血鹦鹉鱼Mitfa基因表达qPCR分析的引物设计与评估

    尚东维 李景龙 石洪玥 孙学亮 方珍珍 季延滨 陈成勋

    摘要：MITF，即小眼畸形相关转录因子 （microphthalmia-associated transcription factor），其在黑色素细胞的发育和分化中具有核心的调控作用。为了解色素相关基因和体色之间的关系，应用分析血鹦鹉的表达谱，采用实时荧光定量PCR（qPCR）技术技术，从血鹦鹉（Amphilophus）鱼鳍与鱼皮中提取RNA，通过Primer 5软件设计扩增血鹦鹉Mitfa基因片段的引物并进行qPCR评估，为血鹦鹉Mitfa基因表达的qPCR分析奠定了基础。

    关键词：血鹦鹉鱼；Mitfa；实时荧光定量PCR

    鹦鹉鱼（Amphilophus）中的商业品种有血鹦鹉、元宝红、金刚鹦鹉等，其中血鹦鹉最具代表性，最为普及，是目前在我国生产量和消费量最多的热带鱼之一[1]。因其色彩艳丽，嘴型酷似鹦鹉嘴型而得名。血鹦鹉鱼体形近似球形或卵圆形，背圆、尾鳍发达，全身几乎血红色，长着三角嘴，受到鱼迷们喜爱[2]。血鹦鹉（Cichlasoma citrinellum♀×C.synspilum♂），鲈形目（Perciformes）。幼年呈灰白的体色，成年呈粉紅或血红色，鱼体体态臃肿，成鱼体长15～20 cm，体形宽厚，呈椭圆形。

    关于鱼类色素细胞的分类，目前普遍认为主要有红色素细胞、黄色素细胞、虹彩细胞、黑色素细胞这4种类型的鱼类色素细胞[3-4]。目前已知能调控黑色素合成的有三种信号通路：腺苷酸环化酶、酪氨酸激酶、蛋白激酶，可见，对于黑色素合成的这三种信号通道来说，黑色素细胞的增殖或黑色素颗粒的形成可通过激活其任意通路而被激活成功[5]。黑色素颗粒体现为黑色主要是由于其吸收了特定的波长光，这一过程中有多巴胺和酪氨酸参与，在一系列复杂的反应后合成[6]。具体过程可简化为酪氨酸-多巴-多醌-多巴色素-5，6-二羟基吲哚酸或5，6-二羟基吲哚-5，6吲哚醌-真黑素[7]。

    黑色素细胞普遍存在于动物的体表皮肤中，其中内含黑色素颗粒，色调介于褐色至黑色区间内，可溶于细胞质中。Mitf基因在鱼类色素细胞分化和成熟过程中有着很大的作用，与黑色素细胞分化而言是其重要的转录因子[8]。

    Mitf来源于神经嵴细胞。Mitf基因至少有6个异构体分别是Mitf-A、-B、-C、-D、-H和-M，这是通过蛋白氨基酸端的不同来区分的[9]。Mitf基因可以被剪切或者突变，可使其第一个外显子出现差异，从而出现编码不同氨基端结构的结果[10]。研究表明，Mitf-A在视网膜色素上皮细胞等多种培养细胞中有表达，其中瞬时共转染实验表明了Mitf-A可激活酪氨酸激酶和相关蛋白基因[11]。另有研究表明，酪氨酸基因家族的表达也可以通过Mitf基因调控[12]。

    实时荧光定量 PCR（ real-time fluorescence quantitative PCR，RT-PCR） 是一种核酸定量分析技术，以其特异性强、灵敏度高、重复性好、定量准确、速度快、全封闭反应等优点成为了分子生物学研究中的重要工具。其原理为通过探测PCR反应中荧光信号的变化，获得特定区段中扩增产物的定量结果[13-15]。

