香砂六君子汤对脾胃虚弱型萎缩性胃炎大鼠胃排空功能及胃蛋白酶活性和缺氧诱导因子—1α表达的影响
段云燕 成映霞 王强 李兰珍 王庆胜 郑世铎 鲁鹏程 雷作汉 刘雪松 刘臻华
摘要：目的 观察香砂六君子汤对脾胃虚弱型萎缩性胃炎（CAG）大鼠胃排空功能、胃蛋白酶活性、胃黏膜组织缺氧诱导因子-1α（HIF-1α）基因和蛋白表达的影响，探讨该复方防治CAG的作用机制。方法 受试大鼠按随机数字表法分为空白组和造模组，采用综合法复制脾胃虚弱型CAG动物模型，成模后将模型大鼠分为模型组、阳性对照组和香砂六君子汤高、中、低剂量组。空白组和模型组大鼠每日给予10 mL/kg蒸馏水灌胃，香砂六君子汤大、中、小剂量组每日分别给予24、12、6 g/kg香砂六君子汤药液灌胃，阳性对照组每日给予0.30 g/kg维霉素药剂灌胃，连续给药120 d，检测各组大鼠胃排空功能、胃蛋白酶活性，分别采用实时荧光定量PCR和免疫组化法检测胃黏膜组织HIF-1α基因及蛋白表达。结果 与空白组比较，模型组大鼠胃排空功能、胃蛋白酶活性显著降低（P<0.01），HIF-1α基因和蛋白表达水平显著升高（P<0.01）；与模型组比较，香砂六君子汤各组大鼠胃排空功能、胃蛋白酶活性升高，HIF-1α基因和蛋白表达水平降低，且以香砂六君子汤高剂量组作用显著（P<0.05）。结论 香砂六君子汤具有改善脾胃虚弱型CAG大鼠胃排空功能、促进胃蛋白酶活性、下调缺氧环境中HIF-1α基因和蛋白表达的作用。
关键词：胃排空功能；胃蛋白酶；缺氧诱导因子-1α；萎缩性胃炎；香砂六君子汤；大鼠
DOI：10.3969/j.issn.1005-5304.2016.01.011
中图分类号：R285.5 文献标识码：A 文章编号：1005-5304（2016）01-0047-05
Effects of Xiangsha Liujunzi Decoction on Gastric Emptying Function， Pepsin Activity and Expression of HIF-1α in Chronic Atrophic Gastritis of Rats with Deficiency Spleen and Stomach DUAN Yun-yan1，2， CHENG Ying-xia1，2， WANG Qiang1， LI Lan-zhen2， WANG Qing-sheng1， ZHENG Shi-duo2， LU Peng-cheng2， LEI Zuo-han3， LIU Xue-song1， LIU Zhen-hua1 （1. Gansu University of Chinese Medicine， Lanzhou 730020， China； 2. Key Laboratory of Traditional Chinese Herbs and Prescription Innovation and Transformation of Gansu Province， Lanzhou 730020， China； 3. Gansu Chinese Medicine Hospital， Lanzhou 730020， China）
Abstract： Objective To study effects of Xiangsha Liujunzi Decoction （XSLJZ） on gastric emptying function， pepsin activity and expression of HIF-1α gene and protein of gastric mucosa in chronic atrophic gastritis （CAG） of rats with deficiency of spleen and stomach. Methods Rats were randomly divided into normal group and model group. The models of CAG rats with deficiency of spleen and stomach type were induced by synthetic methods. After the modeling， models rats were divided into model group， positive control group and XSLJZ high-， medium-， and low-dose groups. Normal group and model group were given 10 mL/kg distilled water every day for gavage； XSLJZ high-， medium-， and low-dose groups were given 24， 12， and 6 g/kg XSLJZ Decoction for gavage； positive control
group was given 0.30 g/kg Vatacoenayme for gavage， for successive 120 d. Gastric emptying function and pepsin activity were detected， and HIF-1α gene and protein expression in gastric mucosa were detected by RT-qPCR and IHC. Results Compared with the normal group， the gastric emptying function and pepsin activity in the model group were much lower （P<0.01）； expressions of HIF-1α gene and protein in gastric tissues was much higher （P<0.01）. Compared with model group， XSLJZ could increase the gastric emptying function and pepsin activity significantly （P<0.05）， and decrease expressions of HIF-1α gene and protein （P<0.05）. Conclusion XSLJZ has functions of improving the gastric emptying function， promoting pepsin activity， and reducing expressions of HIF-1α gene and protein.
