三株潜在益生菌在凡纳滨对虾苗种培育过程中的应用
于鹏 王腾 于明超 单洪伟 徐涛 马甡
摘 要：以前期工作中筛选得到的三株具有水质调控、弧菌抑制等功能的潜在益生菌株（M6、M51、B8）为研究对象，探究其在凡纳滨对虾幼体培育过程中对水体中氨氮和亚硝氮浓度、弧菌和总菌密度以及幼体生长、成活率的影响。试验设置空白组、培养基组、M6组、M51组以及B8组。结果表明：M6组、M51组、B8组幼体成活率明显高于空白组。在仔虾时期， M6组、M51组、B8组幼体的成活率分别比空白组提高51.29%、6598%、111.32%。M6组、M51组、B8组对虾幼体变态时间整体上要明显短于空白对照组及培养基组。幼体培育结束时，各组幼体的体长关系为：M6组>M51组>B8组>空白组>培养基组。在试验中期M6组、M51组、B8组水体中的氨氮浓度显著低于空白组（P<0.05）；在试验前中期，M6组、M51组、B8组水体中亚硝氮浓度显著低于空白组（P<0.05）。M6组、M51组、B8组水体中总菌的数量高于空白组。综合以上结果，向水体中直接泼洒菌株M6、M51、B8能够有效提高苗种培育期间对虾幼体的成活率，促进幼体生长，缩短幼体变态时间，降低水体中氨氮和亚硝氮的积累。
关键词：益生菌；幼体培育；生长；水质；变态时间
凡纳滨对虾（Litopenaeus vannamei）是一种生长迅速，对环境要求相对较低的对虾养殖品种，自引进中国后发展迅速，在甲壳类养殖品种中稳居产值第一位[1]。我国对虾养殖产量占据了全球年产量的四成左右[2]，是名副其实的对虾养殖大国，因此对于凡纳滨对虾苗种的需求量十分巨大。对虾苗种质量的优劣直接影响对虾在后期养殖过程中的生长速度和成活率，同时也是整个对虾养殖过程成败的重要影响因素之一[3]。
水质调控是对虾苗种生产的关键环节，凡纳滨对虾幼体对水质尤其是水体中氨氮和亚硝氮浓度的要求较高，水体中氨氮和亚硝氮浓度过高会引起幼体的大量死亡[4-6]。此外，弧菌病是当前凡纳滨对虾苗种产业面临的一个很严重的问题，致病弧菌的胞外产物中包含大量的蛋白酶，从而使机体组织发生溶解，引起对虾及幼体产生各种病症，严重时甚至造成对虾及幼体大量死亡[7]。并且弧菌病具有爆发迅速、致死率高、容易传染等发病特点[8-9]，每年弧菌病给苗种行业造成巨大的经济损失。随着水产品药残问题的曝光，过去大量使用的抗生素等化学药品被国家明令禁止，水产养殖业面临着巨大的压力，水产养殖必须要找到一条可持续发展的健康养殖道路。特别是苗种产业，在不使用抗生素等违禁化学药品的前提下，如何调节好水质、抑制致病菌的生长、提高凡纳滨对虾苗种的成活率与质量成为了亟需解决的问题。
益生菌在水产养殖中的应用研究起步较晚，直到1986年益生菌才第一次应用到水产领域，但发展迅速[10]，从益生菌入手解决水质调控、病原控制等已经成为当今水产养殖应用领域的研究热点。益生菌可以通过与病原争夺黏附位点[11]、分泌胞外酶[12]、干扰致病菌群体感应[13]等机理实现调节水质、抑制致病菌的生长、提高宿主免疫机能、抗病毒等功能[14]。目前，在水产养殖方面的益生菌种类包括芽孢杆菌[15]、乳酸菌[16]、气单胞菌[17]、假单胞菌[18]、交替单胞菌[19]、酵母菌[20]等，然而还有很多其他种类功能菌有待进一步开发。
该试验以前期工作中筛选得到的三株具有水质调控、弧菌抑制功能的潜在益生菌（M6、M51、B8）为研究对象，采用向水体直接泼洒菌液的方法，探究其在凡纳滨对虾幼体培育过程中对水体中氨氮和亚硝氮浓度、总菌和弧菌密度以及幼体生长、成活率的影响。此外，该试验首次将麦氏交替单胞菌（Alteromonas macleodii）应用于凡纳滨对虾的幼体培育过程，为今后其他潜在益生菌种类的开发及在对虾幼体培育过程中的应用提供参考。
1 材料与方法
1.1 菌株来源及培养条件
该试验所选用的三株潜在益生菌 （M6、M51、B8）均来自中国海洋大学甲壳动物养殖技术研究室，其中M6 和B8为芽孢杆菌属细菌，M51为麦氏交替单胞菌。三株潜在益生菌培养所采用的液体培养基成份如下：蛋白胨10 g，酵母膏5 g，海水1 L，pH 7.2～7.4；固体培养基成分如下：蛋白胨5 g，酵母膏1 g，琼脂粉20 g，海水1 L，pH 7.2～7.4。在无菌条件下将三株细菌用接种环接至盛有50 mL液体培养基的锥形瓶中，置于摇床（30 ℃）培养24 h，备用。
1.2 试验设计
