丹龙醒脑方对脑缺血再灌注大鼠侧脑室室管膜下区神经干细胞增殖与c—myc、c—jun表达的影响
周小青 曹泽标 刘旺华 等
摘要：目的 探讨丹龙醒脑方对局灶性脑缺血再灌注大鼠侧脑室室管膜下区（SVZ）神经干细胞（NSCs）增殖与c-myc、c-jun表达的关系。方法 采用线栓法制备大脑中动脉栓塞局灶性脑缺血再灌注模型。150只雄性SD大鼠随机分为假手术组、模型组和丹龙醒脑方小、中、大剂量组。于再灌注24 h后，丹龙醒脑方各剂量组予相应剂量药液灌胃，模型组和假手术组予等体积蒸馏水灌胃。1次/d，连续7 d。再灌注1、3、7 d采用m-NSS法进行神经功能缺损评分，再灌注7 d取缺血侧SVZ脑组织，采用Brdu免疫组化检测NSCs增殖，RT-qPCR、Western blot分别检测c-jun、c-myc mRNA和蛋白的表达。结果 与假手术组比较，其余各组神经功能缺损评分明显升高（P<0.01）；再灌注3、7 d，与模型组比较，丹龙醒脑方各剂量组神经功能缺损评分明显降低（P<0.01）。与假手术组比较，其余各组Brdu阳性细胞率明显升高；与模型组比较，丹龙醒脑方各剂量组Brdu阳性细胞率亦明显升高（P<0.01）。丹龙醒脑方各剂量组较假手术组、模型组c-jun、c-myc蛋白及mRNA表达均明显增强（P<0.05，P<0.01）。结论 丹龙醒脑方能改善脑缺血后神经功能，促进SVZ NSCs增殖，其机制可能与增强c-jun和c-myc表达及延长表达持续时间有关。
关键词：丹龙醒脑方；脑缺血再灌注；侧脑室室管膜下区；神经干细胞增殖；c-jun表达；c-myc表达；大鼠
DOI：10.3969/j.issn.1005-5304.2016.04.013
中图分类号：R285.5 文献标识码：A 文章编号：1005-5304（2016）04-0049-05
Effects of Danlong Xingnao Formula on Proliferation of Neural Stem Cells in SVZ and Expressions of c-jun and c-myc in Cerebral Ischemia Reperfusion Rats ZHOU Xiao-qing1，2， CAO Ze-biao1，3， LIU Wang-hua1，2， CHEN Ping-ting1，3， LI Hua1，2， CHEN Yu-wen1 （1. Institute of Diagnostics Traditional Chinese Medicine， Hunan University of Chinese Medicine， Provincial Key Laboratory of Diagnostics in Chinese Medicine， Changsha 410208， China； 2. Collaborative Center for Research and Innovation of Digital Chinese Medicine， Hunan University of Chinese Medicine， Changsha 410208， China； 3. The First Affiliated Hospital of Hunan University of Chinese Medicine， Changsha 410007， China）
Abstract： Objective To study the relationship of proliferation of neural stem cells （NSCs） in SVZ and the expressions of c-jun and c-myc in rats with middle cerebral artery occlusion/reperfusion （MCAO/R） injury model administrated by Danlong Xingnao Formula. Methods The focal cerebral ischemia reperfusion injury models were prepared by longa method. Totally 150 male SD rats were randomly divided into sham-operation group， cerebral model group， Danlong Xingnao Formula low-， medium-， and high-dose groups. The treatment groups were given corresponding dose of Danlong Xingnao Formula， while the sham-operation group and model group were given the same amount of distilled water 24 h after modeling by gavage， once a day， 7 days in a row. 1 d， 3 d and 7 d after reperfusion， modified Neurological Severity Scores （m-NSS） was used to grade neurologic impairment. 7 d after
基金项目：国家自然科学基金（81373702、81473567、81202632）；教育部博士点基金（20124323120003）；湖南省自然科学基金（13JJ3097）；湖南省教育厅科研项目（14B134、15K092）
通讯作者：刘旺华，E-mail：lwhww@aliyun.com
reperfusion taken to the SVZ brain tissue of ischemia side， Brdu immunohistochemical method was used to record the BrdU positive cells number. The hippocampal c-jun， c-myc mRNA and protein expressions were determined respectively by RT-qPCR method and Western blot method. Results Grades of neurologic impairment in others groups were improved obviously than sham-operation group （P<0.01）； 3 d， and 7 d after reperfusion， grades of neurologic impairment in Danlong Xingnao Formula groups were obviously lower compared with model group （P<0.05， P<0.01）. Brdu positive cell rates in others groups increased obviously compared with sham-operation group； Compared with model group， Brdu positive cell rates in Danlong Xingnao Formula groups increased obviously （P<0.01）. The expressions of c-jun and c-myc protein and mRNA in Danlong Xingnao Formula groups improved obviously than sham-operation group and model group （P<0.01）. Conclusion Danlong Xingnao Formula can improve the neural function after cerebral ischemia and stimulate the proliferation of NSCs， and the mechanism may be related to activating the expression of c-jun and c-myc and extending the duration.
