几种食用地衣提取物抑制幽门螺杆菌活性研究
任梅蓉++王立松++王欣宇+陈晓华
门螺杆菌（Helicobacter. Pylori，H.P）是革兰阴性细菌，与慢性胃炎和消化性溃疡关系十分密切，与胃癌的发生有很大的关联。20世纪90年代以来，国内外学者已经研究出一些治疗幽门螺杆菌的治疗药物，但目前这些药物治疗方案中仍存在许多问题，主要表现在药物治疗费用高，药物严重的副作用，治疗效果不稳定，易产生耐药性等。地衣是共生菌 （子囊菌或担子菌）与共生藻（蓝藻、绿藻）经过漫长的生物演化过程共生联合形成的一类具有高度遗传稳定性的生物有机体。由于地衣共生的特殊性，地衣能够产生许多独有的次生代谢产物，这些独有的產物往往有特殊的活性（3-5）。近年来，地衣代谢物生物活性研究在国际上已经受到了越来越多的关注，但其在幽门螺杆菌活性抑制方面的研究鲜有报道。为了探讨地衣提取物对幽门螺杆菌体外抑制作用，我们选用了云南少数民族常食用的5种地衣，进行体外药物敏感、抑菌浓度和杀菌浓度的测定。
材料与方法
材料。（1）地衣 红雪茶（Lethariella cladonioides）、条衣（Everniastrum cirrhatum）、鹿石蕊（Cladonia rangiferina）、长松罗（Usnea longissima）和青蛙皮（Labaria orientalis）均由中国科学院植物研究所标本馆提供。
（2）试剂 BHIA（脑心浸液固体培养基，Oxoid，Basingstoke，UK），selective supplement（Oxoid，Basingstoke，UK），微需氧发生袋（法国梅里埃），马血清（上海越研生物科技有限公司），实验所用其它试剂均为分析纯。
方法。（1）菌种活化及培养。H. Pylori菌种由江南大学食品科学与工程重点实验室提供。经快速尿素酶、涂片革兰染色、氧化酶和触酶鉴定为阳性后，传代培养为实验菌株。采用微需氧袋达到微需氧条件（85%氮气、10%二氧化碳和5%氧气），Hp菌株接种于含有8%马血清的脑心浸液培养基中于37℃孵育72小时天，洗下菌落，采用比浊法计数，配置成含菌浓度为3*109/ml 的菌液。
（2）地衣提取物制备。将粉碎后的地衣样品用8倍体积丙酮和甲醇浸泡24小时，提取3次，合并提取液，旋转蒸发浓缩得到100mg/ml浓度的实验母液，置于冰箱中待用。倍比稀释法配制药物溶液，浓度分别为100mg、50mg、25mg、12.5mg和6.25mg/ml。取无菌6mm滤纸片，于上述药液中浸泡过夜，干燥备用。
（3）地衣提取物抑制H.p活性筛选。制备好的H.p菌悬液用L型玻棒均匀涂布在培养基上，将前一天制备好的含有1mg提取物的6mm滤纸片放于培养基上，培养72小时，培养方法同前，观察抑菌圈大小，取抑菌圈直径的平均值。
（4）药物敏感性试验。将含有不同浓度梯度提取物的纸片放于已涂布H.p的培养基上，在微需氧环境中培养72小时后，观察抑菌圈大小，参考相关文献制定药敏结果判定标准，可分为高度敏感：抑菌圈直径>15mm；中度敏感：10mm<抑菌圈直径<15mm；低度敏感：抑菌圈直径<10mm，不敏感：无抑菌圈。统计时，将无效、低敏算作耐药，中敏和高敏定位为敏感。
（5）MIC值测定。在药敏实验的基础上进行最低抑菌浓度的测定（2）：用培养基将药物浓度分别稀释为： 120、60、30、15、6.75、3.75、1.8 mg/ml。分别接种H.p，在相同培养条件下，培养72小时，取出，观察细菌在在不同浓度的药物平板上生长情况，以小于5个菌落的最低浓度为最小抑菌浓度。
实验结果与分析
地衣样品提取物抑制H.p活性初筛结果。五种地衣不同溶剂的提取物中：红雪茶和长松萝的丙酮提取物，长松萝、鹿石蕊、青蛙皮的甲醇提取物均由不同抑制H.Pylori作用；条衣丙酮和甲醇提取物、红雪茶甲醇提取物、鹿石蕊及青蛙皮丙酮提取物均无抑菌活性。
