中药改善肺癌靶向治疗表皮生长因子受体酪氨酸激酶抑制剂获得性耐药研究进展
摘要：表皮生长因子受体酪氨酸激酶抑制剂（EGFR-TKIs）获得性耐药是制约肺癌靶向治疗的瓶颈。中药配合EGFR-TKIs治疗肺癌源于临床，近年来在临床实践的基础上开展转化研究，探讨中药干预改善或逆转EGFR-TKIs获得性耐药成为研究的新靶点。本文综述了清热解毒、活血化瘀中药及基于扶正活血解毒治法的中药复方对EGFR-TKIs获得性耐药的影响与机制，提出中药的整体调节与靶向治疗有可能发挥协同作用，成为肺癌治疗的创新模式。
关键词：表皮生长因子受体酪氨酸激酶抑制剂；获得性耐药；中药；靶向治疗；综述
DOI：10.3969/j.issn.1005-5304.2016.03.038
中图分类号：R285.5 文献标识码：A 文章编号：1005-5304（2016）03-0126-04
Abstract：Acquired resistance of EGFR-TKIs has become the major limitation of the efficacy of targeted therapy for lung cancer. Lung cancer has been treated by traditional Chinese medicine （TCM） combined with EGFR-TKIs， which originated from clinic. In recent years， reversing research has been conducted based on clinic application to discuss TCM intervening， improving and reversing EGFR-TKIs acquired resistance becoming a novel target for research. This article reviewed mechanism and effects of TCM herbs and compounds with the efficacy of clearing away heat and toxic materials， promoting blood circulation to remove blood stasis strengthening the body resistance， and invigorating the circulation of blood， and proposed that the whole regulation and targeted therapy of TCM may carry out synergistic effect and become innovation treatment model for lung cancer.
Key words：EGFR-TKI； acquired resistance； traditional Chinese medicine； targeted therapy； review
原发性肺癌在恶性肿瘤中发病率和死亡率高居榜首。靶向治疗是肺癌研究的里程碑。表皮生长因子受体酪氨酸激酶抑制剂（EGFR-TKIs）是目前应用最广泛、具有代表性的肺癌靶向药物，能够特异性地与细胞内表皮生长因子受体（EGFR）结合，阻断肿瘤生长信号通路，适用于EGFR基因19-21外显子突变阳性的非小细胞肺癌[1-2]。采用EGFR-TKIs治疗并临床获益患者，有70%在6～12个月后会出现肿瘤再次进展，导致治疗失败，其根本原因是因获得性耐药[3-4]。临床研究显示，中药配合EGFR-TKIs治疗肺癌，能一定程度延长患者疾病无进展生存期[5-7]。近年来，在临床实践的基础上开展转化研究，以探讨中医药干预改善或逆转EGFR-TKIs获得性耐药作用机制成为研究的新靶点。现将相关研究进展介绍如下。
1 清热解毒中药
