在线固相萃取—高效液相色谱法检测食用油中15+1种欧盟优控多环芳烃
王春蕾+刘华良+马永建+阮丽萍
摘 要 建立了植物油中15+1种欧盟优控多环芳烃的在线固相萃取-高效液相色谱-紫外/荧光（online-SPE-HPLC-UV/FLD）检测分析方法。食用油样品经异丙醇稀释定容并过滤，固相萃取柱ChromSpher Pi （80 mm×3 mm）在线净化，反相C18 PAH专用柱（250 mm×4.6 mm i.d，5 μm）分离，异丙醇、乙腈和水为流动相，梯度洗脱，紫外（220 nm）和荧光检测器检测。结果表明，15+1种多环芳烃在相应的线性范围内峰面积与质量浓度之间线性良好（R2>0.99）；检出限为0.03～12.23 μg/kg；3个水平加标回收率为65.3%～110.5%；相对标准偏差为0.1%～9.8%。
关键词 在线固相萃取；多环芳烃；高效液相色谱；食用油
1 引 言
多环芳烃（Polycyclic aromatic hydrocarbons，PAHs）是普遍存在的持久性环境污染物，有机物的不完全燃烧和热分解、地质化学过程都可能产生PAHs[1，2]。部分PAHs具有致癌性和遗传毒性，没有致癌性的PAHs可以作为促癌剂，对人体健康造成严重危害[3]。 1979年美国环保署（EPA）列出了16种优控PAHs，2008年欧盟食品安全局（EFSA）对食品中PAHs进行评估，列出了15+1种优控PAHs（15+1 EU- priority PAHs），与EPA优控PAHs有8种相同，包含更多毒性较大的重质PAHs，目前的检测方法大多是针对EPA列出的16种PAHs，而对欧盟优控PAHs报道较少。
由于PAHs的亲脂性，在食用油生产、加工和运输过程中可能因环境污染或者加工不当而被污染[4～6]。一些机构和组织也制定了相关的卫生限值，GB2762—2012规定食用油中苯并（a）芘的含量≤10 μg/kg[7，8]，欧盟法规No 835/2011规定除了可可油和椰子油，其它油脂中苯并（a）芘≤2 μg/kg，4种PAHs（苯并（a）蒽、屈、苯并（b）荧蒽和苯并（a）芘）之和≤10 μg/kg[9，10]。PAHs提取方法主要有离线和在线两大类，常用的离线方法有液液萃取（LLE）[10，11]、固相萃取（SPE）[12，13]、凝胶渗透色谱（GPC）[14]和供体受体复合色谱法（DACC）[15，16]等，这些方法大多有复杂的前处理过程，费时费力，消耗大量有机溶剂；也有研究建立了基于DACC的在线净化方法[17，18]，但是并不能同时检测欧盟优控PAHs。
本研究建立了检测食用油中15+1种欧盟优控PAHs的在线分析方法，采用在线固相萃取（online-SPE）净化，高效液相色谱紫外/荧光检测器（HPLC-UV/FLD）定量分析。online-SPE的原理是基于DACC，PAHs是π电子供体，与π电子受体的固定相结合而被保留在固定相中。这种在线分析方法可以减少有机溶剂的使用，大大缩短分析时间。
2 实验部分
2.1 仪器与试剂
UltiMate 3000高效液相色谱系统（美国Thermo公司），配有3400型紫外检测器，3100型荧光检测器；Milli-Q超纯水纯化系统（美国Millipore公司）；涡旋振荡器（德国IKA公司）；高速冷冻离心机（德国Sartorius公司）；分析天平（德国Sartorius公司）。
乙腈（ACN）、异丙醇（IPA）均为色谱纯（德国默克股份两合公司）；水为超纯水；15
种欧盟优控PAHs混合标准溶液（德国Dr. Ehrenstorfer公司）：环戊烯（c，d）芘（cyclopenta（c，d）pyrene，CPP）、苯并（a）蒽（Benzo（a）anthracene，BaA）、GFDA2（Chrysene，Chr）、5-甲基-1，2-苯并菲（5-methylchrysene，SMC）、苯并（b）荧蒽（Benzo（b）fluoranthene，BbF）、苯并（j）荧蒽（Benzo（j）fluoranthene，BjF）、苯并（k）荧蒽（Benzo（k）fluoranthene，BkF）、苯并（a）芘（Benzo（a）pyrene，BaP）、二苯并（a