杂交鲟中草药免疫增强剂的体外快速筛选

    唐黎 龚芦玺 姜海波 林艳红

    摘要：采用杂交鲟的离体外周血和中草药的水提液进行共同孵育的方法，快速筛选杂交鲟中草药免疫增强剂。实验选用质量为365 g，体长18 cm的杂交鲟鱼1尾，抽取杂交鲟鱼的血样，提取其白细胞，用苦参、茵陈、杜仲、淫羊藿、茯苓、紫草、甘草、生地等八种中草药浓度为0.5 g/mL的水提液与杂交鲟的外周血白细胞共同孵育后，分别采用抗超氧阴离子试剂盒、金黄色葡萄球菌法来测定杂交鲟的氧呼吸爆发活性以及中草药对杂交鲟白细胞的吞噬活性（吞噬活性以吞噬百分比（phagocytic percent-age，PP）和吞噬指数（phagocytic index，PI）表示）的影响。结果表明：各处理组外周血白细胞氧呼吸爆发活性均存在显著差异（P<005），其中苦参、茵陈、杜仲、淫羊藿、茯苓、紫草和甘草组显著高于对照组（P<0.05），生地显著低于对照组（P<0.05）。苦参、茯苓、生地组外周血白细胞吞噬百分比显著高于对照组（P<0.05）。苦参、生地组外周血白细胞吞噬指数显著高于对照组（P<0.05），紫草和甘草组外周血白细胞吞噬指数显著低于对照组（P<0.05）。结论：结合上述评价指标，苦参、茯苓更加适合作为杂交鲟候选免疫增强剂。

    关键词：中草药；杂交鲟；免疫力

    杂交鲟已成为我国新兴的淡水养殖优良品种，它具有养殖经济效益好、饲料转化率高、生长快等特点，由于集约化程度越来越高，养殖密度不断增加也给鲟鱼的养殖带来病害方面的问题。溶菌酶是鱼类抵挡病原菌感染的重要酶类[1]，因此，许多学者对鱼类溶菌酶的特性和血液白细胞的吞噬活性都进行了研究[2-3]。中草药具有毒副作用小、价格低廉、资源丰富等优点，并且它能够明显促进机体的非特异性及特异性免疫反应，提高机体的抵抗力和抗病力，是广泛应用在动物体的免疫增强剂[4]。使用中草药作为免疫增强剂不仅可以解决抗生素、化学药物等引发的养殖鱼类药残超标和抗 （耐） 药性等问题，而且还符合渔业发展中无公害水产品生产上绿色化的需求[5]，现已研究发现多种中草药有效成分可以增强动物机体的免疫功能，主要是通过调动非特异性来抵抗病原生物实现的[6]。采用免疫增强剂增强鱼体的抵抗力和免疫力，降低鱼病的发生率，在当下正逐渐成为保证养殖效益和控制鱼病的关键措施。通过将免疫增强剂添加在鱼类的饲料中现已成为了国内外学者研究的热点[7-12]。

    关于鲟鱼养殖的研究多局限于对鲟生长指標及存活率等方面的评价， 但是对鲟鱼生理指标变化的探讨较少。本实验以杂交鲟为研究对象，采用杂交鲟外周血与中草药的水提液共同孵育的方法，探讨了中草药对杂交鲟氧呼吸爆发活性和吞噬活性的影响，旨在筛选出能提高杂交鲟免疫力和抗病能力的免疫增强剂。

    1实验材料与方法

    1.1实验用中草药和实验用鱼

    实验所用8种中草药购于贵州省贵阳花溪区中草药药店，中草药的中文名及拉丁文名如表1所示。实验用杂交鲟鱼购于贵州省贵阳市花溪区贵州大学南校区附近农贸市场，质量365 g，体长18 cm，无病无伤，暂养于水产养殖实验室。

    1.2主要试剂及配制方法

    1.2.1Giemsa染色液5 g吉姆萨粉加入22 mL丙三醇，研磨至无颗粒状态，56 ℃下保温2 h之后，加入33 mL甲酸，得到吉姆萨母液，棕色试剂瓶中备用。用时将吉姆萨与PBS液按照1∶9比例混匀（现配现用）。

    表1中草药中文名及拉丁文名

    中草药学名苦参Sophora flavescens Ait茵陈Artemisiae Scopariae Herba杜仲Eucommia ulmoides Olive淫羊藿E.brevicornum Maxim茯苓Poria cocos（ Schw.） Wolf紫草Arnebia euchroma（Royle） Johnst甘草Radix ghycyrrhizae生地Rehmannia glutinosa Libosch1.2.20.2%台盼蓝0.2 g台盼蓝溶于100 mL超纯水中，磁力搅拌过夜，用特曼纸过滤之后4 ℃保存，使用前加4倍生理盐水稀释。