大黄具有清热解毒、泻下攻积、凉血通经功效。大黄素是从大黄中提取的单体。欧阳氏等[8]报道，采用持续诱导的方法构建非小细胞肺癌EGFR-TKI耐药细胞株HCC827/GR，通过新型四唑氮比色法（MTS）检测大黄素（30 μmol/L）、吉非替尼（1 μmol/L）及两药联合处理HCC827和HCC827/GR细胞48 h后细胞增殖能力的变化，采用蛋白质印迹法（Western blot）检测HCC827和HCC827/GR细胞中p-EGFR、p-AKT、p-ERK1/2及p-MET蛋白表达水平的变化。结果显示，经单药吉非替尼或大黄素处理后，HCC827/GR细胞增殖能力未减弱，而两药联合处理组的细胞增殖能力明显下降，差异有统计学意义（P<0.05）；HCC827、HCC827/GR细胞中p-EGFR、p-ERK1/2明显表达，而p-AKT表达微弱；HCC827/GR中p-MET表达水平较HCC827明显上调；经单药吉非替尼处理后，HCC827细胞株p-EGFR、p-ERK1/2表达水平下调，HCC827/GR细胞株p-EGFR表达明显下调；大黄素可显著下调HCC827/GR细胞株p-MET表达，但对p-EGFR、pERK1/2的表达无影响；而大黄素与吉非替尼两药联用可明显抑制HCC827/GR细胞株p-EGFR、p-ERK1/2及p-MET的表达。表明大黄素可逆转非小细胞肺癌EGFR-TKI耐药，其作用机制与抑制c-Met的活化有关。
蟾皮具有清热解毒、利水消肿功效。蟾毒灵是从蟾皮中提取的有效成分。康氏等[9]观察了蟾毒灵对EGFR-TKIs耐药的肺腺癌H1975细胞的影响，发现蟾毒灵联合吉非替尼对接种H1975细胞裸鼠移植瘤抑制率为60.39%，而吉非替尼单药组抑制率为16.14%，2组差异有统计学意义（P<0.05）。认为蟾毒灵可使EGFR-TKIs耐药H1975细胞移植瘤对吉非替尼再次敏感。进一步研究显示，蟾毒灵联合吉非替尼能够使瘤组织中p-EGFR、p-PI3K和p-Akt蛋白表达水平明显下调（P<0.01）。表明蟾毒灵逆转肺腺癌H1975吉非替尼获得性耐药与阻断EGFR-PI3K/Akt信号通路有关。
消癌平注射液具有清热解毒、化痰软坚功效，其主要成分是通关藤。李氏等[10]报道，采用消癌平注射液能使吉非替尼耐药细胞的半数抑制浓度（IC50）降低，肺癌细胞对吉非替尼的敏感性明显增强，两药合用还能显著促进上述耐药细胞的凋亡，优于单独应用吉非替尼和消癌平注射液（P<0.05）。葛氏等[11]报道，消癌平注射液能逆转厄洛替尼对非小细胞肺癌获得性耐药。其采用厄洛替尼耐药肺癌细胞株PC9/G2为靶细胞进行逆转研究，发现消癌平注射液10 mg/mL的非细胞毒剂量下联合厄洛替尼对PC9/G2细胞杀伤作用有明显提高，存活率比单用厄洛替尼组降低15%～23%。说明消癌平注射液对厄洛替尼治疗肺癌有较好的逆转耐药作用。
2 活血化瘀中药
姜黄素是从姜黄、郁金等根茎中提取的一种酚类色素。盛氏等[12]观察了姜黄素对吉非替尼耐药非小细胞肺癌细胞株PC9/G2耐药性的影响及作用机制。结果显示，姜黄素对PC9/G2的无毒剂量为4 μmol/L，姜黄素联合吉非替尼组细胞存活率比单用吉非替尼组降低13%～22%，姜黄素使PI3K的表达水平明显下降，Caspase-3凋亡蛋白活性显著提高。说明姜黄素对PC9/G2具有耐药逆转作用，其作用机制可能与通过下调PI3K的表达水平诱导更多的凋亡蛋白Caspase-3有关。
莪术具有破血行气、消积止痛功效，β-榄香烯是从莪术中提取的单体。郜氏等[13]体外实验观察了β-榄香烯逆转人肺腺癌细胞PC9吉非替尼耐药作用及其机制。结果显示，对吉非替尼耐药的肺腺癌细胞株PC9/ZD，β-榄香烯联合吉非替尼组抑制率为（41.69± 5.06）%，β-榄香烯单药组抑制率为（38.20±5.54）%，分别与吉非替尼对照组比较差异有统计学意义（P<0.05）；流式细胞检测结果显示，与吉非替尼对照组比较，联合用药组的凋亡率为（15.17±2.01）%，β-榄香烯单药组的凋亡率为（7.59±1.35）%，与吉非替尼对照组（5.63±1.19）%比较作用显著；此外，Western blot检测发现，β-榄香烯联合吉非替尼联合用药组的p-Akt和p-Erk蛋白表达量明显减少。说明β-榄香烯具有逆转PC9/ZD细胞耐吉非替尼的作用，其作用机制可能与下调耐药细胞内p-Erk、p-Akt表达水平相关。