， h）蒽（Dibenzo（a，h）anthracene， DaA）、苯并（g，h，i）苝（Benzo（g，hi）perylene，BgP）、茚并（1，2，3-cd）芘（Indeno（1，2，3-cd）pyrene，IcP）、二苯并（a，e）芘（Dibenzo（a，e）pyrene，DeP）、二苯并（a，h）芘（Dibenzo（a，h）pyrene，DhP）、二苯并（a，i）芘（Dibenzo（a，i）pyrene，DiP）、二苯并（a，l）芘（Dibenzo（a，l）pyrene，DlP），苯并（c）芴（benzo（c）fluorene，BcF），每种物质为10 μg/mL的ACN溶液。
2.2 实验方法
2.2.1 空白油样制备
称取约40 g食用油，加入5%活性炭，90℃旋转蒸发2 h，离心后上层液过0.45 μm滤膜。 称取食用油样品4.0 g（精确至0.01 g）， 用IPA溶解并定容至5 mL，混匀过0.45 μm滤膜，待测。
2.2.2 色谱条件
在线固相萃取柱ChromSpher Pi（80 mm×3 mm，Thermo公司），分析柱C18 PAH专用柱（250 mm×4.6 mm，5 μm，Waters公司），柱温30℃，进样盘温度40℃～45℃，根据油的性状进行调整，进样量40 μL，萃取柱用IPA、ACN和水梯度洗脱：0～5 min，100% IPA，流速为0.5 mL/min；5.2～7.0 min，60% ACN，流速为0.5 mL/min；8～29 min，流速为0；30～69 min，100% ACN，流速为0.5 mL/min； 70 min后回到初始状态。分析柱用ACN和水梯度洗脱：0～5 min，60% ACN，流速为0.5 mL/min；6～30 min，60% ACN，流速为1.2 mL/min；30～48 min，60%～100% ACN，流速为1.2 mL/min；48～55 min，100% ACN，流速为1.2 mL/min；55～56 min，100% ACN，流速1.2～2.0 mL/min，维持至80 min； 80 min后回到初始状态。0～7 min为萃取阶段，7～30 min为转移阶段，30～88 min为分析平衡阶段，分别在7和30 min处进行阀切换，具体切换通路见图1。
图1 不同阶段阀切换通路
Fig.1 Column switching mechanism in different periods
3 结果与讨论
3.1 在线萃取条件优化
在线萃取采用ChromSpher Pi柱，运用供体与受体结合的原理进行在线净化，参考文献[19]的方法，用IPA上样。研究表明，用IPA上样流速不宜过大。国外已有的在线净化技术的上样体积较大，通常大于100 μL，洗脱时间约为10～12 min， 运用2个六通阀进行切换，两根色谱柱实现分离[18，19]，过程较为复杂。本研究采用小体积上样，1个六通阀切换，1根色谱柱分离，可以缩短萃取时间，操作简单。采用100% IPA上样，去除油中大分子脂肪酸和色素物质，上样结束后切换六通阀， 用ACN-H2O，去除多余的IPA，过渡到分析柱的洗脱条件。分析柱的初始浓度为60% ACN，为缩小峰宽，改善峰形，同时减少有机溶剂的使用，采用40%ACN进行过渡。
3.2 色谱条件优化
在实验阶段，比较Thermo公司和Waters公司的C18 PAH专用柱（250 mm×4.6 mm， 5 μm），前者无法分离出最后两种物质（DiP和DhP），后者可以达到较好的分离效果。优化洗脱梯度和流速，采用ACN和水为流动相，梯度洗脱。为降低食用油的粘性，适当提高进样盘的温度，一般液态油为40℃，对于半固体油样可以设为45℃。考察柱温（25℃～35℃）对分离效果的影响（图2，在30℃条件下可以达到较好的分离效果。Dip和Dhp在色谱柱上保留较强，在不影响前14种物质分离的条件下，后期加大流速，洗脱最后两种物质。
3.3 检测波长的选择
CCP无荧光，用UV检测，波长为220 nm；欧盟优控的15种PAHs的最佳激发波长和发射波长不同，研究者一般采用多通道检测器，本实验室仪器无法进行多通道荧光检测，采用分时间段切换波长，具体见表1。所得15种荧光PAHs的色谱图见图3，CPP无荧光性，用紫外检测器检测（见图4）。
