饲料脂肪水平对淡黑镊丽鱼消化酶、免疫酶以及抗氧化酶的影响

    付旭　崔前进　陈冰　杨博学　周婧　陈明康　韩雨哲

    摘 要：为研究不同的饲料脂肪水平对淡黑镊丽鱼（Labidochromis caeruleus）的消化、免疫以及抗氧化酶的影响，选取状态良好的淡黑镊丽鱼120尾随机平均分成5个实验梯度，用脂肪含量分别为7.44%、9.86%、1091%、15.25%和23.69%的饲料进行饲养试验，各3组平行，按脂肪水平从低到高分别用Z1、Z2、Z3、Z4和Z5表示。试验周期68 d。结果表明：随着饲料中脂肪水平的增加，脂肪酶Z4显著高于其他组（P<0.05）；胃蛋白酶活力和淀粉酶活力出现先增后降再增加的趋势（P<0.05）；乳酸脱氢酶活力Z4显著低于其他各组（P<0.05）；酸性磷酸酶活力Z2显著高于其他各组（P<0.05）；碱性磷酸酶活力Z5显著低于其他组（P<0.05）；过氧化氢酶活力Z3显著高于其他各组（P<0.05）；丙二醛呈现先增后降再增加趋势（P<0.05）；其他抗氧化能力指标无明显差异（P>0.05）。试验表明饲料中脂肪水平小于10.91%时随着脂肪水平的升高对淡黑镊丽鱼的消化、免疫以及抗氧化有促进增强作用，但脂肪水平高于10.91%会对淡黑镊丽鱼的消化、免疫以及抗氧化能力起到抑制的作用，并且会影响鱼体的健康状况。

    关键词：淡黑镊丽鱼（Labidochromis caeruleus）；脂肪水平；消化酶；免疫酶；抗氧化酶

    脂肪对于鱼类生长发育非常重要，是鱼类主要的能量来源，维持了鱼类的生命活动[1]。鱼类摄入脂肪的多少会影响体内多种酶的变化[2-3]。摄入过量的脂肪会积累在鱼类的肝脏、肠壁以及腹腔等部位，导致鱼类的代谢处于紊乱，影响鱼类的抵抗能力以及活力[4]。摄入适当的脂肪还会有助于鱼类对脂溶性物质的吸收[5]。在饲料中适当的脂肪含量会提高免疫力，但过量的脂肪也会产生负面的影响，比如会提升鱼体的氧化反应，从而激发鱼体的抗氧化机制，过高的脂肪也会增加鱼类患上脂肪肝的几率从而造成不同程度的肝损伤[6]。

    淡黑镊丽鱼（Labidochromis caeruleus）属鲈形目、隆头鱼亚目、慈鲷科、镊丽鱼属，属于马拉维湖慈鲷岩栖类小型慈鲷，成年个体11±1.0 cm，呈橙黄色，背鳍近边缘处有一条黑色条纹。可适应人工饲料。淡黑镊丽鱼的观赏价值取决于体型是否标准和体色的鲜艳程度。

    目前，对淡黑镊丽鱼的研究较少，主要集中于形态学等方面。本试验将以淡黑鑷丽鱼为研究对象，探讨饲料脂肪水平对淡黑镊丽鱼消化、抗氧化以及免疫能力的影响，为开发淡黑镊丽鱼配合饲料提供理论参考。

    1 材料与方法

    1.1 试验用鱼及饲养管理

    本试验的试验用鱼由当地养殖场自行繁育。体质量为（1.70±0.5）g。体长为（47.29±4.5）mm，取状态良好的淡黑镊丽鱼120尾随机平均分成5个试验梯度各3组平行进行饲养试验，每个平行组8尾鱼，于控温循环水系统（汇新钛公司提供）中进行整个试验过程，水体积30 L，循环水流量3 L/min。每组随机布置于此系统中，每20日再次将每个组别随机布置，并彻底清理鱼缸。水温25±1.0 ℃，每日投喂两次分别于8：00和16：00，投喂至试验鱼不摄食为止。投喂后1 h进行吸底，同时清理粪便收集残饵，每日18：00换水20%，每日控制均匀光照12 h。保持氧气充足。试验周期共68 d。