3 扶正活血解毒类复方
金复康口服液由黄芪、北沙参、麦冬、女贞子、山萸肉、绞股蓝、淫羊藿、胡芦巴、石上柏、石见穿、重楼、天冬组成，具有益气养阴、清热解毒、活血散结功效。研究表明，该制剂能稳定肺癌患者病灶，抑制肺癌远处转移，改善肺癌患者生存质量，延长生存期[14]。孙氏等[15]采用血清药理学方法观察金复康口服液对人肺腺癌PC-9细胞及人肺腺癌获得性耐吉非替尼PC-9R细胞株的影响。结果显示，金复康口服液不仅能抑制PC-9肺腺癌细胞的生长，还能抑制获得性耐吉非替尼PC-9R细胞的生长，并呈时间及剂量依赖性；吉非替尼与金复康联合后对PC-9R细胞的增殖抑制作用明显增强，IC50明显降低，逆转吉非替尼对PC-9R的耐药倍数为11.3倍，Q值为2.32（>1.15）。说明金复康口服液与吉非替尼联合应用具有协同作用，金复康口服液能够逆转吉非替尼的获得性耐药。通过Western blot、real-time PCR实验进一步研究，发现金复康口服液联合吉非替尼与吉非替尼单药比较，p-EGFR在蛋白质及核酸水平的表达均降低，且差异有统计学意义（P<0.05）。提示金复康口服液对吉非替尼获得性耐药的逆转可能与下调p-EGFR的表达有关。
陈氏等[16]报道，扶正抗癌方（太子参30 g，白术15 g，黄芪30 g，麸炒薏苡仁30 g，甘草10 g，山慈菇30 g，白花蛇舌草30 g，龙葵30 g，石见穿30 g，八月札30 g，蛇泡簕30 g，莪术15 g）具有健脾益气、解毒活血、化痰散结功效。采用CCK-8试剂盒检测扶正抗癌方含药血清对肺癌细胞株A549（对吉非替尼治疗低敏感）增殖影响，显示扶正抗癌方联合吉非替尼作用72 h对A549细胞株杀伤效果优于单药吉非替尼组，说明对吉非替尼有增敏作用；进一步研究发现，其作用机制可能与该方下调p-MAPK和p-EGFR表达有关。
加味四君固本汤由人参、白术、茯苓、炙甘草、黄芪、仙鹤草、白花蛇舌草、薏苡仁、山药、鸡血藤、三七粉、补骨脂组成，具有扶正固本、活血解毒功效。肖氏等[17]以加味四君固本汤含药血清与EGFR靶向治疗药物易瑞莎（Iressa）联用，观察其对人非小细胞肺癌细胞系A549及HCC827增殖的影响。结果显示，Iressa抑制A549和HCC827细胞增殖的IC50分别为46.18 ?mol/L和61.99 ?mol/L（P<0.05）；加味四君固本汤含药血清作用于肺癌细胞后，随着含药血清浓度的逐渐增加，抑制率逐渐增高（P<0.05）；加味四君固本汤含药血清与Iressa联用加强了对A549和HCC827细胞增殖抑制作用（P<0.05）。说明加味四君固本汤含药血清联合Iressa使用可协同抑制A549和HCC827细胞增殖，并存在一定的量效关系。
4 展望
获得性耐药是制约肺癌靶向治疗的瓶颈。既往研究显示，T790M突变、c-Met基因扩增介导的信号通路激活、Ras-Raf-MEK通路活化、HGF介导的Met活化、EGFR旁路TK信号激活和上皮-间质转化（EMT）、IGF-1R介导的EGFR下游通路激活等多种因素参与了EGFR-TKIs获得性耐药[18-22]。即使开发出阿法替尼、达克替尼、AZD9291、CO1686等第二代、第三代EGFR-TKIs，仍无法从根本上克服获得性耐药，其原因在于调控肿瘤生长的信号通路间结成复杂的网络，药物对单一靶点的抑制往往由于旁路信号通路激活而被替代，导致肿瘤继续生长。
中药的特色在于多靶点的整体调节，具有潜在改善或逆转耐药优势[23]，特别是中药复方通过调控肿瘤患者机体内环境，促进机体平衡与稳定，能与靶向药物发挥协同作用。上述研究表明，将中药的整体调节与EGFR-TKIs的靶向治疗结合起来，具有宏观和微观的互补效应，患者疾病无进展生存期得到延长，生活质量得到改善，安全性高，优势明显，有可能成为肺癌治疗的创新模式。但目前的研究尚处于起步阶段，需进一步深入探索其作用机制，不断提高肺癌靶向治疗效果。
