超高效液相色谱串联三重四级杆质谱测定蜂蜜中甲硝唑残留
马晓年++李文廷++欧利华++梁志坚+++段海波
甲硝唑具有广谱抗厌氧菌和抗原虫的作用，主要用于预防和治疗厌氧菌引起的感染。蜂蜜营养丰富，是人类重要的滋补食品，由于诸多原因，蜂蜜中可能存在甲硝唑的残留，给消费者带来潜在的危害。
目前，国内外采用的检测甲硝唑残留的方法主要有液相色谱法、气相色谱法、气质联用和液质联用。本方法采用超高效液相色谱串联三重四极杆质谱法对蜂蜜中的甲硝唑残留进行测定，取得满意结果。
实验部分
试剂与仪器。液相色谱-串联质谱仪，配电喷雾离子源和大气压化学源（美国AB公司）；BEH C18柱（Waters公司）；实验用水为二次蒸馏水；甲醇、乙腈、乙酸乙酯为色谱纯，浓氨水、浓盐酸为分析纯；甲硝唑标准物质（Dr.Ehrenstorfer）；甲硝唑-D4同位素内标（Dr.Ehrenstorfer）；蜂蜜（超市）。
分析条件。色谱柱：Waters BEH C18柱（1.7?m，2.1mm×100mm）；流动相：0.05%氨水：乙腈梯度洗脱；流速0.4mL/min；进样量：20?L。扫描方式：正离子扫描；检测方式：多反应检测（MRM）；离子化电压：5500V；喷雾器压力：40psi；气帘气压力：35psi；辅助气流速：40?L/min；离子源温度：450℃；去簇电压（DP）：52V。
样品处理。（1）样品提取。称取蜂蜜5.00g于50mL离心管中，分别加入100?L 20ng/mL D4-甲硝唑应用液，加水10mL，混匀溶解，再加入10 mL乙酸乙酯，涡旋提取2min，1000rpm离心2min，吸取上层乙酸乙酯相5mL入10mL试管，50℃氮气吹干后，加入0.1mL甲醇溶解，再加入1.9mL 40mmol/L盐酸溶液，超声溶解1min，转入2mL离心管，12000rpm离心2min，上清液待净化。
（2）样品净化。依次用5mL甲醇、5mL水、5mL 40mmol/L盐酸溶液活化平衡MCS固相萃取柱，然后转移上述上清液至MCS柱內，待样品过柱后，用5mL水淋洗除去杂质，再用5mL甲醇淋洗除杂质，真空抽干后用5mL 5%氨化甲醇洗脱，收集于10mL具塞试管内，得洗脱液；洗脱液在50℃下用氮气吹干，先加入0.1mL甲醇超声溶解残留物，再加入0.9mL 10%甲醇/水溶液混匀，过0.22?m滤膜后待LC-MS/MS分析。
结果与讨论
质谱条件的选择。在流动注射状态下将甲硝唑和D4-甲硝唑的标准溶液注入离子源中，在正离子和负离子的检测方式下进行母离子全扫描，并确定母离子质量数，结果表明甲硝唑在正离子模式下产生最强峰。以目标化合物的准分子离子峰为母离子，进行二级质谱扫描，最后采集全扫描的二级质谱图，得到碎片离子信息，然后再对得到的目标化合物的二级质谱参数进行优化，使得子离子在保证分辨率的条件下灵敏度最佳。
色谱条件优化。为了有利于色谱峰的分离，消除样品杂质对目标物的干扰，本方法采用乙腈-0.05%的氨水溶液为流动相，利用梯度洗脱的方法提高分离和检测效果。检测开始时，流动相中乙腈-0.05%的氨水的体积比为10：90，并保持0.5min；0.5～2.0min，乙腈的比例由10%线性上升至90%，保持此比例1min，这部分主要是因为乙腈在流动相中所占比例，决定甲硝唑的保留时间、峰形和测定的灵敏度；3.0～3.5min， 乙腈的比例由90%线性下降至10%，并保持1.5min。实验表明，在此梯度条件下，甲硝唑与杂质达到完全分离。
样品提取溶剂的选择。甲硝唑易溶于甲醇、乙腈、乙酸乙酯等有机溶剂。有研究选用乙酸乙酯作为提取溶剂，乙酸乙酯提取杂质多，提取颜色较深，但乙酸乙酯提取率高，因此本实验选用乙酸乙酯提取样品中的甲硝唑，氮气吹干。
方法的线性关系。将甲硝唑和D4-甲硝唑制备成含甲硝唑0.01、0.05、0.1、0.25、0.5、1.0、2.5、5.0ng/mL，含D4-甲硝唑2.0ng/mL的混合标准溶液直接进样。以含量对峰面积的比值绘制标准曲线。结果见表1。
回收率及精密度实验。准确称取空白样品9份，每份5.00g，共3组，分别在蜂蜜空白样品中添加0.5、2.0、5.0ng甲硝唑， D4-甲硝唑含量与标准曲线相同。按供试品溶液制备方法制备后进行测定，结果见表2。结果可见，不同浓度平均加标回收率88%～94.3%，平均相对标准偏差为5.5%～7.6%。图2为加标样品中MRM色谱图。
应用本方法检测了5个地州不同产地蜂蜜共36件，甲硝唑检出35件，检出率高达97.22%。实验结果表明，在蜂蜜中甲硝唑的滥用问题非常严重，应引起足够的关注，加大监管力度。本方法具有很高的选择性和灵敏度，容易操作，适用于日常检验，可为甲硝唑污染监测工作提供依据。