Key words： Danlong Xingnao Formula； cerebral ischemia reperfusion； SVZ； proliferation of NSCs； c-jun expression； c-myc expression； rats
脑血管疾病发生后的主要病理变化为神经元大量丢失导致脑功能缺失。神经干细胞（NSCs）以其自我更新和多向分化潜能为脑血管病的治疗开辟了新的方向。丹龙醒脑方由丹参、三七、地龙、淫羊藿、菟丝子等组成，具有活血通络、补肾生髓之功，临床治疗缺血性脑血管病疗效较好。前期研究表明，丹龙醒脑方能促进NSCs增殖[1]，其机制可能与增强Wnt/β-catenin信号通路上游因子Wnt-3α、β连环蛋白（β-catenin）的表达有关[2]，但对通路下游因子尚未探讨。本实验采用线栓法制备大脑中动脉栓塞局灶性脑缺血再灌注（MCAO/R）大鼠模型，观察侧脑室室管膜下区（SVZ）5-溴脱氧尿嘧啶核苷（Brdu）阳性细胞和通路下游因子c-jun、c-myc的表达，进一步探讨丹龙醒脑方促进NSCs增殖的机制。
1 材料与方法
1.1 动物
SPF级健康雄性SD大鼠150只，体质量250～300 g，12周龄，湖南斯莱克景达动物实验公司，许可证号SCXK（湘）2013-0005。饲养于湖南中医药大学SPF级实验动物中心，饲养环境为多层层流架，恒温20～26 ℃，湿度40%～70%，12 h光照/12 h黑暗，以标准饲料喂养并自由饮用三级过滤纯净水。
1.2 药物
丹龙醒脑方由丹参15 g、三七12 g、地龙6 g、远志15 g、石菖蒲12 g、淫羊藿10 g、菟丝子12 g等组成，饮片购自湖南中医药大学第一附属医院。饮片浸泡30 min，首煎加6倍水，水沸后文火煎60 min，第2煎加3倍水，水沸后文火煎30 min，2次药汁混合，过滤，水浴蒸发浓缩为含原药材1.6 g/mL，灭菌分装，4 ℃冰箱冷藏备用。
1.3 主要试剂与仪器
Brdu粉末（批号E2213）， Sigma公司；Brdu抗体、c-myc兔源性多克隆抗体、c-jun兔源性多克隆抗体，abcam公司；HRP标记的山羊抗小鼠抗体、HRP标记的山羊抗兔抗体、β-actin兔源性多克隆抗体，武汉谷歌生物科技公司；RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit，Thermo；Trizol试剂盒，Invitrogen Life Technologies；引物，Invitrogen Biotechnology Co，LTD。荧光定量PCR仪（型号7300，ABI），光学显微镜及彩色图像分析系统（Optimas，美国），AlphaEase FC专业灰度分析软件（Alpha Innotech），马头牌GPS型双极电凝器（上海医用激光仪器厂）。
1.4 分组
实验大鼠适应性喂养7 d后开始造模。被毛染色法编号，按随机数字表法随机分为假手术组18只和造模组132只，造模组于成模后根据神经功能评分等级采用分层抽样形式分为模型组和丹龙醒脑方小、中、大剂量组（以下简称丹小组、丹中组、丹大组），尽量保证各组平均得分和各等级数目齐同可比。
1.5 造模
参考文献[3]制备MCAO/R大鼠模型。10%水合氯醛3.5 mL/kg腹腔注射麻醉，仰卧位固定。颈正中切口，分离暴露左侧颈总动脉、颈外动脉、颈内动脉和翼颚动脉。结扎翼颚动脉，在距颈动脉叉1 cm处结扎颈外动脉，并于结扎处远心端用电凝器灼断，游离颈外动脉。动脉夹夹闭颈总动脉，提起颈外动脉游离端使其与颈内动脉成一直线，于颈外动脉结扎处近心端约0.5 cm处剪一切口，将线栓蘸取肝素后，由切口向颈内动脉插入至有轻微阻力感停止，固定线栓，扎紧动脉残端，缝合皮下组织和皮肤。术中用烤灯维持肛温36.5～37 ℃。手术完毕后将大鼠放入笼中，注意盖上垫料、调高室温以保温，让其自然清醒。造模过程中注意记录插线时间，插线2 h后再将大鼠麻醉，用直头镊夹住露出皮肤的栓线尾部柔和缓慢地抽出，当栓线球前端遇到颈内动脉结扎线时会有阻力，即停止拔线，剪除栓线的残余末端。大鼠清醒后自由进食、进水。假手术组除不插线外，全过程同造模组。待再灌注24 h大鼠完全清醒后，采用盲法对其神经功能缺损程度进行评分并记录。参照文献[3]5分制法进行评分，分值越高，说明动物行为障碍越严重，评分为1～3分者为成功模型，余剔除，剔除后致大鼠数目不能满足实验要求则及时补充。评分后按前述方法进行分组。
1.6 给药及取材
均于再灌注24 h后开始给药或蒸馏水，每日1次，连续7 d。丹龙醒脑方各剂量组每日给药剂量根据70 kg成人每日服用82 g原药材量进行换算，得出大鼠每日原药材量约为7.4 g/kg，作为丹中组，则丹小组为3.7 g/ kg，丹大组为14.8 g/ kg；假手术组和模型组予等体积蒸馏水灌胃。喂养过程中出现大鼠死亡致数目不够时，随时补充，保证各组不少于18只。每组其中12只于第7日给药2 h后，深度麻醉，颈动脉处死放干血液后迅速断头取脑，冰上快速分离缺血侧SVZ脑组织，随机选6只行RT-qPCR，另6只用于Western blot检测。各组其余大鼠于再灌注24 h后给予腹腔注射Brdu 100 mg/kg，1次/d，连续7 d。于第7日注射2 h后，深度麻醉，常规心脏灌流至肝脏变硬后断头，取缺血侧SVZ脑组织，放入固定液中，脱水、透明、浸蜡，制作脑部冠状切片（厚度5 ?m），隔4片取1片，用于Brdu免疫组化检测。
1.7 指标检测