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（收稿日期：2015-01-23）
（修回日期：2015-05-27；编辑：梅智胜）
关键词：表皮生长因子受体酪氨酸激酶抑制剂；获得性耐药；中药；靶向治疗；综述
DOI：10.3969/j.issn.1005-5304.2016.03.038
中图分类号：R285.5 文献标识码：A 文章编号：1005-5304（2016）03-0126-04
Abstract：Acquired resistance of EGFR-TKIs has become the major limitation of the efficacy of targeted therapy for lung cancer. Lung cancer has been treated by traditional Chinese medicine （TCM） combined with EGFR-TKIs， which originated from clinic. In recent years， reversing research has been conducted based on clinic application to discuss TCM intervening， improving and reversing EGFR-TKIs acquired resistance becoming a novel target for research. This article reviewed mechanism and effects of TCM herbs and compounds with the efficacy of clearing away heat and toxic materials， promoting blood circulation to remove blood stasis strengthening the body resistance， and invigorating the circulation of blood， and proposed that the whole regulation and targeted therapy of TCM may carry out synergistic effect and become innovation treatment model for lung cancer.
Key words：EGFR-TKI； acquired resistance； traditional Chinese medicine； targeted therapy； review
原发性肺癌在恶性肿瘤中发病率和死亡率高居榜首。靶向治疗是肺癌研究的里程碑。表皮生长因子受体酪氨酸激酶抑制剂（EGFR-TKIs）是目前应用最广泛、具有代表性的肺癌靶向药物，能够特异性地与细胞内表皮生长因子受体（EGFR）结合，阻断肿瘤生长信号通路，适用于EGFR基因19-21外显子突变阳性的非小细胞肺癌[1-2]。采用EGFR-TKIs治疗并临床获益患者，有70%在6～12个月后会出现肿瘤再次进展，导致治疗失败，其根本原因是因获得性耐药[3-4]。临床研究显示，中药配合EGFR-TKIs治疗肺癌，能一定程度延长患者疾病无进展生存期[5-7]。近年来，在临床实践的基础上开展转化研究，以探讨中医药干预改善或逆转EGFR-TKIs获得性耐药作用机制成为研究的新靶点。现将相关研究进展介绍如下。
1 清热解毒中药