Key words： gastric emptying function； pepsin； HIF-1α； atrophic gastritis； Xiangsha Liujunzi Decoction； rats
慢性萎缩性胃炎（chronic atrophic gastritis，CAG）作为消化系统常见病，尤其在CAG伴有肠上皮化生和异常增生时，易引起继发性胃癌，严重威胁生命质量。就其临床病症特点而言，中医认为CAG多以脾胃虚弱、气机或气血失调为主要病机，故治疗多以健脾益气、理气和胃为大法。香砂六君子汤出自《古今名医方论》。临床应用显示，香砂六君子汤及其加减方治疗CAG疗效显著[1-2]。本研究通过观察香砂六君子汤对脾胃虚弱型CAG大鼠胃排空功能、胃蛋白酶活性及胃窦黏膜缺氧诱导因子-1α（HIF-1α）基因和蛋白表达的影响，探讨该复方防治CAG的作用机制。
1 实验材料
1.1 动物
2月龄SPF级健康Wistar大鼠54只，体质量（160±10）g，甘肃中医药大学医学实验中心，动物合格证号SCXK（甘）2011-0001-0001010。饲养于甘肃中医药大学SPF级实验室，雌雄各半，分笼饲养，湿度45%～55%，室温（23±2）℃，喂养灭菌标准饲料和消毒纯净水，自由饮水进食。本实验动物处理相关程序遵守中国国家健康与医学研究委员会动物道德准则，并得到甘肃中医药大学动物实验伦理委员会的批准。
1.2 药物
香砂六君子汤以人参、白术、茯苓、陈皮、姜半夏、炒砂仁、木香、生姜、甘草按6∶12∶12∶5∶6∶5∶2∶12∶4比例配制（饮片均购自兰州复兴厚中药材有限责任公司，并经甘肃中医药大学药学院中药生药学教研室杨扶德教授鉴定合格），第1次加10倍量蒸馏水浸泡2 h后，按常法煎煮2次，每次40 min，滤出药液加热浓缩至每1 mL药液含原药材2 g，冷却后置4 ℃冰箱备用，使用时稀释至所需浓度；维酶素片，新乡恒久远药业有限公司，0.2 g/片，批号20140108。
1.3 主要试剂与仪器
脱氧胆酸钠，西格玛奥德里奇（上海）贸易有限公司，批号SLBC0243V；吲哚美辛，上海信谊黄河制药有限公司，批号120702；氨水，白银良友化学试剂有限公司，批号120102；乙醇，天津市富宇精细化工有限公司，批号120100107；考马斯亮蓝蛋白测定试剂盒（批号20140813）、胃蛋白酶测定试剂盒（批号20140821），南京建成生物科技有限公司；β-actin、HIF-1α引物，宝生物工程（大连）有限公司；Trizol试剂（批号AK7208-1）、反转录和实时定量PCR试剂盒（批号0000036802），Promega Corporation；辣根酶标记山羊抗兔IgG（H+L），批号ZB-2301，北京中杉金桥生物科技有限公司；Anti-HIF-1α antibody（批号B3301），美国ImmunoWay公司。DF110型电子分析天平，江苏常熟衡器工业公司；XYJ80-2离心机，广东塘厦骏越机电设备厂；HH-4数显恒温水浴箱，江苏省金坛市友联仪器研究所；Benchmark Plus酶联免疫检测仪、BIOMATE 3S核酸蛋白测定仪、S1000TM逆转录仪、Chemi DOC XRS凝胶成像分析系统、CFX96TM Optics Module PCR仪，美国BIO-RAD公司；BX51/BX52型Olympus系统显微镜，日本Olympus公司。
2 实验方法
2.1 造模与分组
除空白组8只大鼠正常饲养不予造模外，其余46只大鼠参照文献[3]方法造模。造模组采用复合慢性损伤因素联合作用：①60%乙醇，每3 d空腹灌胃1次（前1 d晚上撤除饲料），每次8 mL/kg；②20 mmol/L脱氧胆酸钠灌胃，每日1次，每次8 mL/kg；③每日配制0.1%氨水作为大鼠日常饮用水自由饮用，并记录每日饮用量；④0.05%吲哚美辛灌胃，每日1次，每次8 mL/kg；⑤采用饥饱失常喂养法：2 d足量喂养，1 d禁食。连续造模40周。待综合法造模30周时，每隔1周随机抽检大鼠，取胃黏膜组织做病理检查并判定胃黏膜萎缩病理变化，评价CAG模型大鼠胃黏膜萎缩病理形成后开始治疗。将CAG大鼠按体质量编号，采用随机数字表法分为模型组、阳性对照组和香砂六君子汤高、中、低剂量组，每组8只。
2.2 给药
香砂六君子汤高、中、低剂量组每日分别给予24、12、6 g/kg香砂六君子汤药剂灌胃（相当于60 kg成人剂量的12、6、3倍）；对照组每日给予0.30 g/kg维酶素药剂灌胃（相当于60 kg成人剂量的6倍），等效剂量按人与动物系数折算[4]。连续给药120 d。每日给药体积为10 mL/kg。空白组和模型组给予等量蒸馏水灌胃。
2.3 标本采集与检测
胃排空率实验参照文献[5]方法，于末次给药后禁食不禁水24 h后，分别随机抽取各组大鼠8只，给予半固体营养糊2 mL，30 min后用乌拉坦1 g/kg麻醉采血后，迅速打开腹腔，结扎幽门和贲门后取出胃，清除胃表面的血渍，第1次称重（胃总重），后剪开胃体，洗去胃内容物，用滤纸吸干水分第2次称重（胃净重），计算胃排空率[1-（胃总重-胃净重）÷所给糊重×100%]。胃黏膜组织匀浆制备：麻醉处死后低温条件下快速剖取胃黏膜组织，以冰冷生理盐水冲洗，滤纸吸干，称重后用眼科小剪刀尽快剪碎，置于匀浆器中，用组织重9倍生理盐水匀浆，3500 r/min离心10 min，取上清液，置4 ℃冰箱保存，待测胃组织蛋白酶活性。