1.2.1 试验条件 以150 L塑料白桶为养殖容器，试验初期每个桶里放海水70 L，并放无节幼体30 000尾，试验过程中水体体积逐渐增加，最终每桶水体体积为110 L，在试验第11天换水30%，其余时间不换水。随着幼体的不断发育，先后向幼体投喂适量的海链藻和角毛藻、轮虫、卤虫等生物饵料并搭配人工配合饲料。该试验所用海水、凡纳滨对虾无节幼体及各种生物饵料与配合饲料均由青岛海壬水产种业科技有限公司提供。
1.2.2 试验分组 试验共设置空白对照组、培养基组、M6组、M51组、B8组5个试验组，其中，空白对照组不加任何细菌及培养基，培养基组每天向水体中泼洒10 mL液体培养基，M6组、M51组、B8组每天泼洒培养好的菌液10 mL，使相应细菌在水体中的浓度维持在105cfu/mL左右，每个试验组设置4个平行。
1.3 检测指标及测定方法
幼体生长及存活：记录对虾幼体从溞状幼体变态到仔虾的整个过程中各个时期的变态时间，在无节幼体、ZⅡ、MⅡ、P2時对每个试验桶里的对虾幼体进行计数并计算成活率，并在P4时测量每组对虾幼体体长。成活率的测定在保证无光线照射育苗水体的条件下进行，用烧杯量取一定的水体进行点数，以防幼体因为趋光性在水体中分布不均匀。
水质检测：每隔一天检测水质情况，主要包括水体中的氨氮浓度以及亚硝氮的浓度，氨氮浓度的测定采用次溴酸钠氧化法，亚硝氮浓度的测定采用重氮-偶氮光度法。
细菌检测：每天检测水体中弧菌与总菌的数量变化，将水样稀释至适宜倍数后涂板，30 ℃条件下培养24 h后记录菌落的数量，乘以相应的倍数后即每毫升水样中的细菌数量。
1.4 数据分析：
试验数据以平均数±标准差（X±SD）表示，并用SPSS17.0对试验数据进行Duncan多重比较和显著性方差分析，P<0.05表示为差异显著。
2 结果
2.1 对虾幼体的成活率、变态时间及体长
各试验组幼体不同时期成活率如图1所示。在整个幼体培育过程中，空白组幼体成活率呈现直线下降的趋势，且在各时期低于其他各组。从无节幼体发育到溞状幼体期时，各组对虾幼体均呈现下降趋势；在糠虾幼体培育时，M6组、M51组、培养基组的对虾幼体成活率均保持平稳或者缓慢下降的趋势，且M6组、M51组、B8组和培养基组对虾幼体的成活率显著高于空白对照组（P<0.05）；在仔虾期时，M6组、M51组、B8组与培养基组的幼体成活率分别比空白对照组提高了51.29%、65.98%、111.32%、96.86%，B8组与培养基组对虾幼体的成活率显著高于空白组（P<0.05）。
各试验组幼体不同时期变态时间如图2表示。在ZⅠ变ZⅡ、ZⅢ变MⅠ、MⅠ变MⅡ、MⅡ变MⅢ时，M6组、M51组、B8组的对虾幼体变态时间明显比空白组和培养基组短。在ZⅠ变ZⅡ时，培养基组与空白组的幼体变态时间相同，M6组、M51组、B8组幼体变态时间分别比空白组缩短33.33%、16.67%、33.33%；在ZⅢ变MⅠ时，培养基组与空白组的幼体变态时间相同，M6组、M51组、B8组幼体变态时间分别比空白组缩短41.18%、41.18%、17.65%；在MⅠ变MⅡ时，培养基组的幼体变态时间最长，M6组、M51组幼体变态时间分别比空白组缩短28.57%、14.29%，B8组幼体的变态时间与空白组相同；MⅡ变MⅢ时，M6组、M51组、B8组与培养基组的幼体变态时间分别比空白组缩短52.63%、42.11%、5789%、15.79%。
幼体培育结束时，各试验组幼体体长如图3所示。空白组和培养基组的幼体体长差别不大，分别为0.521 cm、0.520 cm；M6组幼体的体长最大，为0.563 cm，比空白组提高了8.06%。各组别对虾幼体的体长关系为：M6组>M51组>B8组>空白组>培养基组。
2.2 水体中氨氮、亚硝氮的浓度变化
各试验组水体氨氮浓度变化如图4表示。试验过程中水体氨氮浓度呈不断增加的趋势。试验前期，空白对照组水体中的氨氮浓度显著低于M6组、M51组、B8组和培养基组（P<0.05）；在试验中期时，M6组、M51组、B8组和培养基组水体中的氨氮浓度低于空白对照组，尤其是在第7天时，M6组、M51组、B8组水体中氨氮浓度显著低于空白对照组（P<0.05）；试验后期由于水质恶化，氨氮和亚硝氮浓度超过危险值，因此采取了换水30%的措施，使水体中的氨氮浓度急剧下降。整个试验过程中，M6组、M51组、B8组水体中的氨氮浓度无显著差异（P>0.05）。
