亲水相互作用色谱—高分辨质谱分析不同糖胺聚糖寡糖
吴成玲
摘要 建立了亲水相互作用液相色谱质谱联用分析糖胺聚糖类复杂样品的方法。在高分辨质谱联用条件下，流动相5 mmol/L醋酸铵缓冲溶液可有效使用。在此基础上，对不同的色谱柱进行了筛选。其中，氨基亲水相互作用色谱柱对糖胺聚糖类寡糖的分离效果不佳；酰胺基亲水相互作用色谱柱仅适用于透明质酸寡糖的分析，可以有效分离聚合度2～20的透明质酸寡糖；在较高温度下，两性离子基质的亲水相互作用色谱柱可以对聚合度2～30的透明质酸寡糖和聚合度2～12的硫酸软骨素寡糖有效分离；而二醇基亲水相互作用色谱柱对透明质酸（聚合度2～30）、硫酸软骨素（聚合度2～20）以及肝素（聚合度4～20）都适用，并呈现出较好的分离效果。本研究比较了不同类型的亲水相互作用色谱结合高分辨质谱对不同聚合度、不同电荷密度的糖胺聚糖寡糖的分离特点，建立了相应的高效分离和分析方法。本方法有较高的分辨率和质谱适用性。
关键词；亲水相互作用色谱； 四极杆/时间飞行质谱； 糖胺聚糖； 寡糖
1引言
糖胺聚糖是在细胞表面和细胞间基质中被发现的呈线性的酸性多糖。糖胺聚糖通过调节多种细胞活动从而参与到生理和病理学过程中，如细胞的扩增和分化，细胞与细胞的相互作用以及细胞与细胞间基质的相互作用等[1～3]。糖胺聚糖基于它们的单糖组成以及单糖之间糖苷键的位置和构象，可以大体分为4类：透明质酸（HA），硫酸皮肤素/硫酸软骨素（DS/CS），硫酸乙酰肝素/肝素（HS/HP）和硫酸角质素（KS）。糖胺聚糖类与蛋白质相互作用的特异性取决于糖胺聚糖种类、大小、糖组成、电荷密度和序列等[4，5]。相对于糖胺聚糖的其它结构特征，SO2
Symbolm@@ 4数目多少大体排序为HP>DS≈CS≈HS>HA [9 ]。糖胺聚糖类寡糖经常被作为模型，用于研究糖胺聚糖结构与活性的关系。针对不同糖胺聚糖构效关系研究、糖胺聚糖酶活力测定、糖胺聚糖降解程度、糖胺聚糖寡糖制备的监控，建立有效的糖胺聚糖寡糖在线分析方法至关重要。
目前，用于分析糖胺聚糖类寡糖的方法有强阴离子交换（SAX）高效液相色谱（HPLC）和反相离子对（IPRP）色谱 [10～12 ]等。然而，强阴离子交换色谱方法呈现出较低的分辨率和稳定性，同时它使用的高浓度的无机缓冲盐溶液限制了它与质谱的联用，从而无法在线检测所得寡糖的分子量、组成和序列；IPRP方法有较好的分辨率，而且所使用的挥发性离子对试剂可以用于质谱，但是它们通常残留在离子源和毛细管中，从而降低了质谱的灵敏度和分辨率 [13，14 ]。
本研究针对具有不同电荷密度的糖胺聚糖寡糖，采用4种基质的亲水相互作用色谱（HILIC）方法。研究表明，与SAX和IPRP方法相比，HILIC方法有更好的质谱兼容性； 同时，针对不同的糖胺聚糖寡糖可以选择不同的HILIC方法。2实验部分
2.1仪器与试剂
Agilent 1260 Infinity液相色谱仪串联四级杆/飞行时间（Q/TOF）质谱（6540，美国Agilent公司）。醋酸铵、硫酸软骨素A（CSA） 和HA（美国Sigma公司）；乙腈（德国Merck公司）；软骨素ABC酶（Chondroitinase ABC，北京艾德豪克国际技术有限公司）；低分子量肝素：依诺肝素为美国药典标准品（USP）。
2.2实验方法
2.2.1酶水解制备HA寡糖、CSA寡糖分别取2.0 mg HA和CSA样品溶于400 μL酶解缓冲液（10 mmol/L 磷酸盐缓冲液，pH 6.8），将HA和CSA样品配制成5 mg/mL溶液，分别加入软骨素酶ABC 5 mU，置于水浴箱中37℃反应4 h。酶解液高温灭活然后离心，上清液备用。
2.2.2寡糖的高效液相亲水相互作用色谱分析（HPLCHILIC）
流动相A为5 mmol/L醋酸铵溶液，流动相B为5 mmol/L醋酸铵95%乙腈溶液，紫外检测器设置为232 nm在线检测。氨基HILIC色谱柱（250 mm×4.6 mm， 5 μm， 日本COSMOSIL公司）；酰胺基HILIC色谱柱（250 mm×4.6 mm， 5 μm，北京华谱新创公司），柱温30℃，流速0.5 mL/min，30 min内流动相B从90% 降到 35%进行梯度洗脱；两性离子（ZIC）HILIC色谱柱 （100 mm×2.1 mm， 5 μm，德国 Merck公司），柱温30℃/85℃，流速0.3 mL/min，25 min内流动相B从90% 降到 35%进行梯度洗脱；二醇基HILIC色谱柱 （150 mm×2.0 mm， 3 μm LUNA， 加拿大Phenonenex公司），柱温30℃，流速0.3 mL/min，25 min内流动相B从90% 降到 35%进行梯度洗脱。