1.7.1 神经功能缺损评分 依据改良大鼠神经功能缺损评分（m-NSS）[4]，从运动、感觉、反射等方面，分别于再灌注后1、3、7 d采用盲法进行神经功能评分；从运动、感觉、平衡能力及生理反射方面对大鼠各项生理功能进行等级评分，正常计0分，异常者根据量表及严重程度计1～6分，总分最高18分，分值越高表示神经功能损害越严重。
1.7.2 免疫组化检测侧脑室室管膜下区神经干细胞增殖 大鼠SVZ脑组织切片脱蜡至水，水洗3 min×3次，0.1%Trition/0.1%柠檬酸钠液微波修复；苏木素染核，预冷1 mol/L盐酸孵育10 min，2 mol/L盐酸37 ℃孵育30 min；3%双氧水封闭25 min；滴加Brdu抗体（1∶100），4 ℃孵育过夜；滴加HRP标记山羊抗小鼠（1∶300），37 ℃孵育1 h，水洗；DAB显色，脱水，透明，封片。在高倍显微镜下，观察5个不同视野SVZ棕色细胞的数目并记录，即Brdu阳性细胞，以Brdu阳性代表NSCs增殖。计算Brdu阳性细胞率（视野内阳性细胞数÷视野内所有细胞数×100%）。
1.7.3 实时定量荧光PCR检测c-jun、c-myc mRNA表达 应用Trizol试剂盒提取总RNA，以紫外分光光度计A280、A260定量测定浓度；将总RNA经琼脂糖凝胶电泳鉴定，可见明显的28 s、18 s两条区带，证明其完整性。以组织总mRNA，反转录合成cDNA，60 ℃退火，应用SYBR法进行RT-qPCR。引物序列依次为R-c-myc-S：GAGTCAGGGTCATCCCCATCA，R-c-myc-A：CCAAGACGTTGTGTGTCCGC，扩增长度256 bp；R-c-jun-S：AAACGACCTTCTACGACG ATGC，R-c-jun-A：CGGTGTAGTGGTGATGTGCC，扩增长度260 bp；R-actin-S：TTCCTACCCCCAATGTA TCCG，R-actin-A：CATGAGGTCCACCACCCTGTT，扩增长度281 bp。采用2-ΔΔCt法，以2-ΔΔCt值反映目的基因表达水平，其数值越大，表达越强。
1.7.4 Western blot检测c-jun、c-myc蛋白表达 用常规方法提取SVZ脑组织总蛋白，行SDS-PAGE电泳，转膜2 h，用5%脱脂奶粉封闭1 h。一抗4 ℃孵育过夜，c-jun、c-myc及β-actin抗体的稀释比例均为1∶1000；二抗HRP标记山羊抗兔（1∶3000稀释）室温孵育1 h，加ECL化学发光法胶片曝光后用AlphaEase FC软件分析自身灰度值，以目的蛋白条带灰度与管家蛋白β-actin条带灰度比值表示蛋白表达水平，比值越大，表达越强。
1.8 统计学方法
采用SPSS19.0统计软件进行分析。实验数据以—x±s表示，多组间比较采用方差分析，方差齐时选用LSD法，方差不齐时采用Tamhane's T2检验法，所有统计采用双侧检验。检验水准α=0.05。
2 结果
造模过程死亡23只，成模109只；7 d饲养过程中死亡29只，中途未补充大鼠，最终纳入后期检测大鼠为98只，分别为假手术组18只、模型组20只、丹小组19只、丹中组21只、丹大组20只。
2.1 丹龙醒脑方对模型大鼠神经功能缺损评分的影响
再灌注1 d，与假手术组比较，其余各组神经功能缺损评分均明显升高（P<0.01），但随时间变化评分均逐渐下降；再灌注3、7 d，与模型组比较，丹龙醒脑方各剂量组评分均明显降低（P<0.05，P<0.01）。结果见表1。
2.2 丹龙醒脑方对模型大鼠侧脑室室管膜下区神经干细胞增殖的影响
与假手术组比较，其余各组Brdu阳性细胞率明显升高（P<0.01）；与模型组比较，丹龙醒脑方各剂量组阳性细胞（棕色部分）数明显升高（P<0.05，P<0.01）。结果见表1、图1。
2.3 丹龙醒脑方对模型大鼠c-myc、c-jun表达的影响
与假手术组比较，模型组c-jun、c-myc mRNA和蛋白表达差异不明显；与假手术组、模型组比较，丹龙醒脑方各剂量组c-jun、c-myc mRNA和蛋白表达均明显增强（P<0.01）。结果见表2、图2。
3 讨论
NSCs是能主要分化为神经细胞的一种干细胞，广泛存在于神经系统，主要集中于SVZ和海马区。NSCs终身具有自我更新能力，在一定条件下（主要是缺血缺氧）能通过不对称分裂增殖分化成神经元和胶质细胞，参与神经功能的修复过程，即神经再生。神经再生受多种信号通路的调控。在中枢神经系统中，Wnt/β-catenin信号通路是NSCs增殖分化的重要调控环节，其对神经再生的促进和对BMP、Notch拮抗性的“crosstalk”（对话）作用使Wnt/β-catenin在NSCs增殖分化中处于核心地位[5]。该通路由上游的启动因子（Wnt家族蛋白）、跨膜受体（Frizzled家族分子及LRP5/6）、胞浆调节蛋白（Dsh、APC、Gsk-3β、β-catenin）及下游核内转录因子T细胞因子/淋巴样增强因子（TCF/LEF）、靶基因（c-myc、c-jun、cyclin D1、AP-1、COX-2）等组成。当Wnt信号激活、下传，致大量β-catenin在胞浆中聚集并进入细胞核内与TCF/LEF结合形成复合体，最终激活下游靶基因c-myc、c-jun、cyclin D1等的转录，调节神经干细胞的增殖。c-jun、c-myc均属即早基因（IEGs）家族，其表达产物主要为c-jun、c-myc蛋白，它们具有DNA结合活性，充当第三信使，直接或间接地激发其他一些持续存在时间较长的被称为“晚效应基因”的表达。陈氏等[6]研究表明，通过影响一些相关的细胞因子，激活与NSCs增殖相关的信号转导通路，可上调c-myc的表达，进而促进NSCs增殖。Nateri等[7]研究也显示，c-jun的持续表达可使细胞增殖、分化异常，剔除c-jun基因能使小鼠肠道肿瘤变小，肿瘤细胞减少，并且延长小鼠的寿命。