    1.2 试验饲料的制备

    试验饲料的原料于上海生物工程有限公司。饲料经过研磨、过筛、搅拌器充分混匀，用小型颗粒饲料制粒机压制而成，60 ℃烘箱烘干至含水量18%，于-20 ℃冰箱真空密封避光保存。以大豆油（金龙鱼品牌）为脂肪源，以鱼粉、豆粕等为蛋白源，以淀粉等为糖源。添加的大豆油含量分别为0、30、60、92、170 g/kg，共五组。试验饲料的基本成分以及配比质量见表1。

    维生素E 4 000 IU、维生素K3 1 000 mg、维生素B1 2 000 mg、维生素B2 1 500 mg、维生素B6 1 000 mg、维生素B12 5 mg、烟酸1 000 mg、维生素C 5 000 mg、泛酸钙5 000 mg、叶酸100 mg、肌醇10 000 mg、载体葡萄糖及水≤ 10%；矿物质混合物为0025 mg/g 预混料提供（mg/kg）： 氯化钠107.79、七水硫酸镁380.02、二水磷酸氢钠241.91、磷酸二氢钾665.20、二水磷酸钙376.70、柠檬酸铁82.38、乳酸钙907.10、氢氧化铝0.52、七水硫酸锌9.90、硫酸铜0.28、七水硫酸锰2.22、碘酸钙0.42、一水硫酸钴2.77。

    1.3 试验取样以及方法

    试验期间观察鱼的生长发育、摄食情况、死亡状况。试验结束后停食24 h，每个平行组随机取6尾鱼。纱布擦干体表水分，至于冰袋上用灭菌的解剖工具进行解剖，取其完整的肝脏和肠道。将每个平行组所取全部鱼的肝脏做混样用于测免疫酶、抗氧化酶，肠道做混样用于测消化酶，置于对应组别的离心管内置于液氮中，后置于-80 ℃冰箱中短暂储存，样品置于灭菌的玻璃匀浆器中，置于碎冰中，加入预冷的生理盐水充分匀浆制成20%的匀浆液，于4 ℃、2 500 r离心机离心10 min取上清。再稀释成每种不同种酶测试的最适浓度。匀浆液在8 h内测试完毕。

    1.4 指标测定与计算

    采用试剂盒（南京建成生物有限公司）进行测定，针对胃蛋白酶（PRS）、脂肪酶（LPS）、淀粉酶（AMS）、总氧化物歧化酶（T-SOD）、过氧化氢酶（CAT）、丙二醛（MDA）、谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-PX）和总抗氧化能力（T-AOC）、酸性磷酸酶（ACP）、碱性磷酸酶（AKP）、乳酸脱氢酶（LDH）和溶菌酶（LZM）、谷草转氨酶（AST/GOT）和谷丙转氨酶（ALT/GPT）进行测定并对结果进行分析。

    1.5 数据统计方法

    所得数据均采用平均值±标准误表示，并采用spss 20.0分析软件进行方差齐次检验和单因素方差分析（One-Way ANOVA）并进行Duncan氏多重比较，差异显著水平为P<0.05。

    2 结果

    2.1 饲料水平对淡黑镊丽鱼消化能力的影响

    表2为淡黑镊丽鱼消化酶活力受饲料脂肪水平的影响。三种酶在不同脂肪浓度的作用下差异显著。LPS的活性隨饲料中脂肪水平的增加呈先增后降趋势。并于Z4达到最高值，Z4与Z5之间存在显著差异（P<0.05），Z4与Z5分别与其他三组无显著差异（P>0.05）。PRS随脂肪水平的增高呈先增后降再增的趋势，Z1、Z2与其余三组无显著差异（P>0.05），Z3与Z4、Z5两组有显著差异（P<0.05）。AMS随脂肪水平的增高呈先增后降的趋势，于Z2达到最高值。其中Z4与Z1、Z2、Z3三组有显著差异（P<0.05），Z2与Z3、Z4、Z5三组存在显著差异（P<0.05），Z1与Z4、Z5两组存在显著差异（P<0.05）。