3.4 方法学验证
用IPA配制系列标准溶液，以浓度值为横坐标，平均峰面积为纵坐标，绘制标准曲线，测得峰面积与质量浓度呈良好的线性关系，线性相关系数R2>0.99，在空白油样中进
图3 15种PAHs标准混合溶液（8 ng/mL）色谱图
Fig.3 Chromatogram of the mixed standard solution of 15 polycyclic aromatic hydrocarbons （PAHs）（8 ng/mL）
图4 CPP（80 ng/mL）紫外检测色谱图
Fig.4 Chromatogram of cyclopenta （c，d） pyrene
（CPP） under UV detection（80 ng/mL）
行低、中、高3个水平加标，每水平重复测定6次，计算回收率和相对标准偏差，回收率为65.25%～110.53%；相对标准偏差为0.1%～9.8%。CPP在UV上响应值较低，3个水平回收率均不高； IcP含5个苯环结构，但出峰时间较6环的BgP晚，空间构型比较特殊，可能因其特殊的空间构型导致低浓度时在SPE柱上保留减弱造成回收率较低。本方法具有良好的精密度和准确性。根据3倍信噪比（S/N）确定LOD，10倍S/N为LOQ，具体见表2。
3.5 实际样品测定
采用本方法检测常用的大豆油、葵花籽油等共10种食用油中欧盟优控15+1种PAHs的含量，结果见表3。根据我国和欧盟关于PAHs的限量标准，其中葡萄籽油中BaP超标（>10 μg/kg），葵花籽油、花生油和紫苏籽油中Bap超过欧盟限量（>2 μg/kg）；葵花籽油、花生油、葡萄籽油和紫苏籽油中BaA， Chr， BbF和BaP之和>10 μg/kg，不满足欧盟限量标准；这10种油中均未检出CPP和DhP。
4 结 论
建立了在线固相萃取技术检测植物油中15+1种欧盟优控多环芳烃的分析方法。通过优化在线萃取和分析条件，可以实现15+1种物质的有效分离。本方法与常规离线方法相比操作简单，省时省力，灵敏度高，重现性好，可以满足我国和国际上对PAHs定量分析的要求，并且大大减少了分析时间，可用于日常分析。
References
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张小涛， 刘玉兰， 王月华. 中国油脂， 2012， 37（10）： 45-49
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食用植物油卫生标准. 中华人民共和国国家标准.GB 2716-2005
9 Commission Regulation （EU） No 835/2011. Amending Regulation （EC） No 1881/2006 as Regards Maximum Levels for Polycyclic Aromatic Hydrocarbons in Foodstuffs. Official Journal of the European Union， 20118.19
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李庆玲， 徐晓琴， 黎先春， 王小如. 分析测试学报， 2006， 25（5）： 33-37
12 Barranco A， Alonso-Salces R M， Bakkal A， Berrueta L A， Gallo B， Vicente F， Sarobe M. J. Chromatogr. A， 2003， 988： 33-40
13 WANG Dao-Wei， ZHAO Shi-Ming， JIN Wei， SHEN Qiu-Ying， HU Ping， HUANG Bin， PAN Xue-Jun. Chinese J. Anal. Chem.， 2013， 41（6）： 861-868
王道玮， 赵世民， 金 伟， 沈秋莹， 胡 平， 黄 斌， 潘学军. 分析化学， 2013， 41（6）： 861-868
