在线固相萃取—高效液相色谱法检测食用油中15+1种欧盟优控多环芳烃

王春蕾+刘华良+马永建+阮丽萍



摘 要 建立了植物油中15+1种欧盟优控多环芳烃的在线固相萃取-高效液相色谱-紫外/荧光(online-SPE-HPLC-UV/FLD)检测分析方法。食用油样品经异丙醇稀释定容并过滤,固相萃取柱ChromSpher Pi (80 mm×3 mm)在线净化,反相C18 PAH专用柱(250 mm×4.6 mm i.d,5 μm)分离,异丙醇、乙腈和水为流动相,梯度洗脱,紫外(220 nm)和荧光检测器检测。结果表明,15+1种多环芳烃在相应的线性范围内峰面积与质量浓度之间线性良好(R2>0.99);检出限为0.03~12.23 μg/kg;3个水平加标回收率为65.3%~110.5%;相对标准偏差为0.1%~9.8%。
关键词 在线固相萃取;多环芳烃;高效液相色谱;食用油
1 引 言
多环芳烃(Polycyclic aromatic hydrocarbons,PAHs)是普遍存在的持久性环境污染物,有机物的不完全燃烧和热分解、地质化学过程都可能产生PAHs[1,2]。部分PAHs具有致癌性和遗传毒性,没有致癌性的PAHs可以作为促癌剂,对人体健康造成严重危害[3]。 1979年美国环保署(EPA)列出了16种优控PAHs,2008年欧盟食品安全局(EFSA)对食品中PAHs进行评估,列出了15+1种优控PAHs(15+1 EU- priority PAHs),与EPA优控PAHs有8种相同,包含更多毒性较大的重质PAHs,目前的检测方法大多是针对EPA列出的16种PAHs,而对欧盟优控PAHs报道较少。
由于PAHs的亲脂性,在食用油生产、加工和运输过程中可能因环境污染或者加工不当而被污染[4~6]。一些机构和组织也制定了相关的卫生限值,GB2762—2012规定食用油中苯并(a)芘的含量≤10 μg/kg[7,8],欧盟法规No 835/2011规定除了可可油和椰子油,其它油脂中苯并(a)芘≤2 μg/kg,4种PAHs(苯并(a)蒽、屈、苯并(b)荧蒽和苯并(a)芘)之和≤10 μg/kg[9,10]。PAHs提取方法主要有离线和在线两大类,常用的离线方法有液液萃取(LLE)[10,11]、固相萃取(SPE)[12,13]、凝胶渗透色谱(GPC)[14]和供体受体复合色谱法(DACC)[15,16]等,这些方法大多有复杂的前处理过程,费时费力,消耗大量有机溶剂;也有研究建立了基于DACC的在线净化方法[17,18],但是并不能同时检测欧盟优控PAHs。
本研究建立了检测食用油中15+1种欧盟优控PAHs的在线分析方法,采用在线固相萃取(online-SPE)净化,高效液相色谱紫外/荧光检测器(HPLC-UV/FLD)定量分析。online-SPE的原理是基于DACC,PAHs是π电子供体,与π电子受体的固定相结合而被保留在固定相中。这种在线分析方法可以减少有机溶剂的使用,大大缩短分析时间。
2 实验部分
2.1 仪器与试剂
UltiMate 3000高效液相色谱系统(美国Thermo公司),配有3400型紫外检测器,3100型荧光检测器;Milli-Q超纯水纯化系统(美国Millipore公司);涡旋振荡器(德国IKA公司);高速冷冻离心机(德国Sartorius公司);分析天平(德国Sartorius公司)。
乙腈(ACN)、异丙醇(IPA)均为色谱纯(德国默克股份两合公司);水为超纯水;15
种欧盟优控PAHs混合标准溶液(德国Dr. Ehrenstorfer公司):环戊烯(c,d)芘(cyclopenta(c,d)pyrene,CPP)、苯并(a)蒽(Benzo(a)anthracene,BaA)、GFDA2(Chrysene,Chr)、5-甲基-1,2-苯并菲(5-methylchrysene,SMC)、苯并(b)荧蒽(Benzo(b)fluoranthene,BbF)、苯并(j)荧蒽(Benzo(j)fluoranthene,BjF)、苯并(k)荧蒽(Benzo(k)fluoranthene,BkF)、苯并(a)芘(Benzo(a)pyrene,BaP)、二苯并(a, h)蒽(Dibenzo(a,h)anthracene, DaA)、苯并(g,h,i)苝(Benzo(g,hi)perylene,BgP)、茚并(1,2,3-cd)芘(Indeno(1,2,3-cd)pyrene,IcP)、二苯并(a,e)芘(Dibenzo(a,e)pyrene,DeP)、二苯并(a,h)芘(Dibenzo(a,h)pyrene,DhP)、二苯并(a,i)芘(Dibenzo(a,i)pyrene,DiP)、二苯并(a,l)芘(Dibenzo(a,l)pyrene,DlP),苯并(c)芴(benzo(c)fluorene,BcF),每种物质为10 μg/mL的ACN溶液。
2.2 实验方法
2.2.1 空白油样制备
称取约40 g食用油,加入5%活性炭,90℃旋转蒸发2 h,离心后上层液过0.45 μm滤膜。 称取食用油样品4.0 g(精确至0.01 g), 用IPA溶解并定容至5 mL,混匀过0.45 μm滤膜,待测。
2.2.2 色谱条件
