非连续密度梯度离心法分离半滑舌鳎外周血白细胞

    郝爽　罗璋　张振国　刘肖莲　刘国山　冯守明

    

    

    摘要：为研究非连续密度梯度离心法分离半滑舌鳎（Cynoglossus semilaevis Gunther）外周血白细胞的影响因素，探索Percoll分离半滑舌鳎外周血白细胞的最佳方法，试验设置了密度梯度为1.015/1.065 g/mL、1.020/1.070 g/mL、1.025/1.075 g/mL、1.030/1.080 g/mL、1.035/1.085 g/mL的五种分离液，分别于600×g、800×g和1 000×g离心力下进行半滑舌鳎白细胞分离，以所得白细胞密度、白细胞纯度、活细胞率作为评判指标，并对分离的白细胞进行了显微观察、鉴定，比较不同密度梯度分离液、不同离心力的分离效果。结果显示：以1.020/1.070 g/mL密度梯度分离液、800x g离心力条件下分离效果最佳，每毫升外周血可分离到白细胞数量平均为（2.485±0.182）×10个，白细胞纯度平均为（97.926±0.679）%，活细胞率平均为（97.037±0.925）%。

    关键词：非连续密度梯度离心；外周血白细胞；半滑舌鳎（Cynoglossus semilaevis Giinther）

    随着水产动物疾病防治技术的发展，离体细胞作为具有生物活性的体外试验材料，越来越多应用在水产动物免疫学、病毒学、生理学和药物学等多个领域。相比于传统方法，基于细胞水平开展试验研究具有样品需要量少、筛选效率高、周期短、规模大等特点，因此开展水产动物细胞分离培养在理论研究和实际应用方面都具有重要意义。外周血白细胞具有类似T、B淋巴细胞的分类，是鱼类体液免疫和细胞免疫的重要组成部分，要研究机体的免疫机制，获得数量充足、质量好的白细胞是前提条件。

    鱼类属于低等脊椎动物，不同鱼类的血液指数和血细胞组成不同，细胞分离条件也存在许多差异，导致鱼类外周血白细胞分离方法没有统一标准，必须针对研究对象调整分离条件，才能达到细胞的最佳分离效果。半滑舌鳎（Cynoglossus semilaevis Gtinther）生长速度快，适应性强，经济价值高，是天津市工厂化养殖的支撑品种之一，作为沿海主要养殖鱼类，具有广阔养殖前景和重要研究意义，近年来对该鱼种的各类研究中，较少提到分离过程对目的免疫细胞分离效果的影响，致使各研究中提及的分离条件不统一，存在差异。Percoll是一种经聚乙烯吡喀烷酮（PVP）处理的硅胶颗粒，其扩散常数低，形成梯度十分稳定，对细胞无毒害，广泛应用于分离细胞、亚细胞成分、细菌及病毒等。本试验利用Percoll非连续密度梯度离心技术分离半滑舌鳎外周血白细胞，针对分离过程中相关影响因素进行研究，初步探索细胞分离最佳条件，获得的白细胞数量充足、质量好，建立了较为可靠、稳定、快速的半滑舌鳎外周血白细胞分离技术，为进一步应用离体免疫细胞开展该鱼种免疫学、病毒学等相关研究打下基础。

    1材料与方法

    1.1试验用鱼

    本试验所用半滑舌鳎，购自天津市乾海源水产养殖有限公司，选择健康、体表鳞片完整无脱落、体重（1200±100）g，全长（38.0±2.0）cm的个体，从养殖场充氧运回暂养于海水循环水养殖系统中，水温（20±1）℃，盐度20‰，连续充氧。每天两次按鱼体重2%～3%投喂基础饲料，暂养观察7 d，证实无病后用于试验。

    1.2主要试剂与仪器

    硅石-聚乙烯吡咯烷酮（Percoll）（P1644，Sigma）、L-15培养基（10-045-CVR，Corning）、特级胎牛血清（FCS）（13011-8611，四季青）、台盼蓝（A601140，生工生物）、NaCl（S8210，索莱宝）、青霉素/链霉素溶液（SIP）（B540732，生工生物）、冷冻高速离心机（5810R，Eppendoff）、荧光倒置显微镜（DM13000B，Leica）、生物安全柜（BIOSQ-fel2，Heal force）。

    1.3试验用试剂配制

    8.5%NaCl溶液：8.5 g NaCl溶于蒸馏水中，定容至100 mL，120℃20 min高压灭菌，4℃保存。半滑舌鳎白细胞培养基：FCS经56℃30min灭活，0.22um滤膜除菌，向L-15细胞培养液中加入5%FCS和1%S/P，密封4℃保存。4%台盼蓝：称取4 g台盼蓝粉末充分研磨，加入100 mL蒸馏水溶解于棕色玻璃瓶中避光保存，使用前加9倍PBS稀釋。不同密度细胞分离液各配制10 mL，具体配方见表1。

    1.4外周血白细胞的分离与收集

    半滑舌鳎经麻醉后进行体表消毒，无菌环境下使用含有抗凝剂的注射器从鱼体尾静脉取血，在无菌离心管中加入等体积细胞培养液稀释，制成血液样品。预先用FCS润洗15 mL无菌离心管壁，不同离心管中各加入2 mL密度梯度为1.065 g/mL、1.070 g/mL、1.075 g/mL、1.080g/mL、1.085 g/mL的分离液，再向上述离心管中，分别依次用微量移液枪沿管壁缓慢加入2 mL密度梯度为1.015g/mL、1.020 g/mL、1.025 g/mL、1.030 g/mL、11 035 g/mL的分离液，制备成五种非连续密度梯度分离体系。取稀释血液样品2 mL，沿离心管壁缓慢地叠加到两层细胞分离液的界面上，小心操作不要破坏界面。4℃下，分别于600×g、800×g、1 000×g离心力下离心20 min。收集Percoll梯度界面上的细胞层，加入5倍体积细胞培养液重悬洗涤两次，最后提取的细胞于2 mL培养液中轻轻吹打混匀，制成悬液备用。