2.4 胃黏膜组织缺氧诱导因子-1α基因表达检测
取适量胃窦组织，用Trizol法抽提总RNA：将保存于-80 ℃冷冻冰箱中各组大鼠胃窦组织称取50 mg组织块置于研钵中，加入1 mL Trizol，研磨均匀，于冰上孵育 5 min 后，4 ℃、12 000×g离心5 min；移入离心管中，冰上孵育5 min后加0.2 mL氯仿，震荡后4 ℃、12 000×g离心15 min，取上清液移至新离心管，加0.5 mL异丙醇，震荡，冰上孵育10 min后，4 ℃、12 000×g离心 10 min，弃上清液，RNA沉于管底。向沉淀中加入 1 mL 75%乙醇，震荡后4 ℃、8000×g离心10 min，弃上清液后室温下干燥，加入 50 μL DEPC 处理水溶解RNA。核酸定量分析仪测定其OD260/OD280均在1.8～2.0之间，经总RNA琼脂糖凝胶电泳检测符合纯度要求，可用于后续PCR。
反转录合成模板cDNA：在0.5 mL去酶管中加入总RNA 5 μg、15×Oligo dT 1 μL、Random Primer 1 μL，加Nuclease-Free Water至10 μL；70 ℃变性5 min，然后冰上放置5 min以上；加入反转录GoScriptTM 5×Reaction Buffer 4 μL，MgCl2（25 mmol/L）2 μL，PCR Nucleotide Mix（10 mmol/L）1 μL，Recombinant Rnasin Ribonuclease inhibitor 0.5 μL，GoScriptTM Reverse Transcriptase 1 μL，Nuclease-Free Water至10 μL，总体积为20 μL。混匀配制的反应混合物，短暂离心后在25 ℃温浴5 min，42 ℃反应60 min，再70 ℃、15 min灭活处理，所得单链cDNA放置于-20 ℃备用。从NCBI中查询目标基因ID及序列，由TAKARA公司宝生物工程（大连）有限公司设计和合成目标基因引物。HIF-1α引物序列为：上游5'-CCAGATTCA AGATCAGCCAGCA-3'，下游5'-GCT GTCCACATC AAAGCAGTACTCA-3'，扩增片段长度为100 bp；β-actin引物序列为：上游5'-GGAGATTACTGCCCT GGCTCCTA-3'，下游5'-GACTCATCG TACTCCTGC TTGCTG-3'，扩增片段长度为150 bp。实时荧光定量PCR以β-actin作为内参基因，相同模板相同基因设3复孔、6次平行实验，得到各扩增反应的Ct值。反应体系据GoTaq 2-Step RT-qPCR试剂盒说明书配制。反应参数：预变性95 ℃、2 min，变性95 ℃、15 s，退火60 ℃、60 s，循环40 次，终末延伸65 ℃、5 s。连续检测荧光并记录扩增曲线，采用样点拟合法分析结果得到目的基因和β-actin的Ct值。测Ct值并分析融解曲线，以β-actin为内参，用比较Ct值法计算相对表达量：ΔΔCt=（测试组目的基因Ct值-测试组内参基因Ct值）-（对照组目的基因Ct值-对照组内参基因Ct值），相对表达量用2-ΔΔCt表示。
2.5 胃黏膜组织缺氧诱导因子-1α蛋白表达检测
胃窦组织块浸于4%多聚甲醛中固定后，常规梯度乙醇脱水，二甲苯透明，石蜡包埋，做连续切片，片厚4 μm。取各大鼠等部位切片3张，经二甲苯二级脱蜡各5 min，梯度酒精脱水，高压热修复后滴加1∶100比例稀释的兔抗大鼠HIF-1α一抗4 ℃过夜，次晨取出置常温，PBS冲洗后，滴加二抗，37 ℃孵育l h，DAB显色，水冲洗后苏木素复染、脱水、透明、中性树胶封片。光镜下观察细胞核呈蓝色，阳性细胞肿胀，胞浆黄染；空白组采用0.01 mol/L PBS代替一抗同时进行免疫组化染色，应用BI-2000多媒体彩色病理图像分析系统对免疫组化切片进行图像分析，每个部位取6个视野，分别测量同一视野中反映免疫反应物阳性强度的平均光密度、分布密度数值，并以平均数进行统计学分析。
3 统计学方法
采用SPSS13.0统计软件进行分析。实验数据以—x±s表示，组间样本均数比较采用F检验，在F检验有统计学意义时，再用q检验进行两两比较。P<0.05表示差异有统计学意义。
4 结果
4.1 各组大鼠一般生存情况
空白组大鼠始终表现为反应灵敏，活动及摄食量正常，被毛浓密柔顺而有光泽，粪便呈棕褐色颗粒状。CAG模型50%大鼠第6周即开始出现倦卧、被毛稀疏干枯、摄食量减少；第8周后出现少食怠动、消瘦，对外界反应迟钝的病理表现，随着造模时间延长，大鼠生存能力明显下降，表现为怠动少食、消瘦弓背、毛发枯槁疏散，75%大鼠摄食量明显减少，容易出现眯眼蜷缩、反应迟钝，平均每日体质量增加量和摄食量明显下降。经药物干预后，香砂六君子汤各剂量组和阳性对照组大鼠治疗第10周开始上述症状逐渐减轻或消失，表现为反应较为灵敏，被毛疏散但有光泽，活动及饮食量正常，平均每日体质量增加量和摄食量恢复接近正常，尤其以香砂六君子汤高剂量组大鼠一般生存情况恢复正常明显。
4.2 香砂六君子汤对大鼠胃排空率和胃蛋白酶活性的影响
与空白组比较，模型组大鼠胃排空率和胃蛋白酶活性显著降低（P<0.01）；与模型组比较，香砂六君子汤高、中、低剂量组和阳性对照组均能升高大鼠胃排空率和胃蛋白酶活性，且以香砂六君子汤高剂量组和阳性对照组作用显著（P<0.05）。结果见表1。