H.p对提取物敏感性实验结果。红雪茶的丙酮提取物为100mg时抑菌圈直径最大，高达15.5mm，高度敏感；为50mg时抑菌圈直径为10.6mm，中度敏感；长松萝丙酮提取物为100mg时，抑菌圈直径为10.3mm，中度敏感；其余的提取物为低度敏感或无敏感性。
MIC测定结果。5种提取物MIC比较见图。结果表明：这5种提取物都对供试菌有不同程度的抑制作用：红雪茶丙酮提取物对H.p的抑菌活性最强，MIC为7.5mg/ml，长松萝丙酮提取物对H.p的MIC为15mg/ml，鹿石蕊甲醇提取物对H.p的MIC为30mg/ml，长松萝和青蛙皮甲醇提取物的MIC均为60 mg/ml。
讨论
H.p的临床治疗方案通常可分为质子泵抑制剂或铋剂加上克拉霉素、甲硝唑、阿莫西林和四环素等抗生素中的2-3种的三联或四联疗法，其较高的治愈率已经达到共识（1）。 但随着对H.p根除治疗的开展，H.p耐药性以及药物副作用等问题逐渐凸显出来。因此寻找新的天然抗菌药物是研究人员需要迫切解决的问题。
生存环境独特的物种，由于受到其他物种的竞争压力和外部环境的影响，极可能产生特殊的防御能力，因而更容易产生结构新颖的活性次生代谢产物。地衣藻菌共生的独特生存方式使其产生了地衣专有的化学物质，但一直以来，由于实验条件、技术、对地衣代谢物质认识的局限性及地衣自身生长缓慢难以得到大量原料的限制，地衣次生代谢物及活性的研究非常缓慢。
本实验采用体外微生物敏感性测定方法，评价和比较了5种云南食用地衣对H.p体外抑菌效果。实验结果表明，5种地衣的不同溶剂提取物对H.p有一定的抑菌效果，抑菌活性依次为：红雪茶（丙酮）>长松萝（丙酮）>鹿石蕊（甲醇）>长松萝（甲醇）=青蛙皮（甲醇）。其中，红雪茶（丙酮）的MIC最小，为7.5mg/ml， 有望进一步进行开发与利用。
本实验结果除了为研究地衣提取物抗菌活性和机理提供了理论依据，为高原地衣生物活性的研究进行数据积累和资料储备，筛选具有良好生物活性和潜在商用及医用价值的地衣物种外，还可为H.p携带者提供一个通过饮食来预防疾病发生的思路。
基金项目：
云南省教育厅科学研究基金项目（项目编号：2013Y111）
门螺杆菌（Helicobacter. Pylori，H.P）是革兰阴性细菌，与慢性胃炎和消化性溃疡关系十分密切，与胃癌的发生有很大的关联。20世纪90年代以来，国内外学者已经研究出一些治疗幽门螺杆菌的治疗药物，但目前这些药物治疗方案中仍存在许多问题，主要表现在药物治疗费用高，药物严重的副作用，治疗效果不稳定，易产生耐药性等。地衣是共生菌 （子囊菌或担子菌）与共生藻（蓝藻、绿藻）经过漫长的生物演化过程共生联合形成的一类具有高度遗传稳定性的生物有机体。由于地衣共生的特殊性，地衣能够产生许多独有的次生代谢产物，这些独有的產物往往有特殊的活性（3-5）。近年来，地衣代谢物生物活性研究在国际上已经受到了越来越多的关注，但其在幽门螺杆菌活性抑制方面的研究鲜有报道。为了探讨地衣提取物对幽门螺杆菌体外抑制作用，我们选用了云南少数民族常食用的5种地衣，进行体外药物敏感、抑菌浓度和杀菌浓度的测定。
材料与方法
材料。（1）地衣 红雪茶（Lethariella cladonioides）、条衣（Everniastrum cirrhatum）、鹿石蕊（Cladonia rangiferina）、长松罗（Usnea longissima）和青蛙皮（Labaria orientalis）均由中国科学院植物研究所标本馆提供。
（2）试剂 BHIA（脑心浸液固体培养基，Oxoid，Basingstoke，UK），selective supplement（Oxoid，Basingstoke，UK），微需氧发生袋（法国梅里埃），马血清（上海越研生物科技有限公司），实验所用其它试剂均为分析纯。
方法。（1）菌种活化及培养。H. Pylori菌种由江南大学食品科学与工程重点实验室提供。经快速尿素酶、涂片革兰染色、氧化酶和触酶鉴定为阳性后，传代培养为实验菌株。采用微需氧袋达到微需氧条件（85%氮气、10%二氧化碳和5%氧气），Hp菌株接种于含有8%马血清的脑心浸液培养基中于37℃孵育72小时天，洗下菌落，采用比浊法计数，配置成含菌浓度为3*109/ml 的菌液。