本研究显示，丹龙醒脑方能改善神经功能、促进NSCs增殖，再次验证丹龙醒脑方不仅能多环节干预级联反应，还能促进神经再生，进而发挥抗缺血性脑损伤作用的结论。研究部位还从以往的海马区拓展到SVZ，这符合在内源性NSCs总体极少且分布于脑内各部的情况下，充分地利用和发掘好各部位NSCs这一未来研究的必然趋势。同时，本研究显示，再灌注7 d，模型组与假手术组c-jun、c-myc蛋白及mRNA表达极少，难以检测，且组间无明显差异。其原因可能是IEGs被第二信使介导的相关过程激活后，数分钟内即可表达，但具有一定的时相性，维持时间不长。有研究表明，在正常神经元中c-myc表达较低或不表达，缺血再灌注损伤后阳性率明显高于正常对照组和假手术组，再灌注6 h即开始出现，24 h达高峰，以后则呈下降趋势[8]。另有研究以永久性大脑中动脉栓塞大鼠模型发现假手术组c-myc mRNA表达较少，大鼠缺血后6 h表达明显上调，12 h达高峰，均高于假手术组，24 h下降且与假手术组间差异无统计学意义[9-10]。而7 d时丹龙醒脑方各剂量组c-jun、c-myc蛋白及mRNA仍有较高的表达，较之假手术组和模型组均明显增强，表明丹龙醒脑方能促进c-jun和c-myc的表达，且可延长其表达的持续时间，其机理可能为脑缺血后Wnt/β-catenin信号通路激活。丹龙醒脑方能增强通路上游因子Wnt-3a、β-catenin的表达，进而促进和延长下游因子c-jun、c-myc的持续表达。因此，再灌注7 d，丹龙醒脑方各剂量组c-myc和c-jun处于促神经再生信号和促神经再生调节因子的持续刺激下，使其主要介导细胞增殖的基因从而诱导细胞增殖。
中医认为，肾藏精生髓，充于脑，脑为髓海。王氏等[11]认为，个体的形成是“先天之精”的结果，肝肾精血充足能为NSCs增殖分化提供物质基础。吕氏等[12]研究显示，指出补肾生髓法可使肾精得补，髓海获济，脑神荣养，神机复灵，同时益气活血法可使脉络通利，以恢复脑之气血供养，进而促进神经细胞突触再生或抗神经细胞突触损伤。由此可知，丹龙醒脑方可能通过其活血通络达到改善脑内微环境和营造有利于神经再生的态势，通过补肾生髓达到诱导相关基因的表达和促进内源性细胞因子生成，最终在神经内分泌免疫网络综合调控下，发挥促神经再生作用。
综上，本研究表明丹龙醒脑方能改善MCAO/R模型大鼠神经功能，促进SVZ NSCs增殖，其机制可能与增强c-jun和c-myc表达及延长表达持续时间有关。
参考文献：
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（收稿日期：2015-07-31）
（修回日期：2015-08-23；编辑：华强）
摘要：目的 探讨丹龙醒脑方对局灶性脑缺血再灌注大鼠侧脑室室管膜下区（SVZ）神经干细胞（NSCs）增殖与c-myc、c-jun表达的关系。方法 采用线栓法制备大脑中动脉栓塞局灶性脑缺血再灌注模型。150只雄性SD大鼠随机分为假手术组、模型组和丹龙醒脑方小、中、大剂量组。于再灌注24 h后，丹龙醒脑方各剂量组予相应剂量药液灌胃，模型组和假手术组予等体积蒸馏水灌胃。1次/d，连续7 d。再灌注1、3、7 d采用m-NSS法进行神经功能缺损评分，再灌注7 d取缺血侧SVZ脑组织，采用Brdu免疫组化检测NSCs增殖，RT-qPCR、Western blot分别检测c-jun、c-myc mRNA和蛋白的表达。结果 与假手术组比较，其余各组神经功能缺损评分明显升高（P<0.01）；再灌注3、7 d，与模型组比较，丹龙醒脑方各剂量组神经功能缺损评分明显降低（P<0.01）。与假手术组比较，其余各组Brdu阳性细胞率明显升高；与模型组比较，丹龙醒脑方各剂量组Brdu阳性细胞率亦明显升高（P<0.01）。丹龙醒脑方各剂量组较假手术组、模型组c-jun、c-myc蛋白及mRNA表达均明显增强（P<0.05，P<0.01）。结论 丹龙醒脑方能改善脑缺血后神经功能，促进SVZ NSCs增殖，其机制可能与增强c-jun和c-myc表达及延长表达持续时间有关。
关键词：丹龙醒脑方；脑缺血再灌注；侧脑室室管膜下区；神经干细胞增殖；c-jun表达；c-myc表达；大鼠
DOI：10.3969/j.issn.1005-5304.2016.04.013
中图分类号：R285.5 文献标识码：A 文章编号：1005-5304（2016）04-0049-05
Effects of Danlong Xingnao Formula on Proliferation of Neural Stem Cells in SVZ and Expressions of c-jun and c-myc in Cerebral Ischemia Reperfusion Rats ZHOU Xiao-qing1，2， CAO Ze-biao1，3， LIU Wang-hua1，2， CHEN Ping-ting1，3， LI Hua1，2， CHEN Yu-wen1 （1. Institute of Diagnostics Traditional Chinese Medicine， Hunan University of Chinese Medicine， Provincial Key Laboratory of Diagnostics in Chinese Medicine， Changsha 410208， China； 2. Collaborative Center for Research and Innovation of Digital Chinese Medicine， Hunan University of Chinese Medicine， Changsha 410208， China； 3. The First Affiliated Hospital of Hunan University of Chinese Medicine， Changsha 410007， China）