4.3 香砂六君子汤对大鼠胃黏膜组织缺氧诱导因子-1α基因表达的影响
与空白组比较，模型组大鼠胃黏膜组织HIF-1α基因表达水平显著升高（P<0.01）；与模型组比较，香砂六君子汤高、中、低剂量组和阳性对照组均能降低大鼠胃黏膜组织HIF-1α基因表达水平，且以香砂六君子汤高剂量组和阳性对照组作用显著（P<0.01）。结果见表2。
4.4 香砂六君子汤对大鼠胃黏膜组织缺氧诱导因子-1α蛋白表达的影响
通过阳性免疫产物表达数据分析，平均光密度和分布密度与HIF-1α蛋白的阳性表达成正比。与空白组比较，模型组大鼠胃黏膜组织阳性免疫产物平均光密度和分布密度计数水平显著升高（P<0.01），提示HIF-1α蛋白表达水平升高；与模型组比较，香砂六君子汤高、中、低剂量组可降低胃黏膜组织阳性免疫产物平均光密度和分布密度计数水平，且以香砂六君子汤高剂量组和阳性对照组作用显著（P<0.05），提示HIF-1α蛋白表达水平降低。结果见表3。
5 讨论
根据CAG的脘腹胀痛、嗳气纳呆、运化迟滞、大便或溏或结、面色萎黄、形体逐渐消瘦等临床表现，可将其归属于中医学“痞满”“胃痞”等范畴，CAG主要病机在于脾胃虚弱（或脾胃虚寒），中焦气机窒塞，此如《素问·至真要大论篇》：“心胃生寒，胸膈不利，心痛否满”；另如《兰室秘藏·中满腹胀论》谓“脾胃久虚之人，胃中寒则生胀满，或脏寒生满病”，故中医临床治疗的基本法则亦多以健脾理气和胃（如香砂六君子汤）为主且疗效显著[6-8]。
香砂六君子汤出自《古今名医方论》，主治因脾胃虚弱，气机阻滞，痰浊、湿毒内生而生“痞满”之效方，亦是体现“健脾理气和胃”治则治法的经典方剂。方中人参补中益气，健脾养胃；白术健脾燥湿；茯苓健脾渗湿；白术、茯苓合用，能增强健脾除湿功能，促进脾胃运化；木香、砂仁芳香健脾和胃，理气消痞而止痛；陈皮、姜半夏燥湿化痰，理气降逆；甘草调胃和中，具有补脾和胃、缓急止痛、调和诸药作用。本方是中医临床治疗CAG的有效方剂。
中医认为，脾（胃）主司运化水谷，主要涉及机体消化吸收功能。从现代医学病理生理学的角度分析，正常胃黏膜具有分泌胃酸和胃蛋白酶的功能以促进摄入物质的初步消化和排空，而CAG患者常因胃黏膜慢性炎性反应，组织充血水肿而胃动力障碍，或因壁细胞数量逐渐减少，胃黏膜腺体发生不同程度萎缩，常伴有分泌功能降低[9]，临床则出现纳呆少食、运化迟滞、嗳气胃胀等消化功能障碍的典型症状。胃蛋白酶是由胃黏膜主细胞所分泌并存在于胃液中的一种消化性蛋白酶，具有促进机体消化食物的功能。研究表明，CAG患者因胃腺体细胞发生不同程度的萎缩，其胃液分泌量和胃蛋白酶减少，同时因胃液pH值改变，胃蛋白酶的活性亦减弱，进而导致胃体化学消化功能降低，从而出现纳呆少食、运化迟滞及胃脘胀满之证[10]。同时从病理学角度分析，CAG病程中主要存在胃黏膜慢性炎性反应及不典型增生等变化，而且HIF-1α与慢性炎性反应的关系密切。HIF-1α是广泛存在于机体细胞中的一种转录调节因子[11]，该基因由低氧诱导并介导细胞对缺氧微环境进行适性反应，缺氧时HIF-1α表达显著上调[12]，由此启动60余种下游因子的转录以使细胞逐渐适应有氧到缺氧的转变，而且HIF-1α与炎症反应关系密切，多种致炎细胞因子如白细胞介素-1β、肿瘤坏死因子-α、前列腺素E2及脂多糖均能激活HIF-1α的转录活性[13]，参与创伤修复重塑及炎症等过程。
本研究结果显示，与空白组比较，模型组大鼠一般生存情况较差，胃排空功能、胃蛋白酶活性显著降低，而HIF-1α基因和蛋白表达水平显著升高，说明大鼠CAG病程中存在胃排空功能紊乱，胃蛋白酶活性下降，而且因胃黏膜组织萎缩、炎性病变表现为缺氧条件下黏膜组织中HIF-1α基因和蛋白高表达；经药物治疗后并与模型组比较，香砂六君子汤组大鼠胃排空功能、胃蛋白酶活性显著升高，HIF-1α基因和蛋白表达下调，且以香砂六君子汤高剂量作用显著，提示香砂六君子汤通过调节胃排空功能，促进胃蛋白酶活性、下调缺氧环境中胃黏膜组织HIF-1α基因和蛋白表达的途径以防治脾胃虚弱型CAG。
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（收稿日期：2015-07-07；编辑：华强）
摘要：目的 观察香砂六君子汤对脾胃虚弱型萎缩性胃炎（CAG）大鼠胃排空功能、胃蛋白酶活性、胃黏膜组织缺氧诱导因子-1α（HIF-1α）基因和蛋白表达的影响，探讨该复方防治CAG的作用机制。方法 受试大鼠按随机数字表法分为空白组和造模组，采用综合法复制脾胃虚弱型CAG动物模型，成模后将模型大鼠分为模型组、阳性对照组和香砂六君子汤高、中、低剂量组。空白组和模型组大鼠每日给予10 mL/kg蒸馏水灌胃，香砂六君子汤大、中、小剂量组每日分别给予24、12、6 g/kg香砂六君子汤药液灌胃，阳性对照组每日给予0.30 g/kg维霉素药剂灌胃，连续给药120 d，检测各组大鼠胃排空功能、胃蛋白酶活性，分别采用实时荧光定量PCR和免疫组化法检测胃黏膜组织HIF-1α基因及蛋白表达。结果 与空白组比较，模型组大鼠胃排空功能、胃蛋白酶活性显著降低（P<0.01），HIF-1α基因和蛋白表达水平显著升高（P<0.01）；与模型组比较，香砂六君子汤各组大鼠胃排空功能、胃蛋白酶活性升高，HIF-1α基因和蛋白表达水平降低，且以香砂六君子汤高剂量组作用显著（P<0.05）。结论 香砂六君子汤具有改善脾胃虚弱型CAG大鼠胃排空功能、促进胃蛋白酶活性、下调缺氧环境中HIF-1α基因和蛋白表达的作用。