    1.2.390%细胞分离储存液90 mL细胞分离液加入10 mL 1.5 M NaCl。

    1.2.4肝素用PBS稀释成3 000 U/mL，045 μm无菌过滤膜过滤，在4 ℃下保存。

    1.2.5PBS分别按顺序稀释Na2HPO4 1.07 g，KH2PO4 0.39 g，NaCl 8.5 g，用HCl调节pH至7.2～7.4，用1 000 mL容量瓶进行定容，高压灭菌，在4 ℃下保存。

    1.3实验方法

    1.3.1中草药水提液样品制备的处理将8种中草药用天平称取各10 g，置于烘箱中50 ℃烘烤 24 h，用中草药粉碎机粉碎，接着过目筛，装入自封袋中（保证药物不能漏出自封袋），置于室温干燥保存。将制得的中药分别加入500 mL烧杯中，加入300 mL蒸馏水，浸泡30 min，开大火煎煮30 min之后，另外加入200 mL蒸馏水，小火煎煮60 min，倒出药液，加入100 mL蒸馏水对药渣继续煎煮30 min，倒出药液混合第一次倒出的药液。浓缩至20 mL，保证原药为0.5 g/mL。将浓缩之后的药液进行离心处理，转速为8 500 r/min，离心30 min，取上层清液，过0.45 μm无菌过滤膜，制成0.5 g/mL的中草药提取液样品。

    1.3.2杂交鲟血液样品的的制备取杂交鲟鱼1条，用丁香酚（1 L水体中加入0.05 mL的丁香酚）进行麻醉处理， 用含有0.3 mL肝素（浓度：1 500 U肝素溶于1 mL PBS中）的10 mL—次性注射器取血。将所有血液混合，加入等体积的细胞培养基（L-15）。另取10 mL离心管，加入1.5 mL密度梯度分离液，沿管壁缓慢加入3 mL稀释后的血液，室温800 g离心20 min；取中间白细胞层于新离心管，加1 mL L-15IV轻轻混合均匀；取20 μL细胞，加入等体积的0.2%台盼蓝（W/V，使用前与4.25%NaCl按4∶1混合），显微镜下数数得到细胞悬液初始浓度；用 L-15IV将其稀释成2×107 cell/mL作氧负离子检测、5×106 cell/mL作吞噬活性检测。

    1.3.3金黄色葡萄球菌悬液的制备金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）的冻干粉购于北纳创联生物技术有限公司，其培养基的各组分如表2所示。

    表2金黄色葡萄球菌的培养基成分

    培养基成分名称 含量 牛肉膏3～5 g 蛋白胨10 g NaCl5 g 琼脂20%～25%培养基按照上述成分制备，高压灭菌之后，倒平板，冷却至室温。

    （1） 操作准备：冻干管的顶部为熔封处，管身贴有标签，底部为冻干菌粉。打管前应于4 ℃保存，使用时去除标签，用75%酒精擦拭管壁，移入安全柜操作。

    （2） 打管：用75%酒精擦拭，将冻干管顶部置于火焰灼烧。后迅速滴加无菌水使得管壁破损，用镊子轻轻敲去碎玻璃即可。

    （3） 将0.3 mL左右无菌水或培养基注入冻干管中，吹打，充分溶解成菌悬液。吸取菌悬液，打入1～2个试管或平板，或50 mL液体培养基中，在菌种说明书中规定条件下培养。

    （4） 培养成功后根据需要直接使用或接种10%接种量液体培养。

    （5） LB培养基配制：950 mL去离子H2O加蛋白胨10 kg、酵母提取物5 g、NaCL 10 g定容至1 000 mL，再加琼脂15 g/L，最后高温高压灭菌。

    （6） 将金黄色葡萄球菌接种于淡水鱼类琼脂培养基（FWA）斜面上，28 ℃下培养24～48 h。

    （7） 用无菌生理盐水（0.65%，W/W）洗下菌落，并稀释成一定浓度。

    （8） 加入终浓度为1%的福尔马林，28 ℃灭活24 h，用无菌生理盐水清洗3次，调整细菌浓度到1×108个/mL，保存于4 ℃冰箱中备用。

    1.3.4氧呼吸爆发活性检测氧呼吸爆发活性使用试剂盒进行测定，操作过程见表3。

    计算公式为：

    抗超氧阴离子活力单位（U/L）=对照OD值-测定OD值对照OD值-标准OD值×标准品浓度（0.15 mg/mL）×1 000 mL×样品测试前稀释倍数

    数据的处理和分析，采用Excel和OriginPro5.0软件对获得的实验数据进行处理及分析。

    1.3.4白细胞吞噬活性的检测

    根据孙晓飞等[17]等的实验方法进行本次实验操作，操作步骤如下：

    从鲟鱼鳃动脉采血1 mL，置于含0.5 mL肝素溶液（2%，W/V）的试管中混匀，加入约0.5 mL的金黄色葡萄球菌悬液，充分混匀后于25 ℃下水浴60 min。水浴期间每隔10 min摇匀1次。取上述混合液涂片，每个血样涂2片。晾干后滴加甲醇固定5～7 min，蒸馏水冲洗，Giemsa染色1～1.5 h，自来水冲洗后再用蒸馏水冲洗，晾干。试验重复2次。吞噬活性以吞噬百分比（PP）和吞噬指数（PI）表示，分别计算吞噬百分比和吞噬指数，计算公式如下：

