草鱼凝集素分子的基因克隆与进化分析
米亚双++程传波
草鱼是我国重要的养殖淡水鱼，其产量以及产值居于鱼类养殖业的前列。凝集素是一类具有糖结合专一性，并与之非共价可逆结合的非酶、非免疫来源的蛋白质，其中把活性依赖于Ca2+者称为C型凝集素。C型凝集素都具有一个或多个糖结构识别域（Carbohydrate-recognition domain，CRD）。鱼类中所存在的天然凝集素分子在其非特异性免疫中占据重要地位，是鱼类抵御异己物质入侵的一道防线。
材料与方法
材料。在超市购买健康的草鱼，体长大约为30cm，体重为1.47kg。
方法。（1）草鱼凝集素基因的克隆：从草鱼组织中提取草鱼RNA，并通过RT-PCR技术克隆获得草鱼凝集素基因。采用反转录试剂盒合成cDNA。以草鱼的cDNA为模板，根据已设计好的引物，运用PCR技术获得草鱼凝集素基因。根据草鱼凝集素的保守CRD设计引物，CILECF：ATGGAAGATATTGAAAATTACACCA，CILECR：GATATCATGTTAAGTGTGTGATAGGATCCATCTC。PCR反应条件为：95℃预变性5min；95℃变性30s；56℃退火40s；72℃延伸40s；25个循环，72℃延伸10min。最后，通过1%琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物。（2）TA克隆：将PCR产物与pEASY-T1Simple vector载体连接。链接产物转化DH5α感受态，挑单克隆进行菌落PCR鉴定。将鉴定的阳性克隆送至南京金斯瑞生物科技有限公司测序。（3）构建进化树：在GenBank中查找不同物种C型凝集素，下载其氨基酸序列。利用SMART对各物种凝集素的二级结构中的结构域进行了初步分析。用Clustalx软件对所选物种的凝集素CRD的氨基酸序列进行多重序列比对。再结合分子生物学分析软件MEGA4.0将比对结果以邻接法（NJ法）构建系统进化树。
结果
草鱼凝集素基因克隆结果。实验结果显示在草鱼肝和肠组织中扩增出800bp左右的片段，与预期一致。
草鱼凝集素基因全长序列分析。用生物信息学在线分析软件对草鱼凝集素基因的测序结果进行分析（如图1），草鱼凝集素基因的开放阅读框的长度为为795bp，编码一个由264个氨基酸残基组成的蛋白质，其蛋白质的相对分子质量为29868.1，等电点为5.03，46～68aa为跨膜区，125～256aa为CRD。氨基酸序列上的第125、136、153、232、247、255位置上含有6个高度保守的半胱氨酸残基（三角内），并且该凝集素只有一个CRD（下划线部分）。氨基酸序列还含有一个结合甘露糖的糖识别结合位点即EPN基序（椭圆内）和一个作为C型凝集素重要标志的WIGL序列（矩形内）。
草鱼凝集素的系統进化分析。用生物信息学MEGA4.0以邻接法（NJ法）构建草鱼，斑马鱼，鲫鱼，雀鳝，原鸡，家鼠，牛，人等C型凝集素蛋白的系统进化树。从图2可以看出系统进化树分为三大支，草鱼同斑马鱼，鲫鱼，雀鳝，白斑狗鱼，虹鳟，大西洋鲑进化关系较近，处于一支，说明C型凝集素在进化过程中，草鱼同硬骨鱼的亲缘关系较近，其中与斑马鱼的关系最近。
草鱼凝集素基因的同源性分析。用DNAMAN对所选物种凝集素的CRD进行多序列比对发现，草鱼凝集素CRD与斑马鱼凝集素CRD的相似度达到90%，同鲫鱼、雀鳝、大西洋鲑和虹鳟的相似度分别达到83%、63%、53%和51%。序列比对结果进一步验证了在草鱼的CRD中存在6个保守的半胱氨酸（用箭头标出）残基和一个甘露糖结合位点EPN基序（用棱形标出），并且在这几种硬骨鱼凝集素的CRD中均存在WIGL序列。由此可以看出，草鱼凝集素的CRD与斑马鱼的同源性最高。
讨论
本研究用Trizol法从草鱼组织中提取RNA，通过RT-PCR技术克隆获得草鱼凝集素基因的开放阅读框的长度为795bp，编码了一个由264个氨基酸残基组成的蛋白质。生物信息学软件分析发现，用SMART对该蛋白质的结构进行分析，发现草鱼凝集素蛋白是由一个跨膜区（46～68aa）和一个CRD（125～256aa）组成，且CRD位于该蛋白的C端，含有六个保守的半胱氨酸残基，由此可以判定草鱼凝集素的CRD属于标准长型CRD。从其序列分析来看，在草鱼凝集素的CRD上存在一个WIGL基序和甘露糖结合位点即EPN基序，因此可以确定该凝集素是一种C型凝集素。同源性分析表明，草鱼与斑马鱼的相似度最高，达到90%。从系统进化树分析结果表明草鱼凝集素与斑马鱼的亲缘关系最近。可利用已获得的草鱼凝集素基因作为重组表达的基础，用真核表达系统进行表达纯化，研究其蛋白质的组成及功能，研发出新型的病害治疗药物，应用于草鱼的免疫和病害防御上，实现健康、可持续的养殖。
作者简介：
米亚双（1991-），女，河南南阳人，河南师范大学在读研究生。