关键词：胃排空功能；胃蛋白酶；缺氧诱导因子-1α；萎缩性胃炎；香砂六君子汤；大鼠
DOI：10.3969/j.issn.1005-5304.2016.01.011
中图分类号：R285.5 文献标识码：A 文章编号：1005-5304（2016）01-0047-05
Effects of Xiangsha Liujunzi Decoction on Gastric Emptying Function， Pepsin Activity and Expression of HIF-1α in Chronic Atrophic Gastritis of Rats with Deficiency Spleen and Stomach DUAN Yun-yan1，2， CHENG Ying-xia1，2， WANG Qiang1， LI Lan-zhen2， WANG Qing-sheng1， ZHENG Shi-duo2， LU Peng-cheng2， LEI Zuo-han3， LIU Xue-song1， LIU Zhen-hua1 （1. Gansu University of Chinese Medicine， Lanzhou 730020， China； 2. Key Laboratory of Traditional Chinese Herbs and Prescription Innovation and Transformation of Gansu Province， Lanzhou 730020， China； 3. Gansu Chinese Medicine Hospital， Lanzhou 730020， China）
Abstract： Objective To study effects of Xiangsha Liujunzi Decoction （XSLJZ） on gastric emptying function， pepsin activity and expression of HIF-1α gene and protein of gastric mucosa in chronic atrophic gastritis （CAG） of rats with deficiency of spleen and stomach. Methods Rats were randomly divided into normal group and model group. The models of CAG rats with deficiency of spleen and stomach type were induced by synthetic methods. After the modeling， models rats were divided into model group， positive control group and XSLJZ high-， medium-， and low-dose groups. Normal group and model group were given 10 mL/kg distilled water every day for gavage； XSLJZ high-， medium-， and low-dose groups were given 24， 12， and 6 g/kg XSLJZ Decoction for gavage； positive control
group was given 0.30 g/kg Vatacoenayme for gavage， for successive 120 d. Gastric emptying function and pepsin activity were detected， and HIF-1α gene and protein expression in gastric mucosa were detected by RT-qPCR and IHC. Results Compared with the normal group， the gastric emptying function and pepsin activity in the model group were much lower （P<0.01）； expressions of HIF-1α gene and protein in gastric tissues was much higher （P<0.01）. Compared with model group， XSLJZ could increase the gastric emptying function and pepsin activity significantly （P<0.05）， and decrease expressions of HIF-1α gene and protein （P<0.05）. Conclusion XSLJZ has functions of improving the gastric emptying function， promoting pepsin activity， and reducing expressions of HIF-1α gene and protein.