Abstract： Objective To study the relationship of proliferation of neural stem cells （NSCs） in SVZ and the expressions of c-jun and c-myc in rats with middle cerebral artery occlusion/reperfusion （MCAO/R） injury model administrated by Danlong Xingnao Formula. Methods The focal cerebral ischemia reperfusion injury models were prepared by longa method. Totally 150 male SD rats were randomly divided into sham-operation group， cerebral model group， Danlong Xingnao Formula low-， medium-， and high-dose groups. The treatment groups were given corresponding dose of Danlong Xingnao Formula， while the sham-operation group and model group were given the same amount of distilled water 24 h after modeling by gavage， once a day， 7 days in a row. 1 d， 3 d and 7 d after reperfusion， modified Neurological Severity Scores （m-NSS） was used to grade neurologic impairment. 7 d after
基金项目：国家自然科学基金（81373702、81473567、81202632）；教育部博士点基金（20124323120003）；湖南省自然科学基金（13JJ3097）；湖南省教育厅科研项目（14B134、15K092）
通讯作者：刘旺华，E-mail：lwhww@aliyun.com
reperfusion taken to the SVZ brain tissue of ischemia side， Brdu immunohistochemical method was used to record the BrdU positive cells number. The hippocampal c-jun， c-myc mRNA and protein expressions were determined respectively by RT-qPCR method and Western blot method. Results Grades of neurologic impairment in others groups were improved obviously than sham-operation group （P<0.01）； 3 d， and 7 d after reperfusion， grades of neurologic impairment in Danlong Xingnao Formula groups were obviously lower compared with model group （P<0.05， P<0.01）. Brdu positive cell rates in others groups increased obviously compared with sham-operation group； Compared with model group， Brdu positive cell rates in Danlong Xingnao Formula groups increased obviously （P<0.01）. The expressions of c-jun and c-myc protein and mRNA in Danlong Xingnao Formula groups improved obviously than sham-operation group and model group （P<0.01）. Conclusion Danlong Xingnao Formula can improve the neural function after cerebral ischemia and stimulate the proliferation of NSCs， and the mechanism may be related to activating the expression of c-jun and c-myc and extending the duration.