2.2.3寡糖的质谱分析
氮气用作雾化气，雾化压力为30 Pa。喷雾电压为3.5 kV，氮气流速为8 L/min，干燥过程中温度为350℃。碎片电压为100 V。在m/z 100～2000的范围内进行全离子流扫描。所有数据都在负离子模式下进行采集，经Mass Hunter工作站下处理。3结果与讨论
3.1氨基HILIC色谱柱对糖胺聚糖类寡糖的分析
在文献＼[15＼]中，氨基HILIC色谱柱已被用于糖胺聚糖二糖分析＼[15＼]，但该法以高浓度不挥发性缓冲盐作为流动相，因此无法与质谱联用，而且对于寡糖的分离和分析并没有直接的报道。本实验使用氨基HILIC色谱柱进行糖胺聚糖的寡糖分析，结果表明，即使在高浓度醋酸铵缓冲盐的条件下，寡聚糖仍然无法被完全洗脱（谱图未显示），而据经验100 mmol/L以上的挥发性盐已经对质谱检测造成了影响。造成这种现象可能是该氨基柱中树脂表面键合的氨基基团与糖胺聚糖寡糖结合作用太强，
3.2酰胺基HILIC色谱柱对糖胺聚糖类寡糖的分离
采用酰胺基HILIC色谱柱分别对HA、CSA和HP进行分析，结果表明，HA寡聚糖能够得到很好的分离，如图1所示。根据相应质谱结果（图谱未显示），色谱图中每个峰得到了准确的归属。其中HA寡聚糖在聚合度2～20的范围内能够得到很好的分离。然而在使用此色谱柱对CSA与HP寡糖混合物进行分离时，在合理的缓冲盐浓度范围内无法有效洗脱寡糖（谱图未显示）。该色谱柱树脂表面的酰胺基团具有较弱的离子作用，能够与含有较少负电荷的HA的寡聚糖产生适当的相互作用，并能够有效分离HA寡糖。
3.3两性离子（ZIC）HILIC色谱柱对糖胺聚糖类寡糖的分析
本实验使用ZICHILIC色谱柱分别对3种糖胺聚糖类寡糖进行了分析。结果表明，HA寡糖在聚合度2～28的范围内达到较好分离，如图2A所示，其中质谱结果确认了它们的聚合度（图谱未显示）。ZICHILIC的两性离子基质使得HA寡聚糖达到了更高的分辨率。然而HA的每一个寡糖都分裂成了两个峰，这是由寡糖还原端产生的α和β构型共存导致的（图2A）。根据文献＼[16，17＼]，增加柱温可以减少或消除这种现象。因此，本实验中将柱温升高到85
SymbolpB@ C，每个HA寡糖在常温下出现的双峰完全消失，同时还保留了较高的分辨率（图2B）。此外，此色谱柱也对CSA具有较好的分辨率（图2C）。但此色谱柱不适用于HP的分离分析。
3.4二醇基（Diol）HILIC色谱柱对糖胺聚糖类寡糖的分离
使用DiolHILIC色谱柱分别对3种寡聚糖进行了分离。结果表明，HA寡糖在聚合度2～30范围内能够得到有效分离（图3A）；CSA寡糖在聚合度2～20范围内达到较好分离（图3B）；HP寡糖在聚合度4～20范围内也得到了较高分辨率的分离（图3C）。质谱数据确定了每个相应色谱峰的聚合度（图谱未显示）。在图3可见，只有HA寡聚糖中一些低聚合度的寡糖出现了α、β共存导致的分岔现象。此类型色谱柱树脂表面二醇基的弱电离作用使得具有不同分子大小和不同电荷密度的这类聚阴离子寡糖都能得到较好的分离效果。
色谱柱30℃条件下所得HA（A）， CSA（B）， 肝素（C）的分离效果谱图。
HA oligosaccharides （A）， CSA oligosaccharides （B） and heparin（HP） oligosaccharides obtained on the diolHILIC column at 30℃. 4结 论
建立了亲水相互作用液相色谱质谱联用分析糖胺聚糖类复杂样品的方法。对4种具有不同基质的HILIC色谱柱进行了评价。对于HA寡聚糖，具有最低的电荷密度，可以使用酰胺基HILIC、ZICHILIC和DiolHILIC在5 mmol/L乙酸铵存在下用常规的正相色谱条件进行分析。对于CSA寡糖，平均每个二糖单位中含有一个羧基和一个硫酸根，可以使用ZICHILIC和DiolHILIC色谱柱在5 mmol/L乙酸铵的存在下用常规的正相色谱条件进行分析。而肝素寡糖只能使用DiolHILIC色谱柱在以上条件下进行分离。以上方法均在低浓度的挥发性缓冲盐条件下进行，能够与质谱高效结合。其中，ZICHILIC需要较高的柱温消除α、β共存，而DiolHILIC色谱柱能够在较低温度条件下实现不同大小分子及不同电荷密度的糖胺聚糖类寡糖的高效分离分析。
References
1Wu Z L， Zhang L， Beeler D L， Kuberan B， Rosenberg R D. Faseb J.， 2002， 16（6）： 539-545