    吞噬百分比（PP）=100个吞噬细胞中参与吞噬的细胞数/100×100%

    吞噬指数（PI）=吞噬细胞内的细菌总数/参与吞噬的吞噬细胞数

    2结果

    2.1中草药对杂交鲟鱼氧呼吸爆发活性的影响

    通过采用杂交鲟的离体外周血和中草药的水提液进行共同孵育后，运用抗超氧阴离子试剂盒测定其抗超氧阴离子，根据分光度的值可判断中草药对杂交鲟外周血白细胞氧呼吸爆发活性的影响。根据“检测抗超氧阴离子自由基或产生超氧阴离子自由基试剂盒”的检测原理吸光度大的产生抗超氧阴离子，抗超氧阴离子单位的值就越小。由图1可知，本次实验所采用的苦参、茵陈、杜仲、淫羊藿、茯苓、紫草、甘草。生地等八种中草药中，只有生地的抗超氧阴离子单位的OD值比未添加中草药的对照组低；其余七种中草药均比未添加中草药的对照组高。数据统计结果如图1所示。

    2.2中草药对杂交鲟鱼吞噬活性的影响

    通过采用白细胞对金黄色葡萄球菌具有吞噬能力的原理，进行涂片、Giemsa染色等手段测定中草药与杂交鲟外周血共同孵育后，外周血白细胞的吞噬活性。吞噬活性以吞噬百分比和吞噬指数共同决定，由图2可知，所采用的8种中草药与杂交鲟外周血共同孵育后所测的吞噬百分比只有茵陈、杜仲高于未添加中草药的对照组，其他均低于对照组；而吞噬指数中，只有添加苦参、杜仲、茯苓、生地四种中草药的组别高于未添加中草药的对照组，其余四种中草药添加的组别均低于未添加中草药的对照组。吞噬百分比和吞噬指数的数据处理结果分别如图2、图3所示。

    3分析与讨论

    关于用中草药代替激素，合成药物作为动物的免疫增强剂，促进动物的生长和抗病的作用，国内外已有学者进行了研究，并得到了可实施性的研究结果。张耀武[3]在复方中草药制剂浓度分别为0.5%、1.0%、2.0%础饲料的中，持续投喂了60 d过后，根据测定实验的黄颡鱼的血清溶酶活性、生长性能、血细胞的吞噬活性等指标，比较中草药制剂对黄颡鱼非特异性免疫功能的影响。结果表明，浓度为0.5%的复方中草药制剂对黄颡鱼的生长影响显著；浓度为1.0%、2.0%的復方中草药制剂对黄颡鱼的溶酶菌活力和吞噬活性影响极显著，对于血清溶酶活性、生长性能、血细胞的吞噬活性实验组能显著提高。张照红[11]用三个不同剂量的黄芪等七味复方中草药奥尼罗非鱼进行投喂，结果表明，投喂到45 d，60 d时，1.0%、1.5%的复方中草药添加组可以显著地提高奥尼罗非鱼的绝对增重量；1.0%、1.5%的添加组队奥尼罗非鱼的脾脏指数程度最大；投喂到30 d时，1.0%、1.5%的添加组对血液中白细胞的吞噬百分率（PP）得到了显著或者极显著的提高；到45 d时，血液中白细胞吞噬指数（PI）得到了显著提高；李华[8]等将牛膝、板蓝根、甘草、陈皮、肉桂、麦芽、神曲 7 味中草药按一定的比例混匀，以2%、4%、6%的质量分数添加到基础饲料中连续投喂大菱鲆，结果表明，4%的浓度组对大菱鲆的血清溶酶菌活力和抗菌活力有显著升高（ P<0.05），4%的浓度组对鱼血清补体C3含量有显著升高（ P<0.05）。攻毒试验表明，4%浓度组的存活率最大，对提高大菱鲆的非特异性免疫力和抗病力效果最为显著的是4%浓度组。盛竹梅[1]等用麻黄、苦参、黄芩、五倍子、紫苏、石榴皮6余味中草药制成复方制剂，按照0.5%、20%、4.0%的比例对鲫鱼进行注射式给药，结果表明，浓度越大血清杀菌活性越高，4.0%浓度组的NBT阳性细胞数差异显著，鲫鱼的非特异性免疫功能能被该复方中草药制剂有效地提高。孙晓飞，郭伟良，谢珍玉等[17]用39中草药对石斑鱼采用离体外周血白细胞与中草药提液共同孵育法，对棕点石斑鱼进行免疫增增强剂的快速筛选。结果表明，39种中草药中有10种对棕点石斑鱼白细胞氧呼吸爆发性显著提高15%，有3种草药可以同时提高棕点石斑鱼的氧呼吸爆发活性和吞噬活性，分别为墨旱莲、鸡血藤、黄柏。