Key words： Danlong Xingnao Formula； cerebral ischemia reperfusion； SVZ； proliferation of NSCs； c-jun expression； c-myc expression； rats
脑血管疾病发生后的主要病理变化为神经元大量丢失导致脑功能缺失。神经干细胞（NSCs）以其自我更新和多向分化潜能为脑血管病的治疗开辟了新的方向。丹龙醒脑方由丹参、三七、地龙、淫羊藿、菟丝子等组成，具有活血通络、补肾生髓之功，临床治疗缺血性脑血管病疗效较好。前期研究表明，丹龙醒脑方能促进NSCs增殖[1]，其机制可能与增强Wnt/β-catenin信号通路上游因子Wnt-3α、β连环蛋白（β-catenin）的表达有关[2]，但对通路下游因子尚未探讨。本实验采用线栓法制备大脑中动脉栓塞局灶性脑缺血再灌注（MCAO/R）大鼠模型，观察侧脑室室管膜下区（SVZ）5-溴脱氧尿嘧啶核苷（Brdu）阳性细胞和通路下游因子c-jun、c-myc的表达，进一步探讨丹龙醒脑方促进NSCs增殖的机制。
1 材料与方法
1.1 动物
SPF级健康雄性SD大鼠150只，体质量250～300 g，12周龄，湖南斯莱克景达动物实验公司，许可证号SCXK（湘）2013-0005。饲养于湖南中医药大学SPF级实验动物中心，饲养环境为多层层流架，恒温20～26 ℃，湿度40%～70%，12 h光照/12 h黑暗，以标准饲料喂养并自由饮用三级过滤纯净水。
1.2 药物
丹龙醒脑方由丹参15 g、三七12 g、地龙6 g、远志15 g、石菖蒲12 g、淫羊藿10 g、菟丝子12 g等组成，饮片购自湖南中医药大学第一附属医院。饮片浸泡30 min，首煎加6倍水，水沸后文火煎60 min，第2煎加3倍水，水沸后文火煎30 min，2次药汁混合，过滤，水浴蒸发浓缩为含原药材1.6 g/mL，灭菌分装，4 ℃冰箱冷藏备用。
1.3 主要试剂与仪器
Brdu粉末（批号E2213）， Sigma公司；Brdu抗体、c-myc兔源性多克隆抗体、c-jun兔源性多克隆抗体，abcam公司；HRP标记的山羊抗小鼠抗体、HRP标记的山羊抗兔抗体、β-actin兔源性多克隆抗体，武汉谷歌生物科技公司；RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit，Thermo；Trizol试剂盒，Invitrogen Life Technologies；引物，Invitrogen Biotechnology Co，LTD。荧光定量PCR仪（型号7300，ABI），光学显微镜及彩色图像分析系统（Optimas，美国），AlphaEase FC专业灰度分析软件（Alpha Innotech），马头牌GPS型双极电凝器（上海医用激光仪器厂）。
1.4 分组
实验大鼠适应性喂养7 d后开始造模。被毛染色法编号，按随机数字表法随机分为假手术组18只和造模组132只，造模组于成模后根据神经功能评分等级采用分层抽样形式分为模型组和丹龙醒脑方小、中、大剂量组（以下简称丹小组、丹中组、丹大组），尽量保证各组平均得分和各等级数目齐同可比。
1.5 造模
参考文献[3]制备MCAO/R大鼠模型。10%水合氯醛3.5 mL/kg腹腔注射麻醉，仰卧位固定。颈正中切口，分离暴露左侧颈总动脉、颈外动脉、颈内动脉和翼颚动脉。结扎翼颚动脉，在距颈动脉叉1 cm处结扎颈外动脉，并于结扎处远心端用电凝器灼断，游离颈外动脉。动脉夹夹闭颈总动脉，提起颈外动脉游离端使其与颈内动脉成一直线，于颈外动脉结扎处近心端约0.5 cm处剪一切口，将线栓蘸取肝素后，由切口向颈内动脉插入至有轻微阻力感停止，固定线栓，扎紧动脉残端，缝合皮下组织和皮肤。术中用烤灯维持肛温36.5～37 ℃。手术完毕后将大鼠放入笼中，注意盖上垫料、调高室温以保温，让其自然清醒。造模过程中注意记录插线时间，插线2 h后再将大鼠麻醉，用直头镊夹住露出皮肤的栓线尾部柔和缓慢地抽出，当栓线球前端遇到颈内动脉结扎线时会有阻力，即停止拔线，剪除栓线的残余末端。大鼠清醒后自由进食、进水。假手术组除不插线外，全过程同造模组。待再灌注24 h大鼠完全清醒后，采用盲法对其神经功能缺损程度进行评分并记录。参照文献[3]5分制法进行评分，分值越高，说明动物行为障碍越严重，评分为1～3分者为成功模型，余剔除，剔除后致大鼠数目不能满足实验要求则及时补充。评分后按前述方法进行分组。
1.6 给药及取材