草鱼是我国重要的养殖淡水鱼，其产量以及产值居于鱼类养殖业的前列。凝集素是一类具有糖结合专一性，并与之非共价可逆结合的非酶、非免疫来源的蛋白质，其中把活性依赖于Ca2+者称为C型凝集素。C型凝集素都具有一个或多个糖结构识别域（Carbohydrate-recognition domain，CRD）。鱼类中所存在的天然凝集素分子在其非特异性免疫中占据重要地位，是鱼类抵御异己物质入侵的一道防线。
材料与方法
材料。在超市购买健康的草鱼，体长大约为30cm，体重为1.47kg。
方法。（1）草鱼凝集素基因的克隆：从草鱼组织中提取草鱼RNA，并通过RT-PCR技术克隆获得草鱼凝集素基因。采用反转录试剂盒合成cDNA。以草鱼的cDNA为模板，根据已设计好的引物，运用PCR技术获得草鱼凝集素基因。根据草鱼凝集素的保守CRD设计引物，CILECF：ATGGAAGATATTGAAAATTACACCA，CILECR：GATATCATGTTAAGTGTGTGATAGGATCCATCTC。PCR反应条件为：95℃预变性5min；95℃变性30s；56℃退火40s；72℃延伸40s；25个循环，72℃延伸10min。最后，通过1%琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物。（2）TA克隆：将PCR产物与pEASY-T1Simple vector载体连接。链接产物转化DH5α感受态，挑单克隆进行菌落PCR鉴定。将鉴定的阳性克隆送至南京金斯瑞生物科技有限公司测序。（3）构建进化树：在GenBank中查找不同物种C型凝集素，下载其氨基酸序列。利用SMART对各物种凝集素的二级结构中的结构域进行了初步分析。用Clustalx软件对所选物种的凝集素CRD的氨基酸序列进行多重序列比对。再结合分子生物学分析软件MEGA4.0将比对结果以邻接法（NJ法）构建系统进化树。
结果
草鱼凝集素基因克隆结果。实验结果显示在草鱼肝和肠组织中扩增出800bp左右的片段，与预期一致。
草鱼凝集素基因全长序列分析。用生物信息学在线分析软件对草鱼凝集素基因的测序结果进行分析（如图1），草鱼凝集素基因的开放阅读框的长度为为795bp，编码一个由264个氨基酸残基组成的蛋白质，其蛋白质的相对分子质量为29868.1，等电点为5.03，46～68aa为跨膜区，125～256aa为CRD。氨基酸序列上的第125、136、153、232、247、255位置上含有6个高度保守的半胱氨酸残基（三角内），并且该凝集素只有一个CRD（下划线部分）。氨基酸序列还含有一个结合甘露糖的糖识别结合位点即EPN基序（椭圆内）和一个作为C型凝集素重要标志的WIGL序列（矩形内）。
草鱼凝集素的系統进化分析。用生物信息学MEGA4.0以邻接法（NJ法）构建草鱼，斑马鱼，鲫鱼，雀鳝，原鸡，家鼠，牛，人等C型凝集素蛋白的系统进化树。从图2可以看出系统进化树分为三大支，草鱼同斑马鱼，鲫鱼，雀鳝，白斑狗鱼，虹鳟，大西洋鲑进化关系较近，处于一支，说明C型凝集素在进化过程中，草鱼同硬骨鱼的亲缘关系较近，其中与斑马鱼的关系最近。
草鱼凝集素基因的同源性分析。用DNAMAN对所选物种凝集素的CRD进行多序列比对发现，草鱼凝集素CRD与斑马鱼凝集素CRD的相似度达到90%，同鲫鱼、雀鳝、大西洋鲑和虹鳟的相似度分别达到83%、63%、53%和51%。序列比对结果进一步验证了在草鱼的CRD中存在6个保守的半胱氨酸（用箭头标出）残基和一个甘露糖结合位点EPN基序（用棱形标出），并且在这几种硬骨鱼凝集素的CRD中均存在WIGL序列。由此可以看出，草鱼凝集素的CRD与斑马鱼的同源性最高。
讨论
本研究用Trizol法从草鱼组织中提取RNA，通过RT-PCR技术克隆获得草鱼凝集素基因的开放阅读框的长度为795bp，编码了一个由264个氨基酸残基组成的蛋白质。生物信息学软件分析发现，用SMART对该蛋白质的结构进行分析，发现草鱼凝集素蛋白是由一个跨膜区（46～68aa）和一个CRD（125～256aa）组成，且CRD位于该蛋白的C端，含有六个保守的半胱氨酸残基，由此可以判定草鱼凝集素的CRD属于标准长型CRD。从其序列分析来看，在草鱼凝集素的CRD上存在一个WIGL基序和甘露糖结合位点即EPN基序，因此可以确定该凝集素是一种C型凝集素。同源性分析表明，草鱼与斑马鱼的相似度最高，达到90%。从系统进化树分析结果表明草鱼凝集素与斑马鱼的亲缘关系最近。可利用已获得的草鱼凝集素基因作为重组表达的基础，用真核表达系统进行表达纯化，研究其蛋白质的组成及功能，研发出新型的病害治疗药物，应用于草鱼的免疫和病害防御上，实现健康、可持续的养殖。
作者简介：
米亚双（1991-），女，河南南阳人，河南师范大学在读研究生。