水体中亚硝氮浓度变化如图5所示。试验过程中亚硝氮浓度呈不断增加的趋势。试验的前中期，M6组、M51组和B8组水体中的亚硝态浓度低于空白对照组，尤其是试验第3天和第7天，M6組、M51组、B8组水体中的亚硝氮浓度显著低于空白组（P<0.05）；到了试验后期，由于换水导致水体中的亚硝氮浓度急剧下降。
2.3 水体中弧菌和总菌的变化
试验过程中各组水体中的弧菌数量如图6所示。各组弧菌数量每隔一天会出现一个峰值，M6组和空白组的弧菌数量较少且波动幅度较小，培养基组弧菌数量波动幅度最大，在试验第6天数量急剧上升，然后又急剧下降。除培养基组，水体中弧菌数量均维持在0～5×103 cfu/mL之间。培养基组弧菌数量在0～1.2×105 cfu/mL之间，从整个养殖过程来看，M6组、B8组、空白组水体中的弧菌数量显著低于培养基组的弧菌数量（P<0.05）。
如图7所示，总菌数量在幼体培育过程中呈波浪形缓慢上升的趋势，M6组的总菌数量维持在1.9×102～9.7×105 cfu/mL之间，M51组总菌数量维持在1.9×102～4.8×105 cfu/mL之间，B8组总菌数量维持在1.9×102～3.2×105 cfu/mL之间，培养基组总菌数量维持在1.9×102～3.0×105 cfu/mL之间，空白组总菌数量维持在1.9×102～1.3×105 cfu/mL之间。总体上空白组的总菌数量波动幅度较小且显著低于M6组、M51组、B8组（P<0.05），M6组的总菌数量显著高于其他四个组别（P<0.05）。
3 讨论
3.1 三株潜在益生菌对对虾幼体生长与存活的影响
虾苗的生长发育与成活率等受养殖密度、水质条件、饲喂条件与方式、病害问题、管理模式等多方面的综合影响[21-22]。此外，有试验证明，在育苗过程中添加某些益生菌尤其是芽孢杆菌能够有效促进虾苗的生长发育并提高其成活率[23]。该试验所选用的三个潜在益生菌具有类似的功能，三个潜在益生菌组的对虾幼体成活率、体长等要明显高于空白组，而且B8组的对虾幼体的成活率显著高于空白组，但B8组的对虾幼体体长与空白组相差不大。从整体上看，B8组水体中的氨氮浓度、亚硝氮浓度与弧菌数量都处于一个较低的水平，对虾幼体生活在一个稳定且健康的水体中，这可能就是B8组对虾幼体成活率高、变态时间短的原因。同样，由于成活率高，幼体密度大，空间与饵料竞争作用强烈，因此B8组对虾幼体的个体较小。该试验选用的一株麦氏交替单胞菌M51在提高幼体体长及成活率、缩短幼体变态时间等方面表现出较好的效果，但与其余两株芽孢杆菌相比无明显优势。
3.2 三株潜在益生菌对水体中的氨氮和亚硝氮浓度的影响
随着幼体培育密度不断增大，代谢废物在水体中累积，导致水体压力过大，氨氮和亚硝氮浓度过高，严重危害着对虾幼体的生长发育。目前，已经有许多科研工作者筛选出过具有水质净化功能的益生菌，其中大部分是一些芽孢杆菌[24-27]。该试验所选用的三株潜在益生菌同样具有降解水体中氨氮和亚硝氮的功能，但是在试验前期，空白对照组水体中的氨氮浓度低于三个潜在益生菌组，这可能是由于前期水质清洁，当添加菌液时，菌液中的氨氮使水体中氨氮浓度升高而造成的。
3.3 三株潜在益生菌对水体中的弧菌和总菌密度的影响
在凡纳滨对虾幼体培育过程中，面对日益加剧的弧菌病，越来越多的人开始从微生态的角度去探讨解决弧菌病的办法，有学者发现使用噬菌体可以有效降低由副溶血弧菌引起的对虾死亡率[28]。该试验在对虾幼体培育过程中直接向水体中泼洒菌液，发现弧菌数量并没有少于空白组。可能是由于加入的细菌浓度过低造成了这种结果，该试验所采用的潜在益生菌浓度为105 cfu/mL，Zokaeifar等曾发现向水体中泼洒枯草芽孢杆菌并且使其浓度维持在108 cfu/mL能有效降低由哈维氏弧菌引起的对虾死亡率[29]。通过总菌数量的变化可以看出三个潜在益生菌组水体中的细菌数量明显高于空白组，尤其是M6组，这说明向水体中添加的潜在益生菌能够在水体中存活。
4 总结
总体来说，该试验选用的三株潜在益生菌（M6、M51、B8）在促进凡纳滨对虾幼体的生长发育，缩短变态时间，提高幼体成活率，降解水体中的氨氮和亚硝氮方面有很好的效果，可作为功能菌株应用于对虾幼体培育过程。
致谢：感谢青岛海壬水产种业科技有限公司为本试验所提供的试验条件、住宿等便利。
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