    1.5分离效果评价与观察

    分别取不同分离条件下获得的细胞悬液各20uL，与20uL 0.4%台盼蓝染液混合均匀，注入血球计数板上，显微镜下分别按照公式计算：白细胞密度（个/mL）=四个大方格内白细胞总数×1/4×10×稀释倍数、白细胞纯度（%）=（白细胞数/细胞总数）×100%、活细胞率（%）=（活细胞数/细胞总数）×100%。每种比例的混合液平行测定3次。取20 uL细胞悬液滴到载玻片上，盖好盖玻片，在荧光倒置显微镜下，用微分干涉方法进行不同分离条件下获得细胞的形态观察，其它悬液备用。

    1.6数据统计

    试验数据均用平均值±标准差表示，数据分析采用SPSS 13.0软件进行处理。

    2结果

    2.1不同分离条件对白细胞数量影响

    通过比较不同密度梯度分离液和离心力对获得白细胞密度影响，发现相同离心力条件下，白细胞密度分离液密度增长，呈现先增大后减小的趋势，在分离液密度梯度为1.025/1.075 g/mL或1.020/1.070 g/mL时密度最大。其中，当分离液密度梯度为1.020/1.070 g/mL时，在800×g和1 000×g两种离心力下所得细胞密度较高，且二者无显著差异（P>0.05）（见表2）。

    2.2不同分离条件对白细胞纯度影响

    通过比较不同密度梯度分离液和离心力对获得白细胞纯度影响，发现在相同密度梯度分离液处理下，离心力1 000×g所得白细胞纯度较低，与同等条件另外两种离心力结果相比具有显著差异（P<0.05）。其中，离心力800×g分离液密度梯度1.020/1.070 g/mL时白细胞纯度最高，平均達到97%以上（见表3）。

    2.3不同分离条件对活细胞率影响

    离心力和分离液密度梯度是影响细胞存活状态的重要因素之一。在分离液密度梯度相同条件下，1 000×g离心力条件下活细胞率显著低于600×g与800×g离心力处理组（P<0.05）。当离心力条件一定时，活细胞率随分离液密度增长呈现先增大后减小趋势。其中，离心力800×g分离液密度梯度1.020/1.070 g/mL时所得细胞存活率最高，平均达到97%以上（见表4）。

    2.4不同分离条件所得细胞形态观察

    用荧光倒置显微镜观察不同分离条件下提取的细胞，其中分离液密度梯度为1.020/1.070 g/mL时，不同离心力所分离的细胞微分干涉照片，见图1。

    从图1中可以看出，在600×g离心力条件下，分离得到的白细胞纯度较高，但在40倍视野中所看到的细胞数量较少；在800×g离心力条件下，视野中几乎看不到红细胞，白细胞形态完整、边缘光滑，活细胞率高；在1 000×g离心力条件下，白细胞所占比例降低，视野中可见细胞碎片，一些细胞边缘模糊，活细胞率较低。

    3讨论与分析

    白细胞分离技术的优劣既要看该技术分离细胞的得率、纯度和活力，又要看其是否简单易行，分离外周血白细胞有自然沉降法和密度梯度离心法，后者因更为快捷高效而具有广泛的应用。许多学者对应用密度梯度离心法对分离鱼类细胞进行研究报道，通过调整分离液密度等条件有效分离出鲤、鲫鱼、棕点石斑鱼、真鲷、罗非鱼等鱼类的外周血细胞，证实不同鱼类细胞分离条件存在许多差异。

    Percoll非连续密度梯度离心技术，是将Percoil母液进行稀释后，按照密度由高至低向管中逐层添加，常规离心条件下分层液间不发生混合，并在界面间富集大量目标密度范围内的细胞，操作灵活便捷。本研究应用Percoll非连续密度梯度法，通过调整分离条件，对半滑舌鳎外周血白细胞分离效果影响因素进行研究，发现分离液密度梯度和离心力对分离效果影响较大。适当降低分离液密度可以获得纯度和存活率较高的白细胞，离心力过高可能导致活细胞率和细胞纯度降低，综合分析获得细胞的纯度、数量和存活率，发现分离液密度梯度为1.020/1.070 g/mL、离心力800×g条件下，可有效分离半滑舌鳎外周血白细胞，分离的白细胞数量充足且质量好，可以满足进一步研究需要。

    虽然细胞分离过程中分离液密度梯度和离心力大小是影响分离效果的关键因素，但在实际应用和操作中，影响最终分离效果的因素还有很多，例如样品个体差异、采血量、离心时间、环境温度、加样因素等，此外，林梦霞等研究发现，Percoll分离液的密度容易受到温度影响，相比于室温条件，4℃条件下分离液的密度约高出0.002～0.004 g/mL，这对于实际分离效果的影响还有待进一步研究。在实际应用中，因分离的细胞还将用于体外培养与研究，分离过程中从采血至获得细胞悬液必须注意严格控制无菌操作，动作轻柔以免造成细胞损伤。