甲硝唑具有广谱抗厌氧菌和抗原虫的作用，主要用于预防和治疗厌氧菌引起的感染。蜂蜜营养丰富，是人类重要的滋补食品，由于诸多原因，蜂蜜中可能存在甲硝唑的残留，给消费者带来潜在的危害。
目前，国内外采用的检测甲硝唑残留的方法主要有液相色谱法、气相色谱法、气质联用和液质联用。本方法采用超高效液相色谱串联三重四极杆质谱法对蜂蜜中的甲硝唑残留进行测定，取得满意结果。
实验部分
试剂与仪器。液相色谱-串联质谱仪，配电喷雾离子源和大气压化学源（美国AB公司）；BEH C18柱（Waters公司）；实验用水为二次蒸馏水；甲醇、乙腈、乙酸乙酯为色谱纯，浓氨水、浓盐酸为分析纯；甲硝唑标准物质（Dr.Ehrenstorfer）；甲硝唑-D4同位素内标（Dr.Ehrenstorfer）；蜂蜜（超市）。
分析条件。色谱柱：Waters BEH C18柱（1.7?m，2.1mm×100mm）；流动相：0.05%氨水：乙腈梯度洗脱；流速0.4mL/min；进样量：20?L。扫描方式：正离子扫描；检测方式：多反应检测（MRM）；离子化电压：5500V；喷雾器压力：40psi；气帘气压力：35psi；辅助气流速：40?L/min；离子源温度：450℃；去簇电压（DP）：52V。
样品处理。（1）样品提取。称取蜂蜜5.00g于50mL离心管中，分别加入100?L 20ng/mL D4-甲硝唑应用液，加水10mL，混匀溶解，再加入10 mL乙酸乙酯，涡旋提取2min，1000rpm离心2min，吸取上层乙酸乙酯相5mL入10mL试管，50℃氮气吹干后，加入0.1mL甲醇溶解，再加入1.9mL 40mmol/L盐酸溶液，超声溶解1min，转入2mL离心管，12000rpm离心2min，上清液待净化。
（2）样品净化。依次用5mL甲醇、5mL水、5mL 40mmol/L盐酸溶液活化平衡MCS固相萃取柱，然后转移上述上清液至MCS柱內，待样品过柱后，用5mL水淋洗除去杂质，再用5mL甲醇淋洗除杂质，真空抽干后用5mL 5%氨化甲醇洗脱，收集于10mL具塞试管内，得洗脱液；洗脱液在50℃下用氮气吹干，先加入0.1mL甲醇超声溶解残留物，再加入0.9mL 10%甲醇/水溶液混匀，过0.22?m滤膜后待LC-MS/MS分析。
结果与讨论
质谱条件的选择。在流动注射状态下将甲硝唑和D4-甲硝唑的标准溶液注入离子源中，在正离子和负离子的检测方式下进行母离子全扫描，并确定母离子质量数，结果表明甲硝唑在正离子模式下产生最强峰。以目标化合物的准分子离子峰为母离子，进行二级质谱扫描，最后采集全扫描的二级质谱图，得到碎片离子信息，然后再对得到的目标化合物的二级质谱参数进行优化，使得子离子在保证分辨率的条件下灵敏度最佳。
色谱条件优化。为了有利于色谱峰的分离，消除样品杂质对目标物的干扰，本方法采用乙腈-0.05%的氨水溶液为流动相，利用梯度洗脱的方法提高分离和检测效果。检测开始时，流动相中乙腈-0.05%的氨水的体积比为10：90，并保持0.5min；0.5～2.0min，乙腈的比例由10%线性上升至90%，保持此比例1min，这部分主要是因为乙腈在流动相中所占比例，决定甲硝唑的保留时间、峰形和测定的灵敏度；3.0～3.5min， 乙腈的比例由90%线性下降至10%，并保持1.5min。实验表明，在此梯度条件下，甲硝唑与杂质达到完全分离。
样品提取溶剂的选择。甲硝唑易溶于甲醇、乙腈、乙酸乙酯等有机溶剂。有研究选用乙酸乙酯作为提取溶剂，乙酸乙酯提取杂质多，提取颜色较深，但乙酸乙酯提取率高，因此本实验选用乙酸乙酯提取样品中的甲硝唑，氮气吹干。
方法的线性关系。将甲硝唑和D4-甲硝唑制备成含甲硝唑0.01、0.05、0.1、0.25、0.5、1.0、2.5、5.0ng/mL，含D4-甲硝唑2.0ng/mL的混合标准溶液直接进样。以含量对峰面积的比值绘制标准曲线。结果见表1。
回收率及精密度实验。准确称取空白样品9份，每份5.00g，共3组，分别在蜂蜜空白样品中添加0.5、2.0、5.0ng甲硝唑， D4-甲硝唑含量与标准曲线相同。按供试品溶液制备方法制备后进行测定，结果见表2。结果可见，不同浓度平均加标回收率88%～94.3%，平均相对标准偏差为5.5%～7.6%。图2为加标样品中MRM色谱图。
应用本方法检测了5个地州不同产地蜂蜜共36件，甲硝唑检出35件，检出率高达97.22%。实验结果表明，在蜂蜜中甲硝唑的滥用问题非常严重，应引起足够的关注，加大监管力度。本方法具有很高的选择性和灵敏度，容易操作，适用于日常检验，可为甲硝唑污染监测工作提供依据。