均于再灌注24 h后开始给药或蒸馏水，每日1次，连续7 d。丹龙醒脑方各剂量组每日给药剂量根据70 kg成人每日服用82 g原药材量进行换算，得出大鼠每日原药材量约为7.4 g/kg，作为丹中组，则丹小组为3.7 g/ kg，丹大组为14.8 g/ kg；假手术组和模型组予等体积蒸馏水灌胃。喂养过程中出现大鼠死亡致数目不够时，随时补充，保证各组不少于18只。每组其中12只于第7日给药2 h后，深度麻醉，颈动脉处死放干血液后迅速断头取脑，冰上快速分离缺血侧SVZ脑组织，随机选6只行RT-qPCR，另6只用于Western blot检测。各组其余大鼠于再灌注24 h后给予腹腔注射Brdu 100 mg/kg，1次/d，连续7 d。于第7日注射2 h后，深度麻醉，常规心脏灌流至肝脏变硬后断头，取缺血侧SVZ脑组织，放入固定液中，脱水、透明、浸蜡，制作脑部冠状切片（厚度5 ?m），隔4片取1片，用于Brdu免疫组化检测。
1.7 指标检测
1.7.1 神经功能缺损评分 依据改良大鼠神经功能缺损评分（m-NSS）[4]，从运动、感觉、反射等方面，分别于再灌注后1、3、7 d采用盲法进行神经功能评分；从运动、感觉、平衡能力及生理反射方面对大鼠各项生理功能进行等级评分，正常计0分，异常者根据量表及严重程度计1～6分，总分最高18分，分值越高表示神经功能损害越严重。
1.7.2 免疫组化检测侧脑室室管膜下区神经干细胞增殖 大鼠SVZ脑组织切片脱蜡至水，水洗3 min×3次，0.1%Trition/0.1%柠檬酸钠液微波修复；苏木素染核，预冷1 mol/L盐酸孵育10 min，2 mol/L盐酸37 ℃孵育30 min；3%双氧水封闭25 min；滴加Brdu抗体（1∶100），4 ℃孵育过夜；滴加HRP标记山羊抗小鼠（1∶300），37 ℃孵育1 h，水洗；DAB显色，脱水，透明，封片。在高倍显微镜下，观察5个不同视野SVZ棕色细胞的数目并记录，即Brdu阳性细胞，以Brdu阳性代表NSCs增殖。计算Brdu阳性细胞率（视野内阳性细胞数÷视野内所有细胞数×100%）。
1.7.3 实时定量荧光PCR检测c-jun、c-myc mRNA表达 应用Trizol试剂盒提取总RNA，以紫外分光光度计A280、A260定量测定浓度；将总RNA经琼脂糖凝胶电泳鉴定，可见明显的28 s、18 s两条区带，证明其完整性。以组织总mRNA，反转录合成cDNA，60 ℃退火，应用SYBR法进行RT-qPCR。引物序列依次为R-c-myc-S：GAGTCAGGGTCATCCCCATCA，R-c-myc-A：CCAAGACGTTGTGTGTCCGC，扩增长度256 bp；R-c-jun-S：AAACGACCTTCTACGACG ATGC，R-c-jun-A：CGGTGTAGTGGTGATGTGCC，扩增长度260 bp；R-actin-S：TTCCTACCCCCAATGTA TCCG，R-actin-A：CATGAGGTCCACCACCCTGTT，扩增长度281 bp。采用2-ΔΔCt法，以2-ΔΔCt值反映目的基因表达水平，其数值越大，表达越强。
1.7.4 Western blot检测c-jun、c-myc蛋白表达 用常规方法提取SVZ脑组织总蛋白，行SDS-PAGE电泳，转膜2 h，用5%脱脂奶粉封闭1 h。一抗4 ℃孵育过夜，c-jun、c-myc及β-actin抗体的稀释比例均为1∶1000；二抗HRP标记山羊抗兔（1∶3000稀释）室温孵育1 h，加ECL化学发光法胶片曝光后用AlphaEase FC软件分析自身灰度值，以目的蛋白条带灰度与管家蛋白β-actin条带灰度比值表示蛋白表达水平，比值越大，表达越强。
1.8 统计学方法
采用SPSS19.0统计软件进行分析。实验数据以—x±s表示，多组间比较采用方差分析，方差齐时选用LSD法，方差不齐时采用Tamhane's T2检验法，所有统计采用双侧检验。检验水准α=0.05。
2 结果
造模过程死亡23只，成模109只；7 d饲养过程中死亡29只，中途未补充大鼠，最终纳入后期检测大鼠为98只，分别为假手术组18只、模型组20只、丹小组19只、丹中组21只、丹大组20只。
2.1 丹龙醒脑方对模型大鼠神经功能缺损评分的影响
再灌注1 d，与假手术组比较，其余各组神经功能缺损评分均明显升高（P<0.01），但随时间变化评分均逐渐下降；再灌注3、7 d，与模型组比较，丹龙醒脑方各剂量组评分均明显降低（P<0.05，P<0.01）。结果见表1。
2.2 丹龙醒脑方对模型大鼠侧脑室室管膜下区神经干细胞增殖的影响
与假手术组比较，其余各组Brdu阳性细胞率明显升高（P<0.01）；与模型组比较，丹龙醒脑方各剂量组阳性细胞（棕色部分）数明显升高（P<0.05，P<0.01）。结果见表1、图1。
2.3 丹龙醒脑方对模型大鼠c-myc、c-jun表达的影响
与假手术组比较，模型组c-jun、c-myc mRNA和蛋白表达差异不明显；与假手术组、模型组比较，丹龙醒脑方各剂量组c-jun、c-myc mRNA和蛋白表达均明显增强（P<0.01）。结果见表2、图2。
3 讨论