14 WANG Feng， ZHANG Zhi-Jie， LIN Hui， CANG Yi-Peng. Chinese J. Food Science， 2014， 35（6）： 142-145
王 峰， 张志杰， 林 慧， 仓义鹏. 食品科学， 2014， 35（6）： 142-145
15 ZHANG Zhi-Wei， ZHU Lin， LIU Hua-Liang， MA Yong-Jian. Chinese J. China Oils and Fats， 2012， 37（3）： 74-77
张志玮， 朱 琳， 刘华良， 马永建. 中国油脂， 2012， 37（3）： 74-77
16 Windal I， Boxus L， Hanot V. J. Chromatogr. A， 2008， 1212： 16-22
17 van Stijn F， Kerkhoff M A T， Vandeginste B G M. J. Chromatogr. A， 1996， 750： 263-273
18 BS EN ISO 22959： 2009. Animal andEdible Fats and Oils-Determination of Polycyclic Aromatic Hydrocarbons by On-line Donoracceptor Complex Chromatography and HPLC with Fluorescence Detection. British Standard
19 Barranco A， Alonso-Salces R M， Corta E， Berrueta L A， Gallo B， Vicente F， Sarobe M. Food Chem.， 2004， 86（3）： 465-474
摘 要 建立了植物油中15+1种欧盟优控多环芳烃的在线固相萃取-高效液相色谱-紫外/荧光（online-SPE-HPLC-UV/FLD）检测分析方法。食用油样品经异丙醇稀释定容并过滤，固相萃取柱ChromSpher Pi （80 mm×3 mm）在线净化，反相C18 PAH专用柱（250 mm×4.6 mm i.d，5 μm）分离，异丙醇、乙腈和水为流动相，梯度洗脱，紫外（220 nm）和荧光检测器检测。结果表明，15+1种多环芳烃在相应的线性范围内峰面积与质量浓度之间线性良好（R2>0.99）；检出限为0.03～12.23 μg/kg；3个水平加标回收率为65.3%～110.5%；相对标准偏差为0.1%～9.8%。
关键词 在线固相萃取；多环芳烃；高效液相色谱；食用油
1 引 言
多环芳烃（Polycyclic aromatic hydrocarbons，PAHs）是普遍存在的持久性环境污染物，有机物的不完全燃烧和热分解、地质化学过程都可能产生PAHs[1，2]。部分PAHs具有致癌性和遗传毒性，没有致癌性的PAHs可以作为促癌剂，对人体健康造成严重危害[3]。 1979年美国环保署（EPA）列出了16种优控PAHs，2008年欧盟食品安全局（EFSA）对食品中PAHs进行评估，列出了15+1种优控PAHs（15+1 EU- priority PAHs），与EPA优控PAHs有8种相同，包含更多毒性较大的重质PAHs，目前的检测方法大多是针对EPA列出的16种PAHs，而对欧盟优控PAHs报道较少。
由于PAHs的亲脂性，在食用油生产、加工和运输过程中可能因环境污染或者加工不当而被污染[4～6]。一些机构和组织也制定了相关的卫生限值，GB2762—2012规定食用油中苯并（a）芘的含量≤10 μg/kg[7，8]，欧盟法规No 835/2011规定除了可可油和椰子油，其它油脂中苯并（a）芘≤2 μg/kg，4种PAHs（苯并（a）蒽、屈、苯并（b）荧蒽和苯并（a）芘）之和≤10 μg/kg[9，10]。PAHs提取方法主要有离线和在线两大类，常用的离线方法有液液萃取（LLE）[10，11]、固相萃取（SPE）[12，13]、凝胶渗透色谱（GPC）[14]和供体受体复合色谱法（DACC）[15，16]等，这些方法大多有复杂的前处理过程，费时费力，消耗大量有机溶剂；也有研究建立了基于DACC的在线净化方法[17，18]，但是并不能同时检测欧盟优控PAHs。