在线固相萃取柱ChromSpher Pi(80 mm×3 mm,Thermo公司),分析柱C18 PAH专用柱(250 mm×4.6 mm,5 μm,Waters公司),柱温30℃,进样盘温度40℃~45℃,根据油的性状进行调整,进样量40 μL,萃取柱用IPA、ACN和水梯度洗脱:0~5 min,100% IPA,流速为0.5 mL/min;5.2~7.0 min,60% ACN,流速为0.5 mL/min;8~29 min,流速为0;30~69 min,100% ACN,流速为0.5 mL/min; 70 min后回到初始状态。分析柱用ACN和水梯度洗脱:0~5 min,60% ACN,流速为0.5 mL/min;6~30 min,60% ACN,流速为1.2 mL/min;30~48 min,60%~100% ACN,流速为1.2 mL/min;48~55 min,100% ACN,流速为1.2 mL/min;55~56 min,100% ACN,流速1.2~2.0 mL/min,维持至80 min; 80 min后回到初始状态。0~7 min为萃取阶段,7~30 min为转移阶段,30~88 min为分析平衡阶段,分别在7和30 min处进行阀切换,具体切换通路见图1。
图1 不同阶段阀切换通路
Fig.1 Column switching mechanism in different periods
3 结果与讨论
3.1 在线萃取条件优化
在线萃取采用ChromSpher Pi柱,运用供体与受体结合的原理进行在线净化,参考文献[19]的方法,用IPA上样。研究表明,用IPA上样流速不宜过大。国外已有的在线净化技术的上样体积较大,通常大于100 μL,洗脱时间约为10~12 min, 运用2个六通阀进行切换,两根色谱柱实现分离[18,19],过程较为复杂。本研究采用小体积上样,1个六通阀切换,1根色谱柱分离,可以缩短萃取时间,操作简单。采用100% IPA上样,去除油中大分子脂肪酸和色素物质,上样结束后切换六通阀, 用ACN-H2O,去除多余的IPA,过渡到分析柱的洗脱条件。分析柱的初始浓度为60% ACN,为缩小峰宽,改善峰形,同时减少有机溶剂的使用,采用40%ACN进行过渡。
3.2 色谱条件优化
在实验阶段,比较Thermo公司和Waters公司的C18 PAH专用柱(250 mm×4.6 mm, 5 μm),前者无法分离出最后两种物质(DiP和DhP),后者可以达到较好的分离效果。优化洗脱梯度和流速,采用ACN和水为流动相,梯度洗脱。为降低食用油的粘性,适当提高进样盘的温度,一般液态油为40℃,对于半固体油样可以设为45℃。考察柱温(25℃~35℃)对分离效果的影响(图2,在30℃条件下可以达到较好的分离效果。Dip和Dhp在色谱柱上保留较强,在不影响前14种物质分离的条件下,后期加大流速,洗脱最后两种物质。
3.3 检测波长的选择
CCP无荧光,用UV检测,波长为220 nm;欧盟优控的15种PAHs的最佳激发波长和发射波长不同,研究者一般采用多通道检测器,本实验室仪器无法进行多通道荧光检测,采用分时间段切换波长,具体见表1。所得15种荧光PAHs的色谱图见图3,CPP无荧光性,用紫外检测器检测(见图4)。
3.4 方法学验证
用IPA配制系列标准溶液,以浓度值为横坐标,平均峰面积为纵坐标,绘制标准曲线,测得峰面积与质量浓度呈良好的线性关系,线性相关系数R2>0.99,在空白油样中进
图3 15种PAHs标准混合溶液(8 ng/mL)色谱图
Fig.3 Chromatogram of the mixed standard solution of 15 polycyclic aromatic hydrocarbons (PAHs)(8 ng/mL)
图4 CPP(80 ng/mL)紫外检测色谱图
Fig.4 Chromatogram of cyclopenta (c,d) pyrene
(CPP) under UV detection(80 ng/mL)
行低、中、高3个水平加标,每水平重复测定6次,计算回收率和相对标准偏差,回收率为65.25%~110.53%;相对标准偏差为0.1%~9.8%。CPP在UV上响应值较低,3个水平回收率均不高; IcP含5个苯环结构,但出峰时间较6环的BgP晚,空间构型比较特殊,可能因其特殊的空间构型导致低浓度时在SPE柱上保留减弱造成回收率较低。本方法具有良好的精密度和准确性。根据3倍信噪比(S/N)确定LOD,10倍S/N为LOQ,具体见表2。
3.5 实际样品测定
采用本方法检测常用的大豆油、葵花籽油等共10种食用油中欧盟优控15+1种PAHs的含量,结果见表3。根据我国和欧盟关于PAHs的限量标准,其中葡萄籽油中BaP超标(>10 μg/kg),葵花籽油、花生油和紫苏籽油中Bap超过欧盟限量(>2 μg/kg);葵花籽油、花生油、葡萄籽油和紫苏籽油中BaA, Chr, BbF和BaP之和>10 μg/kg,不满足欧盟限量标准;这10种油中均未检出CPP和DhP。
4 结 论
建立了在线固相萃取技术检测植物油中15+1种欧盟优控多环芳烃的分析方法。通过优化在线萃取和分析条件,可以实现15+1种物质的有效分离。本方法与常规离线方法相比操作简单,省时省力,灵敏度高,重现性好,可以满足我国和国际上对PAHs定量分析的要求,并且大大减少了分析时间,可用于日常分析。
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