    2.2 饲料脂肪水平对淡黑镊丽鱼免疫能力的影响

    表3为淡黑镊丽鱼免疫酶活力受饲料脂肪水平的影响，其中各个组别中的LZM活性无显著差异（P>0.05）。LDH的活性随脂肪水平的增加先增后降，Z4显著低于Z1、Z2、Z3三组（P<005）。ACP活力随脂肪水平增加呈现出先增后降再趋于平缓的趋势，Z2显著高于Z1、Z3和Z5（P<0.05）。AKP活力Z1与其他组之间无显著差异（P>0.05），Z5显著低于除Z1外的其他组（P<0.05）。

    2.3 脂肪水平对淡黑镊丽鱼抗氧化能力的影响

    表4为淡黑镊丽鱼抗氧化能力受饲料脂肪水平的影响，分别为总抗氧化能力、总氧化物歧化酶和谷胱甘肽过氧化物酶、过氧化氢酶和丙二醛，其中T-AOC、T-SOD和GSH-PX在不同脂肪水平下不表现出显著差异（P>0.05），但总体趋势为先增后降。CAT随脂肪水平的不断升高呈现出先升高后降低的趋势，于Z3处出现最高值，并且显著高于Z1、Z5两组（P<0.05）。MDA则呈先升后降再显著上升的趋势，其中Z3显著高于Z1（P<0.05），Z2、Z4分别与Z1、Z3两组没有显著差异（P>0.05），而Z5则显著高于其他组二至三倍（P<0.05）。

    3 讨论

    3.1 饲料水平对淡黑镊丽鱼消化能力的影响

    鱼类消化酶的活性受很多因素影响，如鱼类的品种、食性、环境以及外源摄入的营养饲料等[7]。消化酶可催化体内化学变化维持正常的生命活动，反映鱼类对饲料的利用率及生长发育状况，故消化酶的研究对帮助提高鱼类的饲料转化率以及促进鱼类的生长发育起重要作用[8]。本试验证实在饲料中适当的脂肪含量有助于提高淡黑镊丽鱼的胃蛋白酶和淀粉酶的活性，但过高的脂肪含量会抑制胃蛋白酶和淀粉酶的活性。鱼类体内脂肪酶的活力受摄入的外源脂肪含量的多少影响。当在一定范围内摄入脂肪越多脂肪酶的活力就越强，以便可以消化吸收更多的脂肪来提供所需的能量，但当脂肪摄入量过高时，由于脂肪积累过多会导致鱼类患有营养性脂肪肝，并对鱼体产生毒素，还会导致肌肉渗出性损失和肌肉营养不良，不仅影响鱼的生长发育还会对鱼体造成损伤，并且影响肝脏分泌各种活性酶[9]。本试验中在饲料脂肪水平极低时，为了提供足够的能量而需要消化碳水化合物和蛋白质，使得胃蛋白酶和淀粉酶活力增加；当饲料脂肪水平继续增加时，由于提供了充足的能量使得不需要蛋白质和碳水化合物来提供能量，从而抑制蛋白酶和淀粉酶的活力[10]。但随着脂肪含量的继续升高，蛋白酶活力又开始增加，由于足够脂肪的消化保证了必须脂肪酸的比例和种类的平衡以及充足的能量节约了蛋白质可以开始更好的参与鱼体的生长发育从而蛋白酶的活力再次升高[11]。直至最高脂肪浓度组由于积累过多脂肪造成脂肪肝从而导致肝脏无法正常工作，而导致脂肪酶活力显著降低使得脂肪无法被利用，为了维持鱼体正常的代谢所需的能量，只能利用蛋白质和碳水化合物，使得蛋白酶和淀粉酶的活力从原来的基础再次升高，但由于损伤的肝胰脏是鱼类淀粉酶主要的分泌器官，肠道只能分泌少量淀粉酶，所以淀粉酶活力虽然升高也无法达到之前的峰值。