Key words： gastric emptying function； pepsin； HIF-1α； atrophic gastritis； Xiangsha Liujunzi Decoction； rats
慢性萎缩性胃炎（chronic atrophic gastritis，CAG）作为消化系统常见病，尤其在CAG伴有肠上皮化生和异常增生时，易引起继发性胃癌，严重威胁生命质量。就其临床病症特点而言，中医认为CAG多以脾胃虚弱、气机或气血失调为主要病机，故治疗多以健脾益气、理气和胃为大法。香砂六君子汤出自《古今名医方论》。临床应用显示，香砂六君子汤及其加减方治疗CAG疗效显著[1-2]。本研究通过观察香砂六君子汤对脾胃虚弱型CAG大鼠胃排空功能、胃蛋白酶活性及胃窦黏膜缺氧诱导因子-1α（HIF-1α）基因和蛋白表达的影响，探讨该复方防治CAG的作用机制。
1 实验材料
1.1 动物
2月龄SPF级健康Wistar大鼠54只，体质量（160±10）g，甘肃中医药大学医学实验中心，动物合格证号SCXK（甘）2011-0001-0001010。饲养于甘肃中医药大学SPF级实验室，雌雄各半，分笼饲养，湿度45%～55%，室温（23±2）℃，喂养灭菌标准饲料和消毒纯净水，自由饮水进食。本实验动物处理相关程序遵守中国国家健康与医学研究委员会动物道德准则，并得到甘肃中医药大学动物实验伦理委员会的批准。
1.2 药物
香砂六君子汤以人参、白术、茯苓、陈皮、姜半夏、炒砂仁、木香、生姜、甘草按6∶12∶12∶5∶6∶5∶2∶12∶4比例配制（饮片均购自兰州复兴厚中药材有限责任公司，并经甘肃中医药大学药学院中药生药学教研室杨扶德教授鉴定合格），第1次加10倍量蒸馏水浸泡2 h后，按常法煎煮2次，每次40 min，滤出药液加热浓缩至每1 mL药液含原药材2 g，冷却后置4 ℃冰箱备用，使用时稀释至所需浓度；维酶素片，新乡恒久远药业有限公司，0.2 g/片，批号20140108。
1.3 主要试剂与仪器
脱氧胆酸钠，西格玛奥德里奇（上海）贸易有限公司，批号SLBC0243V；吲哚美辛，上海信谊黄河制药有限公司，批号120702；氨水，白银良友化学试剂有限公司，批号120102；乙醇，天津市富宇精细化工有限公司，批号120100107；考马斯亮蓝蛋白测定试剂盒（批号20140813）、胃蛋白酶测定试剂盒（批号20140821），南京建成生物科技有限公司；β-actin、HIF-1α引物，宝生物工程（大连）有限公司；Trizol试剂（批号AK7208-1）、反转录和实时定量PCR试剂盒（批号0000036802），Promega Corporation；辣根酶标记山羊抗兔IgG（H+L），批号ZB-2301，北京中杉金桥生物科技有限公司；Anti-HIF-1α antibody（批号B3301），美国ImmunoWay公司。DF110型电子分析天平，江苏常熟衡器工业公司；XYJ80-2离心机，广东塘厦骏越机电设备厂；HH-4数显恒温水浴箱，江苏省金坛市友联仪器研究所；Benchmark Plus酶联免疫检测仪、BIOMATE 3S核酸蛋白测定仪、S1000TM逆转录仪、Chemi DOC XRS凝胶成像分析系统、CFX96TM Optics Module PCR仪，美国BIO-RAD公司；BX51/BX52型Olympus系统显微镜，日本Olympus公司。
2 实验方法
2.1 造模与分组
除空白组8只大鼠正常饲养不予造模外，其余46只大鼠参照文献[3]方法造模。造模组采用复合慢性损伤因素联合作用：①60%乙醇，每3 d空腹灌胃1次（前1 d晚上撤除饲料），每次8 mL/kg；②20 mmol/L脱氧胆酸钠灌胃，每日1次，每次8 mL/kg；③每日配制0.1%氨水作为大鼠日常饮用水自由饮用，并记录每日饮用量；④0.05%吲哚美辛灌胃，每日1次，每次8 mL/kg；⑤采用饥饱失常喂养法：2 d足量喂养，1 d禁食。连续造模40周。待综合法造模30周时，每隔1周随机抽检大鼠，取胃黏膜组织做病理检查并判定胃黏膜萎缩病理变化，评价CAG模型大鼠胃黏膜萎缩病理形成后开始治疗。将CAG大鼠按体质量编号，采用随机数字表法分为模型组、阳性对照组和香砂六君子汤高、中、低剂量组，每组8只。
2.2 给药
香砂六君子汤高、中、低剂量组每日分别给予24、12、6 g/kg香砂六君子汤药剂灌胃（相当于60 kg成人剂量的12、6、3倍）；对照组每日给予0.30 g/kg维酶素药剂灌胃（相当于60 kg成人剂量的6倍），等效剂量按人与动物系数折算[4]。连续给药120 d。每日给药体积为10 mL/kg。空白组和模型组给予等量蒸馏水灌胃。
2.3 标本采集与检测
