卡拉胶酶产生菌的筛选及发酵条件优化
李俊燕+张付云+李妍+付松岩+石楠
摘 要：为获得卡拉胶酶高产菌株，用卡拉胶作为唯一碳源，对从海水中分离的13株菌进行筛选，进而采用分子生物学方法将3号菌株鉴定为γ变形杆菌纲的Gilvimarinus属，并应用单因素试验和正交试验对3号菌株降解活性培养条件进行优化，结果显示较优培养条件为：蛋白胨0.20%，卡拉胶0.20%，琼脂0.001%，氯化钠2%，磷酸氢二钾10%，硫酸镁0.5%，磷酸铁0.1%，氯化钙1%，25 ℃培养2 d。
关键词：卡拉胶酶，细菌，筛选，优化
卡拉胶（Carrageen，CAS 9000-07-1），又叫做爱尔兰苔菜胶，或者是鹿角菜胶以及角叉菜胶，卡拉胶的降解产物是卡拉胶寡糖。卡拉胶寡糖有着更高的活性，而且其分子链上的中间活性基团得到了最大程度的暴露。卡拉胶寡糖具有众多生物特性，如免疫调节活性[1-3]、恢复造血功能[4]、抗氧化活性[5-6]、抑制血管生成作用[7]、抗病毒活性[8-10]和抗肿瘤活性[11]。就目前来看卡拉胶工业有很好的研究价值，而这些高价值研究的重要方向就是将海洋微生物当中卡拉胶降解酶进行精准的提取，然后把提取的酶用来制造卡拉胶活性片段。目前主要有三种方法来制造卡拉胶寡糖，分别是物理降解法[12]，化学降解法[13-15]以及酶降解法[16-21]。化学降解，物理降解法由于不易控制反应条件，所得寡糖产物复杂，使其在生产上受到限制，酶降解法虽然专一性强，但因为其活力较低及成本高，要实现规模化生产也是困难的[22]，微生物酶的活性是非常高的，同时其专一性也是比较高的，在对产物进行降解的时候，硫酸根并没有遭受损害，所以可以很好的对卡拉胶进行降解。通过对海洋微生物的液体培养物进行提取，就可以进行卡拉胶酶的制备，这些酶不仅是工具酶，在工业上也可以作为特殊酶，这就使得海洋微生物成了非常好的生物资源库。因此筛选卡拉胶降解菌具有很重要的实际意义。
1 材料与方法
1.1 菌株與培养基
13株海洋细菌：大连海洋大学实验室前期分离所得。
卡拉胶液体培养基：卡拉胶2 g、硝酸钠2 g、氯化钠15 g、磷酸氢二钾1 g、硫酸镁0.05 g、磷酸铁0.01 g、氯化钙0.1 g、蒸馏水1 000 mL（卡拉胶固体培养基再添加20 g琼脂即可）。
DNS溶液（250 mL）：1.625 g DNS溶于少量蒸馏水中，溶解后移入250 mL容量瓶中，加入2 mol/L NaOH 65 mL，再加入11.25 g丙三醇，摇匀、冷却后定容至250 mL。
1.2 仪器与设备
S.HS-1300净化工作台（上海跃进医疗器械厂）；YX280B手提式不锈钢蒸汽消毒器（上海三申医疗器械有限公司）；101-2B电热鼓风干燥箱（上海实验仪器厂有限公司）；721型可见分光光度计（上海光谱仪器有限公司）；Sartorius精密天平（北京赛多利仪器系统有限公司）；HH.BII.420-BS电热恒温培养箱（上海跃进医疗器械厂）；ZD-85A测速气浴振荡器（苏州威尔实验用品有限公司）；XMTB仪表恒温水浴锅（北京金北德工贸有限公司）；90-2离心机（上海手术器械厂）。
1.3 菌株的筛选与鉴定
1.3.1 菌种的初筛和复筛 将13株海洋细菌菌株接种于卡拉胶液体筛选培养基内，25 ℃恒温摇床培养3 d，离心取发酵上清液，测定酶活力。将筛选后的卡拉胶酶产生菌3号菌株接种于卡拉胶唯一碳源平板培养基上，25 ℃培养箱中静置培养3 d，观察菌落形态。