    3.2 饲料脂肪水平对淡黑镊丽鱼免疫酶活力的影响

    在谢丽玲[12]对龟壳攀鲈的研究中提出ACP和AKP的活性对鱼类的免疫能力的强弱起到影响，并发现ACP和AKP主要由肝脏分泌到血液以及肠道中，ACP和AKP在肠道、肝脏、鳃以及肾脏含量较多，故提出鱼类在ACP和AKP的作用下通过肠胃的代谢作用和鳃以及肾脏的解毒作用提高自身的免疫能力和对外界的抗逆性。在柳阳[13]对大西洋鲑的研究和王萍[14]对大鳞副泥鳅的研究中提出了AKP和ACP对消化吸收以及代谢调节起到了重要作用。本试验AKP和ACP活性均为先增加后降低说明饲料脂肪水平小于15.25%时可以增加鱼体的免疫能力以及对营养的消化吸收和新陈代谢功能，但若脂肪摄入过量会导致脂肪累积过多，造成肝脏以及其他器官受损，使得AKP和ACP无法正常产生分泌，从而降低对营养的吸收能力和免疫能力导致鱼体的抗逆性减弱，在环境改变时出现死亡现象。LDH作为机体能量代谢中参与糖酵解的重要酶，存在于各组织器官中，主要分布于胞内。在生物体内，LDH主要催化乳酸脱氢成为丙酮酸，从而完成葡萄糖的无氧酵解过程，其基本功能为参与调节NAD和NADH的比率，从而对细胞内一系列生化反应起调控作用[15]。本试验在饲料脂肪水平超过10.91%时LDH活力表现出显著下降，说明此时脂肪摄入量过多，导致体内组织损伤，免疫力下降，抗逆性减弱。与李伟[16]对鲫鱼的乳酸脱氢酶的研究中提出了鱼体在受到细菌入侵、体内出现组织器官的损伤以及受重金属影响时，肝脏等组织中的LDH活力会降低的结果相同。

    3.3 脂肪水平对淡黑镊丽鱼抗氧化能力的影响

    本试验中T-AOC、T-SOD、GSH-PX和CAT表现先增后降的趋势，其主要原因为在一定脂肪含量范围内，脂肪会对肝脏产生一定的刺激作用，使得肝脏产生更多的抗氧化酶从而增加鱼体的抗氧化能力，减少脂质过氧化物对鱼体的损伤，但是如果脂肪摄入过高，则脂肪过量沉积于鱼的肝脏、消化道以及体腔等部位，发生氧化产生过多的活性氧自由基，破坏细胞膜机构和功能，对鱼体肝脏的负荷增加，导致抗氧化能力的减弱[17]。MDA为过氧化反应的主要代谢产物，其含量作为过氧化物积累状况和氧化应激程度的重要指标[18]。本试验中MDA的先升高则是随着摄入脂肪的不断增加，脂质过氧化物不断积累产生的结果。Z4组MDA略下降，但抗氧化酶活力没有升高并出现下降，由于每组饲料中添加200 mg/kg的叶黄素5 g/kg，叶黄素为脂溶性，并且有很强的的抗氧化作用[19]。脂肪含量的增加促进了鱼体对叶黄素的吸收和累积，使得自由基在鱼体内未发生作用即被叶黄素清除，导致诱导性酶活活力降低，从而产生了饲料脂肪含量升高时MDA和抗氧化能力同时降低的情况。在脂肪摄入极高的Z5组，MDA显著高于其他组，可能是由于脂肪过多的累积并远超过体内累积的叶黄素可以控制的范围，导致脂质过氧化物增加，造成肝脏负荷过重，导致肝功能损伤，使其无法正常分泌抗氧化酶，抗氧化酶活性降低，MDA激增，对鱼体造成损伤乃至死亡[20]。

    4 结论

    本试验通过研究饲料中不同脂肪水平对淡黑镊丽鱼消化、免疫和抗氧化酶活力的影响得出结论为：淡黑镊丽鱼的饲料中脂肪水平小于9.56%时淡黑镊丽鱼的消化、免疫以及抗氧化能力随脂肪水平的增加而增强；但饲料中脂肪水平超过9.56%时会对淡黑镊丽鱼体内的酶产生抑制的影响，严重时会对鱼体造成损伤以致出现死亡情况。

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    （收稿日期：2017-09-28）