胃排空率实验参照文献[5]方法，于末次给药后禁食不禁水24 h后，分别随机抽取各组大鼠8只，给予半固体营养糊2 mL，30 min后用乌拉坦1 g/kg麻醉采血后，迅速打开腹腔，结扎幽门和贲门后取出胃，清除胃表面的血渍，第1次称重（胃总重），后剪开胃体，洗去胃内容物，用滤纸吸干水分第2次称重（胃净重），计算胃排空率[1-（胃总重-胃净重）÷所给糊重×100%]。胃黏膜组织匀浆制备：麻醉处死后低温条件下快速剖取胃黏膜组织，以冰冷生理盐水冲洗，滤纸吸干，称重后用眼科小剪刀尽快剪碎，置于匀浆器中，用组织重9倍生理盐水匀浆，3500 r/min离心10 min，取上清液，置4 ℃冰箱保存，待测胃组织蛋白酶活性。
2.4 胃黏膜组织缺氧诱导因子-1α基因表达检测
取适量胃窦组织，用Trizol法抽提总RNA：将保存于-80 ℃冷冻冰箱中各组大鼠胃窦组织称取50 mg组织块置于研钵中，加入1 mL Trizol，研磨均匀，于冰上孵育 5 min 后，4 ℃、12 000×g离心5 min；移入离心管中，冰上孵育5 min后加0.2 mL氯仿，震荡后4 ℃、12 000×g离心15 min，取上清液移至新离心管，加0.5 mL异丙醇，震荡，冰上孵育10 min后，4 ℃、12 000×g离心 10 min，弃上清液，RNA沉于管底。向沉淀中加入 1 mL 75%乙醇，震荡后4 ℃、8000×g离心10 min，弃上清液后室温下干燥，加入 50 μL DEPC 处理水溶解RNA。核酸定量分析仪测定其OD260/OD280均在1.8～2.0之间，经总RNA琼脂糖凝胶电泳检测符合纯度要求，可用于后续PCR。
反转录合成模板cDNA：在0.5 mL去酶管中加入总RNA 5 μg、15×Oligo dT 1 μL、Random Primer 1 μL，加Nuclease-Free Water至10 μL；70 ℃变性5 min，然后冰上放置5 min以上；加入反转录GoScriptTM 5×Reaction Buffer 4 μL，MgCl2（25 mmol/L）2 μL，PCR Nucleotide Mix（10 mmol/L）1 μL，Recombinant Rnasin Ribonuclease inhibitor 0.5 μL，GoScriptTM Reverse Transcriptase 1 μL，Nuclease-Free Water至10 μL，总体积为20 μL。混匀配制的反应混合物，短暂离心后在25 ℃温浴5 min，42 ℃反应60 min，再70 ℃、15 min灭活处理，所得单链cDNA放置于-20 ℃备用。从NCBI中查询目标基因ID及序列，由TAKARA公司宝生物工程（大连）有限公司设计和合成目标基因引物。HIF-1α引物序列为：上游5'-CCAGATTCA AGATCAGCCAGCA-3'，下游5'-GCT GTCCACATC AAAGCAGTACTCA-3'，扩增片段长度为100 bp；β-actin引物序列为：上游5'-GGAGATTACTGCCCT GGCTCCTA-3'，下游5'-GACTCATCG TACTCCTGC TTGCTG-3'，扩增片段长度为150 bp。实时荧光定量PCR以β-actin作为内参基因，相同模板相同基因设3复孔、6次平行实验，得到各扩增反应的Ct值。反应体系据GoTaq 2-Step RT-qPCR试剂盒说明书配制。反应参数：预变性95 ℃、2 min，变性95 ℃、15 s，退火60 ℃、60 s，循环40 次，终末延伸65 ℃、5 s。连续检测荧光并记录扩增曲线，采用样点拟合法分析结果得到目的基因和β-actin的Ct值。测Ct值并分析融解曲线，以β-actin为内参，用比较Ct值法计算相对表达量：ΔΔCt=（测试组目的基因Ct值-测试组内参基因Ct值）-（对照组目的基因Ct值-对照组内参基因Ct值），相对表达量用2-ΔΔCt表示。
2.5 胃黏膜组织缺氧诱导因子-1α蛋白表达检测
胃窦组织块浸于4%多聚甲醛中固定后，常规梯度乙醇脱水，二甲苯透明，石蜡包埋，做连续切片，片厚4 μm。取各大鼠等部位切片3张，经二甲苯二级脱蜡各5 min，梯度酒精脱水，高压热修复后滴加1∶100比例稀释的兔抗大鼠HIF-1α一抗4 ℃过夜，次晨取出置常温，PBS冲洗后，滴加二抗，37 ℃孵育l h，DAB显色，水冲洗后苏木素复染、脱水、透明、中性树胶封片。光镜下观察细胞核呈蓝色，阳性细胞肿胀，胞浆黄染；空白组采用0.01 mol/L PBS代替一抗同时进行免疫组化染色，应用BI-2000多媒体彩色病理图像分析系统对免疫组化切片进行图像分析，每个部位取6个视野，分别测量同一视野中反映免疫反应物阳性强度的平均光密度、分布密度数值，并以平均数进行统计学分析。
3 统计学方法
采用SPSS13.0统计软件进行分析。实验数据以—x±s表示，组间样本均数比较采用F检验，在F检验有统计学意义时，再用q检验进行两两比较。P<0.05表示差异有统计学意义。
4 结果
4.1 各组大鼠一般生存情况
