离心30 min后，在离心管的各密度交界处，通过自然光下，或红色激光照射下均能看到4条乳白色区带（图2）。自然光下蔗糖梯度中的4条乳白色区带可勉强观察到;而红色激光下，4条区带更加明显，其中条带1较为色浅，3最为集中，条带2和4很微弱。

    2.4?纯化的EHP孢子的电镜观察

    各条带样品用电镜铜网吸附，经磷钨酸负染和透射电镜观察（图3），在第3条带的样品中可见到椭圆形的孢子的形态，经测量，孢子大小0.7～1.2 μm，在较低放大倍数下，一个视野中可以观察到有较多的孢子。

    图3?纯化的EHP孢子的透射电镜观察

    注：A.白色箭头指示EHP孢子，标尺每个刻度为50 nm;B.白色箭头指示孢子，标尺每个刻度为1 μm。

    2.5?纯化EHP孢子的光镜观察

    密度梯度离心的第3条样品区带，离心去蔗糖后的孢子悬液样品经2%的荧光桃红B染液染色，在100倍油镜下，可以观察到大量纯净均一的染成紫红色的孢子（图4），孢子大小及形态与电镜下观察到的EHP孢子相符。

    2.6?纯化EHP孢子悬液的孢子光镜计数

    取5 μL密度梯度离心第3条区带经离心和混悬得到的最后EHP孢子悬液，再加入5 μL的2%的荧光桃红B，染色后对孢子的染色观察和计数，80小格内EHP孢子个数为53个，代入公式：EHP孢子数/mL=80小格内孢子个数/80×400×104×2 （稀释倍数），求得EHP孢子的浓度为5.3×103个/μL。根据最后EHP孢子悬液的体积，得出密度梯度离心第3条区带的EHP孢子总数为1.06×106个。

    3?讨论

    虾肝肠胞虫首次在泰国养殖的斑节对虾中发现并且命名。但由于副溶血弧菌引起的急性肝胰腺坏死病（AHPND）的暴发，EHP的感染在前期并未受重视，使得EHP在养殖的斑节对虾及凡纳滨对虾中广泛传播，导致对虾生长缓慢的问题越来越普遍，带来的经济损失也越来越严重，并直接或间接威胁整个对虾养殖业的发展。从2013年始，已在越南、中国、印尼、马来西亚和泰国等国家不断暴发[8]。

    本实验室已经建立的虾肝肠胞虫TaqMan探针荧光定量PCR检测方法，对6.1×101～6.1×108 copies/μL的EHP SSU rDNA标准品检测具有良好的线性关系和良好的组间和组内重复性。通过对实际样品检测对比，该方法比套式PCR灵敏度高7.6±4.2倍，比SYBR Green I qPCR-EHP高1.3±0.2倍[6]。TaqMan探针实时PCR法使用特异性探针，可有效防止PCR反应中非特异产物的影响，在水生动物病原的检测中广泛得到应用[9]。在虾类病原的OIE水生动物诊断标准中，常常成为标准的定量检测方法。由于EHP存在滋养体和孢子体的两个阶段，qPCR方法是对总的EHP核酸的定量，方法虽然特异灵敏，却无法对EHP孢子进行单独计量，而只有EHP孢子具有个体间的传染性，因此有必要建立能单独对EHP孢子进行计量的方法。

    血球计数板是一种常见的生物学工具，通常用于对人体内红、白血球进行显微计数，也常用于一些细菌、真菌、酵母等微生物数量的计算，EHP在分类上同属于真菌，其孢子经过染色后，形态在油镜下能较容易辨别出来，因此用血球计数板可以直接对EHP孢子进行计数，为EHP孢子的传染性研究提供了一种计量方法。

    本研究通过差速离心、密度梯度离心的方式从感染EHP对虾的肝胰腺中，分离纯化出EHP的孢子颗粒，其中蔗糖密度梯度离心后的第3条区带最为明显。经磷钨酸负染的透射电鏡也在该区带样品中观察到了完整的孢子颗粒，由于孢子壁完整，负染液未进入孢子内部，因此其内部的构造无法看到。通过染料对孢子颗粒进行染色，确定孢子形状为椭圆形，其大小也与先前的报道一致[3]。

    近年来，虾肝肠胞虫对对虾养殖业的危害越来越令人关注，但目前对该病还没有有效的治疗药物，因此对该病原的检测和净化就尤为重要。由于该病原的感染部位主要在肝胰腺，取肝胰腺进行检测是致死性的检测，在亲虾检测及药物筛选研究中无法进行个体的精确定量跟踪，导致无疫筛查和药物筛选困难。由于EHP孢子能随粪便排出，对EHP孢子的浓缩纯化和定量检测，可能为对对虾活体进行EHP监测和EHP传染风险的评估提供很好的解决措施，本文的孢子分离纯化和计量方法将为后续的EHP感染检测及定量分析提供技术支持。

    参考文献：

    [1] Tourtip S， Wongtripop S， Stentiford GD， et al.Enterocytozoon hepatopenaei sp.nov.（Microsporida： Enterocytozoonidae）， a parasite of the black tiger shrimp Penaeus monodon （Decapoda： Penaeidae）： fine structure and phylogenetic relationships [J].J Invertebr Pathol， 2009， 102（1）： 21-29.

    [2] Rajendran KV， Shivam S， Praveena PE， et al.Emergence of Enterocytozoon hepatopenaei （EHP）， in farmed Penaeus （Litopenaeus） vannamei， in India [J].Aquaculture， 2016， 454：272-280.

    [3] Santhoshkumar S， Sivakumar S， Vimal S， et al.Biochemical changes and tissue distribution of Enterocytozoon hepatopenaei （EHP） in naturally and experimentally EHP‐infected whiteleg shrimp， Litopenaeus vannamei （Boone， 1931）， in India [J].J Fish Diseases， 2017， 40（4）：529-539.

    [4] 劉珍， 张庆利， 万晓媛， 等.虾肝肠胞虫（Enterocytozoon hepatopenaei）实时荧光定量PCR检测方法的建立及对虾样品的检测[J].渔业科学进展， 2016， 37（2）： 119-126.

    [5] 姜义仁， 邓真华， 王伯阳，等.柞蚕微孢子虫孢子分离纯化方法[J].应用昆虫学报， 2011， 48（2）：452-456.

    [6] Liu Y M， Qiu L， Sheng A Z， et al.Quantitative detection method of Enterocytozoon hepatopenaei using TaqMan probe real-time PCR [J].J Invertebr Pathol， 2018， 151： 191.

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    [8] Tangprasittipap A ， Srisala J ， Chouwdee S ， et al.The microsporidian Enterocytozoon hepatopenaei is not the cause of white feces syndrome in whiteleg shrimp Penaeus （Litopenaeus） vannamei [J].BMC Veterinary Research， 2013， 9（1）：139.

    [9] Yue Z Q， Liu H， Wang W，et al.Development of real-time polymerase chain reaction assay with TaqMan probe for the quantitative detection of infectious hypodermal and hematopoietic necrosis virus from shrimp [J].J AOAC Int. 2006 ，89（1）：240-4.