本研究建立了检测食用油中15+1种欧盟优控PAHs的在线分析方法，采用在线固相萃取（online-SPE）净化，高效液相色谱紫外/荧光检测器（HPLC-UV/FLD）定量分析。online-SPE的原理是基于DACC，PAHs是π电子供体，与π电子受体的固定相结合而被保留在固定相中。这种在线分析方法可以减少有机溶剂的使用，大大缩短分析时间。
2 实验部分
2.1 仪器与试剂
UltiMate 3000高效液相色谱系统（美国Thermo公司），配有3400型紫外检测器，3100型荧光检测器；Milli-Q超纯水纯化系统（美国Millipore公司）；涡旋振荡器（德国IKA公司）；高速冷冻离心机（德国Sartorius公司）；分析天平（德国Sartorius公司）。
乙腈（ACN）、异丙醇（IPA）均为色谱纯（德国默克股份两合公司）；水为超纯水；15
种欧盟优控PAHs混合标准溶液（德国Dr. Ehrenstorfer公司）：环戊烯（c，d）芘（cyclopenta（c，d）pyrene，CPP）、苯并（a）蒽（Benzo（a）anthracene，BaA）、GFDA2（Chrysene，Chr）、5-甲基-1，2-苯并菲（5-methylchrysene，SMC）、苯并（b）荧蒽（Benzo（b）fluoranthene，BbF）、苯并（j）荧蒽（Benzo（j）fluoranthene，BjF）、苯并（k）荧蒽（Benzo（k）fluoranthene，BkF）、苯并（a）芘（Benzo（a）pyrene，BaP）、二苯并（a， h）蒽（Dibenzo（a，h）anthracene， DaA）、苯并（g，h，i）苝（Benzo（g，hi）perylene，BgP）、茚并（1，2，3-cd）芘（Indeno（1，2，3-cd）pyrene，IcP）、二苯并（a，e）芘（Dibenzo（a，e）pyrene，DeP）、二苯并（a，h）芘（Dibenzo（a，h）pyrene，DhP）、二苯并（a，i）芘（Dibenzo（a，i）pyrene，DiP）、二苯并（a，l）芘（Dibenzo（a，l）pyrene，DlP），苯并（c）芴（benzo（c）fluorene，BcF），每种物质为10 μg/mL的ACN溶液。
2.2 实验方法
2.2.1 空白油样制备
称取约40 g食用油，加入5%活性炭，90℃旋转蒸发2 h，离心后上层液过0.45 μm滤膜。 称取食用油样品4.0 g（精确至0.01 g）， 用IPA溶解并定容至5 mL，混匀过0.45 μm滤膜，待测。
2.2.2 色谱条件
在线固相萃取柱ChromSpher Pi（80 mm×3 mm，Thermo公司），分析柱C18 PAH专用柱（250 mm×4.6 mm，5 μm，Waters公司），柱温30℃，进样盘温度40℃～45℃，根据油的性状进行调整，进样量40 μL，萃取柱用IPA、ACN和水梯度洗脱：0～5 min，100% IPA，流速为0.5 mL/min；5.2～7.0 min，60% ACN，流速为0.5 mL/min；8～29 min，流速为0；30～69 min，100% ACN，流速为0.5 mL/min； 70 min后回到初始状态。分析柱用ACN和水梯度洗脱：0～5 min，60% ACN，流速为0.5 mL/min；6～30 min，60% ACN，流速为1.2 mL/min；30～48 min，60%～100% ACN，流速为1.2 mL/min；48～55 min，100% ACN，流速为1.2 mL/min；55～56 min，100% ACN，流速1.2～2.0 mL/min，维持至80 min； 80 min后回到初始状态。0～7 min为萃取阶段，7～30 min为转移阶段，30～88 min为分析平衡阶段，分别在7和30 min处进行阀切换，具体切换通路见图1。
图1 不同阶段阀切换通路