大黄具有清热解毒、泻下攻积、凉血通经功效。大黄素是从大黄中提取的单体。欧阳氏等[8]报道，采用持续诱导的方法构建非小细胞肺癌EGFR-TKI耐药细胞株HCC827/GR，通过新型四唑氮比色法（MTS）检测大黄素（30 μmol/L）、吉非替尼（1 μmol/L）及两药联合处理HCC827和HCC827/GR细胞48 h后细胞增殖能力的变化，采用蛋白质印迹法（Western blot）检测HCC827和HCC827/GR细胞中p-EGFR、p-AKT、p-ERK1/2及p-MET蛋白表达水平的变化。结果显示，经单药吉非替尼或大黄素处理后，HCC827/GR细胞增殖能力未减弱，而两药联合处理组的细胞增殖能力明显下降，差异有统计学意义（P<0.05）；HCC827、HCC827/GR细胞中p-EGFR、p-ERK1/2明显表达，而p-AKT表达微弱；HCC827/GR中p-MET表达水平较HCC827明显上调；经单药吉非替尼处理后，HCC827细胞株p-EGFR、p-ERK1/2表达水平下调，HCC827/GR细胞株p-EGFR表达明显下调；大黄素可显著下调HCC827/GR细胞株p-MET表达，但对p-EGFR、pERK1/2的表达无影响；而大黄素与吉非替尼两药联用可明显抑制HCC827/GR细胞株p-EGFR、p-ERK1/2及p-MET的表达。表明大黄素可逆转非小细胞肺癌EGFR-TKI耐药，其作用机制与抑制c-Met的活化有关。
蟾皮具有清热解毒、利水消肿功效。蟾毒灵是从蟾皮中提取的有效成分。康氏等[9]观察了蟾毒灵对EGFR-TKIs耐药的肺腺癌H1975细胞的影响，发现蟾毒灵联合吉非替尼对接种H1975细胞裸鼠移植瘤抑制率为60.39%，而吉非替尼单药组抑制率为16.14%，2组差异有统计学意义（P<0.05）。认为蟾毒灵可使EGFR-TKIs耐药H1975细胞移植瘤对吉非替尼再次敏感。进一步研究显示，蟾毒灵联合吉非替尼能够使瘤组织中p-EGFR、p-PI3K和p-Akt蛋白表达水平明显下调（P<0.01）。表明蟾毒灵逆转肺腺癌H1975吉非替尼获得性耐药与阻断EGFR-PI3K/Akt信号通路有关。
消癌平注射液具有清热解毒、化痰软坚功效，其主要成分是通关藤。李氏等[10]报道，采用消癌平注射液能使吉非替尼耐药细胞的半数抑制浓度（IC50）降低，肺癌细胞对吉非替尼的敏感性明显增强，两药合用还能显著促进上述耐药细胞的凋亡，优于单独应用吉非替尼和消癌平注射液（P<0.05）。葛氏等[11]报道，消癌平注射液能逆转厄洛替尼对非小细胞肺癌获得性耐药。其采用厄洛替尼耐药肺癌细胞株PC9/G2为靶细胞进行逆转研究，发现消癌平注射液10 mg/mL的非细胞毒剂量下联合厄洛替尼对PC9/G2细胞杀伤作用有明显提高，存活率比单用厄洛替尼组降低15%～23%。说明消癌平注射液对厄洛替尼治疗肺癌有较好的逆转耐药作用。
2 活血化瘀中药
姜黄素是从姜黄、郁金等根茎中提取的一种酚类色素。盛氏等[12]观察了姜黄素对吉非替尼耐药非小细胞肺癌细胞株PC9/G2耐药性的影响及作用机制。结果显示，姜黄素对PC9/G2的无毒剂量为4 μmol/L，姜黄素联合吉非替尼组细胞存活率比单用吉非替尼组降低13%～22%，姜黄素使PI3K的表达水平明显下降，Caspase-3凋亡蛋白活性显著提高。说明姜黄素对PC9/G2具有耐药逆转作用，其作用机制可能与通过下调PI3K的表达水平诱导更多的凋亡蛋白Caspase-3有关。
莪术具有破血行气、消积止痛功效，β-榄香烯是从莪术中提取的单体。郜氏等[13]体外实验观察了β-榄香烯逆转人肺腺癌细胞PC9吉非替尼耐药作用及其机制。结果显示，对吉非替尼耐药的肺腺癌细胞株PC9/ZD，β-榄香烯联合吉非替尼组抑制率为（41.69± 5.06）%，β-榄香烯单药组抑制率为（38.20±5.54）%，分别与吉非替尼对照组比较差异有统计学意义（P<0.05）；流式细胞检测结果显示，与吉非替尼对照组比较，联合用药组的凋亡率为（15.17±2.01）%，β-榄香烯单药组的凋亡率为（7.59±1.35）%，与吉非替尼对照组（5.63±1.19）%比较作用显著；此外，Western blot检测发现，β-榄香烯联合吉非替尼联合用药组的p-Akt和p-Erk蛋白表达量明显减少。说明β-榄香烯具有逆转PC9/ZD细胞耐吉非替尼的作用，其作用机制可能与下调耐药细胞内p-Erk、p-Akt表达水平相关。
3 扶正活血解毒类复方