    本文应用实时荧光定量PCR（qPCR）技术分析血鹦鹉Mitfa基因的表达，旨在为分析血鹦鹉Mitfa基因的表达机理奠定基础。

    1材料和方法

    1.1试验鱼

    试验用鱼取自天津宝坻里自沽嘉禾田源养殖基地，解剖取出其皮、鳍，液氮中迅速冷冻后置于-80 ℃冰箱保存备用。

    1.2总RNA提取

    分别取血鹦鹉的鳍和皮，加入200 μL的RNA iso Plus，在组织破碎仪中4 500 r/min 6～10 min，再加入1 mL RNA iso Plus，静置5 min，4 ℃ 12 000 r/min 离心5 min，取其上清1 mL移入新离心管中，加入200 μL氯仿混匀，静置5 min，4 ℃ 12 000 r/min 离心15 min，取上清加入500 μL异丙醇，放置10 min，4 ℃ 12 000 r/min 离心10 min，加入75%乙醇1 mL，4 ℃ 12 000 r/min 离心5 min，弃乙醇，保留沉淀并将沉淀干燥2～5 min后，溶于DEPC中，充分溶解后，保存在-80 ℃冰箱中。溶解后用超微量紫外分光光度计于260 nm和280 nm波长下测定RNA溶液的吸光值分析纯度，最后再用1%的普通琼脂糖凝胶、5 V/cm的恒压电泳分离提取出的RNA，凝胶成像系统观察与拍照。

    1.3cDNA第一条链的合成

    依照反转录试剂盒的说明书进行试验，在离心管中加入1 μL Oligo dT Primer，1 μL dNTP Mixture，计算好标定为1 000 mg/μL的提取得到的RNA模板溶液，再加上ddH2O配平至10 μL，放入65 ℃水浴锅中反应5 min，迅速冷却，加4 μL 5×Prime ScriptⅡBuffer，0.5 μL RNase lahibitor，1 μL Prime Script Ⅱ RTase与离心管中，最后加入4.5 μL ddH2O于45 ℃水浴中反应45 min，95 ℃水浴5 min，冷却，最后将得到的cDNA产物放入-20 ℃冰箱中保存备用。

    1.4引物的设计、常规PCR的筛选

    依据GenBank公布的橘色双冠丽鱼基因序列信息（GenBank检索号：AY206404.1），应用Primer 5.0设计引物（引物见表2），引物合成由生工生物工程（上海）股份有限公司完成。

    选取任意个体的皮、鳍的cDNA进行Mitfa基因片段的常规PCR扩增。扩增体系为反转录好的cDNA 1 μL，10×PCR Buffer 2.5 μL，ddH2O 15.3 μL，dNTP 2 μL，测试上游引物、测试下游引物各2 μL，Taq 0.2 μL，共25 μL于离心管中，扩增条件为：94 ℃预变性5 min，94 ℃变性30 s，一定退火温度退火30 s，72 ℃延伸1 min，共循环35次。PCR产物经1%的琼脂糖凝胶、5 V/cm的恒压电泳分离，凝胶成像系统观察与拍照。

    通过双向测通的方法对得到的 Mitfa基因的单一PCR 扩增产物进行双向测序（生工生物工程（上海）股份有限公司）。

    1.5qPCR 引物的设计与评估

    依据本试验获得的Mitfa序列以及qPCR扩增的引物设计原则，对用于qPCR分析的引物，经过常规PCR检测后，进行qPCR扩增。

    扩增体系如下：6 μL ddH2O、0.4 μL ROX Ⅱ、0.8 μL正向引物、0.8 μL反向引物、2 μL模板和10 μL SYBR。扩增循环：95 ℃预变性3 min，95 ℃变性15 s，退火温度30 s，72 ℃延伸25 s，共进行40个循环。

    优化退火温度：根据引物的Tm值，设置不同梯度的退火温度，对Mitfa的基因片段进行qPCR扩增。每个反应进行3个技术重复，并设置阴性对照（模板cDNA由ddH2O替代 ）。

    标准曲线的建立：以cDNA原液为最高浓度，采用10倍稀释法获得5个不同浓度的cDNA模板进行qPCR 扩增。每个反应进行3个技术重复，并设置阴性对照（模板cDNA由ddH2O替代）。

    2结果与分析

    2.1总RNA的提取及检测结果

    血鹦鹉鳍、皮2种组织的总RNA经检测显示28s rRNA、18s rRNA条带亮度比值在1～2之间（图1），OD260/OD280均在1.8～2.0之间。

    2.2引物设计、常规PCR筛选及扩增子的验证结果

    依据GenBank检索的基因序列，应用Primer 5.0设计得出的引物中，筛选出1对最适引物进行PCR 扩增，见表1。

    以血鹦鹉鳍、皮2种组织的cDNA为模板，对表1显示的引物进行常规PCR扩增筛选。图2显示：引物Mitfa-F、Mitfa-R的扩增产物仅有一个扩增条带，测序序列包含引物为311 bp。