NSCs是能主要分化为神经细胞的一种干细胞，广泛存在于神经系统，主要集中于SVZ和海马区。NSCs终身具有自我更新能力，在一定条件下（主要是缺血缺氧）能通过不对称分裂增殖分化成神经元和胶质细胞，参与神经功能的修复过程，即神经再生。神经再生受多种信号通路的调控。在中枢神经系统中，Wnt/β-catenin信号通路是NSCs增殖分化的重要调控环节，其对神经再生的促进和对BMP、Notch拮抗性的“crosstalk”（对话）作用使Wnt/β-catenin在NSCs增殖分化中处于核心地位[5]。该通路由上游的启动因子（Wnt家族蛋白）、跨膜受体（Frizzled家族分子及LRP5/6）、胞浆调节蛋白（Dsh、APC、Gsk-3β、β-catenin）及下游核内转录因子T细胞因子/淋巴样增强因子（TCF/LEF）、靶基因（c-myc、c-jun、cyclin D1、AP-1、COX-2）等组成。当Wnt信号激活、下传，致大量β-catenin在胞浆中聚集并进入细胞核内与TCF/LEF结合形成复合体，最终激活下游靶基因c-myc、c-jun、cyclin D1等的转录，调节神经干细胞的增殖。c-jun、c-myc均属即早基因（IEGs）家族，其表达产物主要为c-jun、c-myc蛋白，它们具有DNA结合活性，充当第三信使，直接或间接地激发其他一些持续存在时间较长的被称为“晚效应基因”的表达。陈氏等[6]研究表明，通过影响一些相关的细胞因子，激活与NSCs增殖相关的信号转导通路，可上调c-myc的表达，进而促进NSCs增殖。Nateri等[7]研究也显示，c-jun的持续表达可使细胞增殖、分化异常，剔除c-jun基因能使小鼠肠道肿瘤变小，肿瘤细胞减少，并且延长小鼠的寿命。
本研究显示，丹龙醒脑方能改善神经功能、促进NSCs增殖，再次验证丹龙醒脑方不仅能多环节干预级联反应，还能促进神经再生，进而发挥抗缺血性脑损伤作用的结论。研究部位还从以往的海马区拓展到SVZ，这符合在内源性NSCs总体极少且分布于脑内各部的情况下，充分地利用和发掘好各部位NSCs这一未来研究的必然趋势。同时，本研究显示，再灌注7 d，模型组与假手术组c-jun、c-myc蛋白及mRNA表达极少，难以检测，且组间无明显差异。其原因可能是IEGs被第二信使介导的相关过程激活后，数分钟内即可表达，但具有一定的时相性，维持时间不长。有研究表明，在正常神经元中c-myc表达较低或不表达，缺血再灌注损伤后阳性率明显高于正常对照组和假手术组，再灌注6 h即开始出现，24 h达高峰，以后则呈下降趋势[8]。另有研究以永久性大脑中动脉栓塞大鼠模型发现假手术组c-myc mRNA表达较少，大鼠缺血后6 h表达明显上调，12 h达高峰，均高于假手术组，24 h下降且与假手术组间差异无统计学意义[9-10]。而7 d时丹龙醒脑方各剂量组c-jun、c-myc蛋白及mRNA仍有较高的表达，较之假手术组和模型组均明显增强，表明丹龙醒脑方能促进c-jun和c-myc的表达，且可延长其表达的持续时间，其机理可能为脑缺血后Wnt/β-catenin信号通路激活。丹龙醒脑方能增强通路上游因子Wnt-3a、β-catenin的表达，进而促进和延长下游因子c-jun、c-myc的持续表达。因此，再灌注7 d，丹龙醒脑方各剂量组c-myc和c-jun处于促神经再生信号和促神经再生调节因子的持续刺激下，使其主要介导细胞增殖的基因从而诱导细胞增殖。
中医认为，肾藏精生髓，充于脑，脑为髓海。王氏等[11]认为，个体的形成是“先天之精”的结果，肝肾精血充足能为NSCs增殖分化提供物质基础。吕氏等[12]研究显示，指出补肾生髓法可使肾精得补，髓海获济，脑神荣养，神机复灵，同时益气活血法可使脉络通利，以恢复脑之气血供养，进而促进神经细胞突触再生或抗神经细胞突触损伤。由此可知，丹龙醒脑方可能通过其活血通络达到改善脑内微环境和营造有利于神经再生的态势，通过补肾生髓达到诱导相关基因的表达和促进内源性细胞因子生成，最终在神经内分泌免疫网络综合调控下，发挥促神经再生作用。
综上，本研究表明丹龙醒脑方能改善MCAO/R模型大鼠神经功能，促进SVZ NSCs增殖，其机制可能与增强c-jun和c-myc表达及延长表达持续时间有关。
参考文献：
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[2] 张利美，周小青，刘旺华，等.丹龙醒脑方促进脑缺血再灌注损伤大鼠神经干细胞增殖与β-catenin、Wnt-3a表达及其机制的研究[J].湖南中医药大学学报，2015，35（1）：7-10.
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（收稿日期：2015-07-31）
（修回日期：2015-08-23；编辑：华强）