（2）地衣提取物制备。将粉碎后的地衣样品用8倍体积丙酮和甲醇浸泡24小时，提取3次，合并提取液，旋转蒸发浓缩得到100mg/ml浓度的实验母液，置于冰箱中待用。倍比稀释法配制药物溶液，浓度分别为100mg、50mg、25mg、12.5mg和6.25mg/ml。取无菌6mm滤纸片，于上述药液中浸泡过夜，干燥备用。
（3）地衣提取物抑制H.p活性筛选。制备好的H.p菌悬液用L型玻棒均匀涂布在培养基上，将前一天制备好的含有1mg提取物的6mm滤纸片放于培养基上，培养72小时，培养方法同前，观察抑菌圈大小，取抑菌圈直径的平均值。
（4）药物敏感性试验。将含有不同浓度梯度提取物的纸片放于已涂布H.p的培养基上，在微需氧环境中培养72小时后，观察抑菌圈大小，参考相关文献制定药敏结果判定标准，可分为高度敏感：抑菌圈直径>15mm；中度敏感：10mm<抑菌圈直径<15mm；低度敏感：抑菌圈直径<10mm，不敏感：无抑菌圈。统计时，将无效、低敏算作耐药，中敏和高敏定位为敏感。
（5）MIC值测定。在药敏实验的基础上进行最低抑菌浓度的测定（2）：用培养基将药物浓度分别稀释为： 120、60、30、15、6.75、3.75、1.8 mg/ml。分别接种H.p，在相同培养条件下，培养72小时，取出，观察细菌在在不同浓度的药物平板上生长情况，以小于5个菌落的最低浓度为最小抑菌浓度。
实验结果与分析
地衣样品提取物抑制H.p活性初筛结果。五种地衣不同溶剂的提取物中：红雪茶和长松萝的丙酮提取物，长松萝、鹿石蕊、青蛙皮的甲醇提取物均由不同抑制H.Pylori作用；条衣丙酮和甲醇提取物、红雪茶甲醇提取物、鹿石蕊及青蛙皮丙酮提取物均无抑菌活性。
H.p对提取物敏感性实验结果。红雪茶的丙酮提取物为100mg时抑菌圈直径最大，高达15.5mm，高度敏感；为50mg时抑菌圈直径为10.6mm，中度敏感；长松萝丙酮提取物为100mg时，抑菌圈直径为10.3mm，中度敏感；其余的提取物为低度敏感或无敏感性。
MIC测定结果。5种提取物MIC比较见图。结果表明：这5种提取物都对供试菌有不同程度的抑制作用：红雪茶丙酮提取物对H.p的抑菌活性最强，MIC为7.5mg/ml，长松萝丙酮提取物对H.p的MIC为15mg/ml，鹿石蕊甲醇提取物对H.p的MIC为30mg/ml，长松萝和青蛙皮甲醇提取物的MIC均为60 mg/ml。
讨论
H.p的临床治疗方案通常可分为质子泵抑制剂或铋剂加上克拉霉素、甲硝唑、阿莫西林和四环素等抗生素中的2-3种的三联或四联疗法，其较高的治愈率已经达到共识（1）。 但随着对H.p根除治疗的开展，H.p耐药性以及药物副作用等问题逐渐凸显出来。因此寻找新的天然抗菌药物是研究人员需要迫切解决的问题。
生存环境独特的物种，由于受到其他物种的竞争压力和外部环境的影响，极可能产生特殊的防御能力，因而更容易产生结构新颖的活性次生代谢产物。地衣藻菌共生的独特生存方式使其产生了地衣专有的化学物质，但一直以来，由于实验条件、技术、对地衣代谢物质认识的局限性及地衣自身生长缓慢难以得到大量原料的限制，地衣次生代谢物及活性的研究非常缓慢。
本实验采用体外微生物敏感性测定方法，评价和比较了5种云南食用地衣对H.p体外抑菌效果。实验结果表明，5种地衣的不同溶剂提取物对H.p有一定的抑菌效果，抑菌活性依次为：红雪茶（丙酮）>长松萝（丙酮）>鹿石蕊（甲醇）>长松萝（甲醇）=青蛙皮（甲醇）。其中，红雪茶（丙酮）的MIC最小，为7.5mg/ml， 有望进一步进行开发与利用。
本实验结果除了为研究地衣提取物抗菌活性和机理提供了理论依据，为高原地衣生物活性的研究进行数据积累和资料储备，筛选具有良好生物活性和潜在商用及医用价值的地衣物种外，还可为H.p携带者提供一个通过饮食来预防疾病发生的思路。
基金项目：
云南省教育厅科学研究基金项目（项目编号：2013Y111）