Fig.1 Column switching mechanism in different periods
3 结果与讨论
3.1 在线萃取条件优化
在线萃取采用ChromSpher Pi柱，运用供体与受体结合的原理进行在线净化，参考文献[19]的方法，用IPA上样。研究表明，用IPA上样流速不宜过大。国外已有的在线净化技术的上样体积较大，通常大于100 μL，洗脱时间约为10～12 min， 运用2个六通阀进行切换，两根色谱柱实现分离[18，19]，过程较为复杂。本研究采用小体积上样，1个六通阀切换，1根色谱柱分离，可以缩短萃取时间，操作简单。采用100% IPA上样，去除油中大分子脂肪酸和色素物质，上样结束后切换六通阀， 用ACN-H2O，去除多余的IPA，过渡到分析柱的洗脱条件。分析柱的初始浓度为60% ACN，为缩小峰宽，改善峰形，同时减少有机溶剂的使用，采用40%ACN进行过渡。
3.2 色谱条件优化
在实验阶段，比较Thermo公司和Waters公司的C18 PAH专用柱（250 mm×4.6 mm， 5 μm），前者无法分离出最后两种物质（DiP和DhP），后者可以达到较好的分离效果。优化洗脱梯度和流速，采用ACN和水为流动相，梯度洗脱。为降低食用油的粘性，适当提高进样盘的温度，一般液态油为40℃，对于半固体油样可以设为45℃。考察柱温（25℃～35℃）对分离效果的影响（图2，在30℃条件下可以达到较好的分离效果。Dip和Dhp在色谱柱上保留较强，在不影响前14种物质分离的条件下，后期加大流速，洗脱最后两种物质。
3.3 检测波长的选择
CCP无荧光，用UV检测，波长为220 nm；欧盟优控的15种PAHs的最佳激发波长和发射波长不同，研究者一般采用多通道检测器，本实验室仪器无法进行多通道荧光检测，采用分时间段切换波长，具体见表1。所得15种荧光PAHs的色谱图见图3，CPP无荧光性，用紫外检测器检测（见图4）。
3.4 方法学验证
用IPA配制系列标准溶液，以浓度值为横坐标，平均峰面积为纵坐标，绘制标准曲线，测得峰面积与质量浓度呈良好的线性关系，线性相关系数R2>0.99，在空白油样中进
图3 15种PAHs标准混合溶液（8 ng/mL）色谱图
Fig.3 Chromatogram of the mixed standard solution of 15 polycyclic aromatic hydrocarbons （PAHs）（8 ng/mL）
图4 CPP（80 ng/mL）紫外检测色谱图
Fig.4 Chromatogram of cyclopenta （c，d） pyrene
（CPP） under UV detection（80 ng/mL）
行低、中、高3个水平加标，每水平重复测定6次，计算回收率和相对标准偏差，回收率为65.25%～110.53%；相对标准偏差为0.1%～9.8%。CPP在UV上响应值较低，3个水平回收率均不高； IcP含5个苯环结构，但出峰时间较6环的BgP晚，空间构型比较特殊，可能因其特殊的空间构型导致低浓度时在SPE柱上保留减弱造成回收率较低。本方法具有良好的精密度和准确性。根据3倍信噪比（S/N）确定LOD，10倍S/N为LOQ，具体见表2。
3.5 实际样品测定
采用本方法检测常用的大豆油、葵花籽油等共10种食用油中欧盟优控15+1种PAHs的含量，结果见表3。根据我国和欧盟关于PAHs的限量标准，其中葡萄籽油中BaP超标（>10 μg/kg），葵花籽油、花生油和紫苏籽油中Bap超过欧盟限量（>2 μg/kg）；葵花籽油、花生油、葡萄籽油和紫苏籽油中BaA， Chr， BbF和BaP之和>10 μg/kg，不满足欧盟限量标准；这10种油中均未检出CPP和DhP。
4 结 论
建立了在线固相萃取技术检测植物油中15+1种欧盟优控多环芳烃的分析方法。通过优化在线萃取和分析条件，可以实现15+1种物质的有效分离。本方法与常规离线方法相比操作简单，省时省力，灵敏度高，重现性好，可以满足我国和国际上对PAHs定量分析的要求，并且大大减少了分析时间，可用于日常分析。
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