金复康口服液由黄芪、北沙参、麦冬、女贞子、山萸肉、绞股蓝、淫羊藿、胡芦巴、石上柏、石见穿、重楼、天冬组成，具有益气养阴、清热解毒、活血散结功效。研究表明，该制剂能稳定肺癌患者病灶，抑制肺癌远处转移，改善肺癌患者生存质量，延长生存期[14]。孙氏等[15]采用血清药理学方法观察金复康口服液对人肺腺癌PC-9细胞及人肺腺癌获得性耐吉非替尼PC-9R细胞株的影响。结果显示，金复康口服液不仅能抑制PC-9肺腺癌细胞的生长，还能抑制获得性耐吉非替尼PC-9R细胞的生长，并呈时间及剂量依赖性；吉非替尼与金复康联合后对PC-9R细胞的增殖抑制作用明显增强，IC50明显降低，逆转吉非替尼对PC-9R的耐药倍数为11.3倍，Q值为2.32（>1.15）。说明金复康口服液与吉非替尼联合应用具有协同作用，金复康口服液能够逆转吉非替尼的获得性耐药。通过Western blot、real-time PCR实验进一步研究，发现金复康口服液联合吉非替尼与吉非替尼单药比较，p-EGFR在蛋白质及核酸水平的表达均降低，且差异有统计学意义（P<0.05）。提示金复康口服液对吉非替尼获得性耐药的逆转可能与下调p-EGFR的表达有关。
陈氏等[16]报道，扶正抗癌方（太子参30 g，白术15 g，黄芪30 g，麸炒薏苡仁30 g，甘草10 g，山慈菇30 g，白花蛇舌草30 g，龙葵30 g，石见穿30 g，八月札30 g，蛇泡簕30 g，莪术15 g）具有健脾益气、解毒活血、化痰散结功效。采用CCK-8试剂盒检测扶正抗癌方含药血清对肺癌细胞株A549（对吉非替尼治疗低敏感）增殖影响，显示扶正抗癌方联合吉非替尼作用72 h对A549细胞株杀伤效果优于单药吉非替尼组，说明对吉非替尼有增敏作用；进一步研究发现，其作用机制可能与该方下调p-MAPK和p-EGFR表达有关。
加味四君固本汤由人参、白术、茯苓、炙甘草、黄芪、仙鹤草、白花蛇舌草、薏苡仁、山药、鸡血藤、三七粉、补骨脂组成，具有扶正固本、活血解毒功效。肖氏等[17]以加味四君固本汤含药血清与EGFR靶向治疗药物易瑞莎（Iressa）联用，观察其对人非小细胞肺癌细胞系A549及HCC827增殖的影响。结果显示，Iressa抑制A549和HCC827细胞增殖的IC50分别为46.18 ?mol/L和61.99 ?mol/L（P<0.05）；加味四君固本汤含药血清作用于肺癌细胞后，随着含药血清浓度的逐渐增加，抑制率逐渐增高（P<0.05）；加味四君固本汤含药血清与Iressa联用加强了对A549和HCC827细胞增殖抑制作用（P<0.05）。说明加味四君固本汤含药血清联合Iressa使用可协同抑制A549和HCC827细胞增殖，并存在一定的量效关系。
4 展望
获得性耐药是制约肺癌靶向治疗的瓶颈。既往研究显示，T790M突变、c-Met基因扩增介导的信号通路激活、Ras-Raf-MEK通路活化、HGF介导的Met活化、EGFR旁路TK信号激活和上皮-间质转化（EMT）、IGF-1R介导的EGFR下游通路激活等多种因素参与了EGFR-TKIs获得性耐药[18-22]。即使开发出阿法替尼、达克替尼、AZD9291、CO1686等第二代、第三代EGFR-TKIs，仍无法从根本上克服获得性耐药，其原因在于调控肿瘤生长的信号通路间结成复杂的网络，药物对单一靶点的抑制往往由于旁路信号通路激活而被替代，导致肿瘤继续生长。
中药的特色在于多靶点的整体调节，具有潜在改善或逆转耐药优势[23]，特别是中药复方通过调控肿瘤患者机体内环境，促进机体平衡与稳定，能与靶向药物发挥协同作用。上述研究表明，将中药的整体调节与EGFR-TKIs的靶向治疗结合起来，具有宏观和微观的互补效应，患者疾病无进展生存期得到延长，生活质量得到改善，安全性高，优势明显，有可能成为肺癌治疗的创新模式。但目前的研究尚处于起步阶段，需进一步深入探索其作用机制，不断提高肺癌靶向治疗效果。
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（收稿日期：2015-01-23）
（修回日期：2015-05-27；编辑：梅智胜）