1.3.2 菌株酶活力测定[23] 发酵液经离心取上清液，DNS法[24]测酶活力。一个酶活力单位（U）定义为：在32 ℃下，每分钟产生1 μg还原糖（以半乳糖计）的酶的剂量。
1.3.3 分子生物鉴定3号菌株 3号菌株的16SrDNA序列测定由上海生工生物扩增、测序，并与核酸数据库（Bibosomal Database Project）进行比对，利用MEGA5进行系统进化树的构建。
1.4 菌株产酶发酵条件的优化
1.4.1 碳源对酶活力的影响 分别将琼脂、卡拉胶、酵母膏、麦芽糖、葡萄糖、乳糖作为唯一碳源替代卡拉胶液体筛选培养基中的卡拉胶，25 ℃摇床培养2 d，DNS法测酶活力，筛选较优碳源。
1.4.2 氮源对酶活力的影响 分别将氯化铵、硝酸铵、硝酸钾、酵母膏，蛋白胨，牛肉膏，硫酸铵作为卡拉胶液体筛选培养基中的唯一氮源，25 ℃摇床培养2 d，DNS法测酶活力，筛选较优氮源。
1.4.3 卡拉胶浓度对酶活力的影响 分别将015%、0.1%、0.05%浓度的卡拉胶加入以卡拉胶为唯一碳源，蛋白胨为唯一氮源的液体培养基，25 ℃摇床培养2 d，DNS法测酶活力，筛选较优卡拉胶浓度。
1.4.4 琼脂浓度对酶活力的影响 分别将0010%、0.005%、0.001%浓度的琼脂加入以015%卡拉胶为唯一碳源，蛋白胨为唯一氮源的液体培养基，25 ℃摇床培养2 d，DNS法测酶活力，筛选较优琼脂浓度。
1.4.5 氯化钠浓度对酶活力的影响 分别将25%、2%、1.5%浓度的氯化钠加入以0.15%卡拉胶为唯一碳源，蛋白胨为唯一氮源，琼脂浓度为0.005%的液体培养基，25 ℃摇床培养2 d，DNS法测酶活力，筛选较优氯化钠浓度。
1.4.6 硝酸钠浓度对酶活力的影响 分别将025%、0.2%、0.15%浓度的硝酸钠加入以015%卡拉胶为唯一碳源，蛋白胨为唯一氮源，琼脂浓度为0.005%，氯化钠浓度为1.5%的液体培养基，25 ℃摇床培养2 d，DNS法测酶活力，筛选较优硝酸钠浓度。
1.4.7 磷酸氢二钾浓度对酶活力的影响 分别将1.25%、1.00%、0.75% 浓度的磷酸氢二钾加入以0.15%卡拉胶为唯一碳源，蛋白胨为唯一氮源，琼脂浓度为0.005%，氯化钠浓度为1.5%，硝酸钠浓度为0.2%的液体培养基，25 ℃摇床培养2 d，DNS法测酶活力，筛选较优磷酸氢二钾浓度。
1.4.8 正交试验 在单因素试验数据基础上，利用正交试验方法[25]对3号活性菌株的产酶条件进行优化，其因素水平表见表1，按照正交试验表进行试验，正交试验方案见表2，对不同培养条件下菌株产酶的结果用分光光度计进行测定，根据正交试验结果得出较优产酶条件。
根据正交试验结果，确定出较优发酵条件。按条件配制培养基，接种（2%接种量）培养。取出较优条件下培养的发酵液离心去菌体，用DNS法测其酶活力。
2 结果与分析
2.1 产酶活性菌株的筛选结果
将13株海洋细菌菌株接种于卡拉胶液体培养基中，25 ℃振荡培养3 d，发酵上清液测定卡拉胶酶活性，测定结果如图1所示，3号菌株具有较高的卡拉胶降解活性，将3号菌株接种于以卡拉胶为唯一碳源的培养基上，25 ℃培养箱中倒置培养3 d，菌落长出情况如图2。菌株在卡拉胶培养皿上长势良好，且菌落周围有透明圈和凹陷出现，表明该菌株具有降解卡拉胶的活性，能够产生卡拉胶酶。
2.2 分子生物鉴定16SrDNA测序鉴定结果