空白组大鼠始终表现为反应灵敏，活动及摄食量正常，被毛浓密柔顺而有光泽，粪便呈棕褐色颗粒状。CAG模型50%大鼠第6周即开始出现倦卧、被毛稀疏干枯、摄食量减少；第8周后出现少食怠动、消瘦，对外界反应迟钝的病理表现，随着造模时间延长，大鼠生存能力明显下降，表现为怠动少食、消瘦弓背、毛发枯槁疏散，75%大鼠摄食量明显减少，容易出现眯眼蜷缩、反应迟钝，平均每日体质量增加量和摄食量明显下降。经药物干预后，香砂六君子汤各剂量组和阳性对照组大鼠治疗第10周开始上述症状逐渐减轻或消失，表现为反应较为灵敏，被毛疏散但有光泽，活动及饮食量正常，平均每日体质量增加量和摄食量恢复接近正常，尤其以香砂六君子汤高剂量组大鼠一般生存情况恢复正常明显。
4.2 香砂六君子汤对大鼠胃排空率和胃蛋白酶活性的影响
与空白组比较，模型组大鼠胃排空率和胃蛋白酶活性显著降低（P<0.01）；与模型组比较，香砂六君子汤高、中、低剂量组和阳性对照组均能升高大鼠胃排空率和胃蛋白酶活性，且以香砂六君子汤高剂量组和阳性对照组作用显著（P<0.05）。结果见表1。
4.3 香砂六君子汤对大鼠胃黏膜组织缺氧诱导因子-1α基因表达的影响
与空白组比较，模型组大鼠胃黏膜组织HIF-1α基因表达水平显著升高（P<0.01）；与模型组比较，香砂六君子汤高、中、低剂量组和阳性对照组均能降低大鼠胃黏膜组织HIF-1α基因表达水平，且以香砂六君子汤高剂量组和阳性对照组作用显著（P<0.01）。结果见表2。
4.4 香砂六君子汤对大鼠胃黏膜组织缺氧诱导因子-1α蛋白表达的影响
通过阳性免疫产物表达数据分析，平均光密度和分布密度与HIF-1α蛋白的阳性表达成正比。与空白组比较，模型组大鼠胃黏膜组织阳性免疫产物平均光密度和分布密度计数水平显著升高（P<0.01），提示HIF-1α蛋白表达水平升高；与模型组比较，香砂六君子汤高、中、低剂量组可降低胃黏膜组织阳性免疫产物平均光密度和分布密度计数水平，且以香砂六君子汤高剂量组和阳性对照组作用显著（P<0.05），提示HIF-1α蛋白表达水平降低。结果见表3。
5 讨论
根据CAG的脘腹胀痛、嗳气纳呆、运化迟滞、大便或溏或结、面色萎黄、形体逐渐消瘦等临床表现，可将其归属于中医学“痞满”“胃痞”等范畴，CAG主要病机在于脾胃虚弱（或脾胃虚寒），中焦气机窒塞，此如《素问·至真要大论篇》：“心胃生寒，胸膈不利，心痛否满”；另如《兰室秘藏·中满腹胀论》谓“脾胃久虚之人，胃中寒则生胀满，或脏寒生满病”，故中医临床治疗的基本法则亦多以健脾理气和胃（如香砂六君子汤）为主且疗效显著[6-8]。
香砂六君子汤出自《古今名医方论》，主治因脾胃虚弱，气机阻滞，痰浊、湿毒内生而生“痞满”之效方，亦是体现“健脾理气和胃”治则治法的经典方剂。方中人参补中益气，健脾养胃；白术健脾燥湿；茯苓健脾渗湿；白术、茯苓合用，能增强健脾除湿功能，促进脾胃运化；木香、砂仁芳香健脾和胃，理气消痞而止痛；陈皮、姜半夏燥湿化痰，理气降逆；甘草调胃和中，具有补脾和胃、缓急止痛、调和诸药作用。本方是中医临床治疗CAG的有效方剂。
中医认为，脾（胃）主司运化水谷，主要涉及机体消化吸收功能。从现代医学病理生理学的角度分析，正常胃黏膜具有分泌胃酸和胃蛋白酶的功能以促进摄入物质的初步消化和排空，而CAG患者常因胃黏膜慢性炎性反应，组织充血水肿而胃动力障碍，或因壁细胞数量逐渐减少，胃黏膜腺体发生不同程度萎缩，常伴有分泌功能降低[9]，临床则出现纳呆少食、运化迟滞、嗳气胃胀等消化功能障碍的典型症状。胃蛋白酶是由胃黏膜主细胞所分泌并存在于胃液中的一种消化性蛋白酶，具有促进机体消化食物的功能。研究表明，CAG患者因胃腺体细胞发生不同程度的萎缩，其胃液分泌量和胃蛋白酶减少，同时因胃液pH值改变，胃蛋白酶的活性亦减弱，进而导致胃体化学消化功能降低，从而出现纳呆少食、运化迟滞及胃脘胀满之证[10]。同时从病理学角度分析，CAG病程中主要存在胃黏膜慢性炎性反应及不典型增生等变化，而且HIF-1α与慢性炎性反应的关系密切。HIF-1α是广泛存在于机体细胞中的一种转录调节因子[11]，该基因由低氧诱导并介导细胞对缺氧微环境进行适性反应，缺氧时HIF-1α表达显著上调[12]，由此启动60余种下游因子的转录以使细胞逐渐适应有氧到缺氧的转变，而且HIF-1α与炎症反应关系密切，多种致炎细胞因子如白细胞介素-1β、肿瘤坏死因子-α、前列腺素E2及脂多糖均能激活HIF-1α的转录活性[13]，参与创伤修复重塑及炎症等过程。
本研究结果显示，与空白组比较，模型组大鼠一般生存情况较差，胃排空功能、胃蛋白酶活性显著降低，而HIF-1α基因和蛋白表达水平显著升高，说明大鼠CAG病程中存在胃排空功能紊乱，胃蛋白酶活性下降，而且因胃黏膜组织萎缩、炎性病变表现为缺氧条件下黏膜组织中HIF-1α基因和蛋白高表达；经药物治疗后并与模型组比较，香砂六君子汤组大鼠胃排空功能、胃蛋白酶活性显著升高，HIF-1α基因和蛋白表达下调，且以香砂六君子汤高剂量作用显著，提示香砂六君子汤通过调节胃排空功能，促进胃蛋白酶活性、下调缺氧环境中胃黏膜组织HIF-1α基因和蛋白表达的途径以防治脾胃虚弱型CAG。
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（收稿日期：2015-07-07；编辑：华强）