    皮2、鳍1、鳍2的扩增产物电泳图谱对普通PCR扩增后所得的单一产物进行测序，所得序列片段长度为311 bp。对测序所得的Mitfa序列进行 BLAST比对，结果表明：测序所得Mitfa基因与已报道的布氏鲷Mitfa的cDNA序列（序列号：AB178923.1）同源性为97%；与已报道的尼罗罗非鱼 Mitfa的cDNA序列（序列号：AB178918.1）同源性为97%；与已报道的三湖慈鲷Mitfa的cDNA序列（序列号：AB178924.1）同源性为96%；与已报道的红剑齿丽鱼Mitfa的cDNA序列（序列号：AB178921.1）同源性为 96%；与已报道的黄金雀鱼Mitfa的cDNA序列（序列号：AB178920.1）同源性为 96%（均见表2）。

    （A）、融解曲线（B）和标准曲线（C）

    3讨论

    在运用实时荧光定量 PCR方法检测特异基因表达量的差异时，总RNA的质量是关键。若总RNA被降解，则mRNA的完整性得不到保证，进而不能真实反映起始模板中基因表达量的差异。因此，检查每个RNA样品的完整性和纯度十分重要，通过琼脂糖或甲醛变性电泳分析证明，若总RNA完整则一般在电泳图上会出现两条带28 s和18 s[16]。在反转录之前，总RNA的定量也是实验的关键步骤，通过测定RNA的量来调平起始模板浓度，进而真实反映基因表达的实际情况[17]。

    引物設计的原则：引物的长度一般为15～30 bp，最好在18～24 bp， 因为太短易形成错配 （Falsc priming）降低特异性，而太长也会降低特异性，并且降低产量[18]。引物序列的GC含量最好在40%～60%，且上下游引物序列GC含量的差异不要太大，3端最后5个碱基最好不要富含GC，特别是连续3个G或C。如果以DNA为模板设计引物，产物长度在100～600 bp比较理想。而当模板为mRNA时，设计引物其产物长度则在150～300 bp为宜。

    为了客观地比较不同样本中目的基因表达量的多少，消除由于反转录时总RNA浓度差异造成的误差，要选择合适的内参基因，其中常用的有β-actin，18s rRNA。我们可以根据实际情况的不同，选择不同的内参基因作参照[19]。根据杨桂梅、鲍宝龙[20]得出的实验结果显示，GAPDH可能与鱼体的变态有关；而β-actin基因表达量在发育各期变化幅度不大，相对较稳定，表现出适宜成为管家基因的特点。

    引物进行最终的评估要求有：一是PCR扩增的特异性和效率。经过PCR条件优化后能否获得特异性条带，即无目的条带之外的多余条带。另外，PCR产物的量是否足够，即不出带和条带很弱的现象。二是以DNA为模板设计引物时，PCR扩增产物是否与预期PCR产物大小相当。如果相差太大（大于100 bp），有可能是错配产物。三是是否形成引物二聚体带[21]。

    PCR反应的特异性是由一对上下游引物所决定的。引物的好坏往往是 PCR反应成败的关键。根据目的基因的mRNA序列正确设计引物，除满足引物设计的基本要求外，还应考虑目的基因和内参引物的预期退火温度，二者应尽量相符。

    引物除了具有扩增特异性外还应具有良好的扩增效率。qPCR的扩增效率一般通过建立标准曲线来确定。扩增标准为其扩增效率达到90%～105%，且扩增曲线间隔均匀、标准曲线的决定系数（R2）>0.980[22-23]。

    本试验中：前期RNA样本的28 s/18 s rRNA的条带亮度比值在1.0～2.0之间，表示了RNA完整性良好，OD260/OD280的数据结果也显示出了RNA的纯度。在反转录为DNA前，均先将需反转录的RNA的浓度均标定为1 000 mg/μL，再进行的后续的反转录试验。在引物设计上，设计引物的理论值为311 bp。在内参基因方面，本实验选取β-actin作为试验的内参基因，同时也选取与内参基因退火温度相一致的目的基因进行后续实验。结果显示引物Mitfa2在qPCR扩增时，融解曲线为单一尖锐峰；标准曲线分析显示：引物的扩增效率为101.5%，R2值为0.989。上述结果说明该对引物具有良好的扩增特异性和扩增效率，满足了qPCR扩增的要求。

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