将测序结果在NCBI数据库进行序列比对，并构建系统进化树结果如图3所示，3号菌株与分离自韩国济州岛的Gilvimarinus agarilyticus strain M5c同源性最高，因此将3号菌株鉴定为γ变形杆菌纲Gilvimarinus属，由于Gilvimarinus agarilyticus strain M5c具有降解琼脂糖活性，因此后续研究可对3号菌株是否具有潜在的琼脂糖酶活性，进行深入研究。
2.2 发酵条件的优化结果
2.2.1 碳源对菌株酶活力的影响 卡拉胶为唯一碳源时，3号菌株的卡拉胶酶活性最高，结果如图4所示。
2.2.2 氮源对菌株酶活力的影响 当以卡拉胶为唯一碳源，添加蛋白胨为唯一氮源时3号菌株降解卡拉胶的活性最高，结果如图5所示。
2.2.3 卡拉胶浓度对酶活力的影响 当以卡拉胶为唯一碳源，蛋白胨为唯一氮源时，不同浓度卡拉胶对3号菌株产酶活力有影响，当卡拉胶浓度为0.15%，酶活力最高，如图6所示。
2.2.4 琼脂浓度对酶活力的影响 当以0.15%卡拉胶为唯一碳源，蛋白胨为唯一氮源时，不同浓度琼脂对3号菌株产酶活力有影响，当琼脂浓度为0.005%，酶活力最高，其发酵液卡拉胶酶活力如图7所示。
2.2.5 氯化钠浓度对酶活力的影响 当以015%卡拉胶为唯一碳源，蛋白胨为唯一氮源，琼脂浓度为0.005%时，不同浓度氯化钠对3号菌株产酶活力有影响，当氯化钠浓度为1.5%时，酶活力最高，卡拉胶酶活力如图8所示，因此正交因素考察2.0%、1.5%和1.0%三个水平。
2.2.6 硝酸钠浓度对酶活力的影响 当以015%卡拉胶为唯一碳源，蛋白胨为唯一氮源，琼脂浓度为0.005%，氯化鈉浓度为1.5%时，不同浓度硝酸钠对3号菌株产酶活力有影响，当硝酸钠浓度为0.2%，酶活力最高，其发酵液卡拉胶酶活力如图9所示。
2.2.7 磷酸氢二钾的浓度对酶活力的影响 当以0.15%卡拉胶为唯一碳源，蛋白胨为唯一氮源，琼脂浓度为0.005%，氯化钠浓度为1.5%，硝酸钠浓度为0.2%时，不同浓度磷酸氢二钾对3号菌株产酶活力有影响，当硝磷酸氢二钾浓度为1.0%，酶活力最高，其发酵液卡拉胶酶活力如图10所示。
2.2.8 培养条件正交试验结果 在单因素试验结果及前人文献（温度和时间）基础上，设计正交试验方案对3号活性菌株进行酶活力条件优化，测定结果通过标准曲线的公式计算出酶活力值记录于表3。
按照下表结果，确定较优发酵条件为：培养温度25 ℃，培养时间为2 d，蛋白胨浓度为0.30%，卡拉胶浓度为0.15%，琼脂浓度为0.005%、氯化钠浓度为2%、母液添加量15% 。
2.2.9 正交试验验证 依据正交试验方案对活性菌株进行酶活力条件优化实验的结果，理论分析出较优条件与两个较优正交试验方案进行验证，记录结果于表4。
由表4结果可知，卡拉胶酶活性较好的培养条件为：培养温度25 ℃，培养时间为2 d，蛋白胨浓度为0.20%，卡拉胶浓度为0.20%，琼脂浓度为0.001%、氯化钠浓度为2%、母液添加量10%，此条件下3号菌株的卡拉胶酶活性达到17.4 U/mL。
3 结论
从海水中分离的13株菌中筛选出的3号菌株具有较高的降解卡拉胶的活性。通过分子生物学鉴定方法鉴定3号菌株为γ变形杆菌纲，Gilvimarinus属，通过单因素条件优化、正交试验优化出3号菌株卡拉胶降解活性的较佳培养条件为：25 ℃，培养2 d，蛋白胨浓度0.20%，卡拉胶浓度0.20%，琼脂浓度0.001%、氯化钠浓度2%、母液添加量10%。本研究为后期的工业化生产奠定理论基础。
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