2Capila，Linhardt R J. Angew. Chem. Intl. Ed， 2002， 41（3）： 391-412
3Bernfield M， Gotte M， Park P W， Reizes O， Fitzgerald M L， Lincecum J， Zako M. Annu. Rev. Biochem.， 1999， 68： 729-777
4Taylor K R， Gallo R L. Faseb J.， 2006， 20（1）： 9-22
5Sasisekharan R， Raman R， Prabhakar V. Annu. Rev. Biomed. Eng.， 2006， 8： 181-231
6Leymarie N， McComb M E， Naimy H， Staples G O， Zaia J. Int. J. Mass Spectrom.， 2012， 312： 144-154
7Pfeiler E. Comp. Biochem. Physiol.， 1998， 119： 137-144
8Maimone M M， Tollefsen D M. J. Biol. Chem.， 1990， 265（30）： 18263-18271
9Liu L， Linhardt R J， Zhang Z. Carbohydr. Polym.， 2014， 106： 343-350
10Mourier P， Anger P， Martinez C， Herman F， Viskov C. Anal. Chem. Res.， 2015， 3： 46-53
11Thanawiroon C， Linhardt R J. J. Chromatogr. A， 2003， 1014（12）： 215-223
12Linhardt R J， Gu K N， Loganathan D， Carter S R. Anal. Biochem.， 1989， 181（2）： 288-296
13Wang Z， Li D， Sun X， Bai X， Jin L， Chi L. Anal. Biochem.， 2014， 451： 35-41
14Nuijs A L N V， Tarcomnicu I， Covaci A. J. Chromatogr. A， 2011， 1218： 5964-5974
15Aral T， Aral H， Ziyadanoullar B， Ziyadanoullar R. Talanta， 2015， 131： 64-73
16Gill V L， Aich U， Rao S， Pohl C， Zaia J. Anal. Chem.， 2013， 85（2）： 1138-1145
17Johnsen E， Wilson S R， Odsbu I， Krapp A， Malerod H， Skarstad K， Lundanes E. J. Chromatogr. A， 2011， 1218（35）： 5981-5986
AbstractA hydrophilic interaction liquid chromatography （HILIC）mass spectrometric （MS） method was developed for the analysis of glycosaminoglycan （GAG） oligosaccharides. By using 5 mmol/L NH4Ac as the mobile phase which was compatible with MS， four types of HILIC columns were investigated to analyze GAG oligosaccharides. The results showed that， aminoHILIC column was unsuitable for all glycosaminoglycan （GAG） oligosaccharides， amideHILIC column was useful only for hyaluronan oligosaccharides from dp2 to dp20， zwitterionic phase HILIC column was useful for hyaluronan oligosaccharides from dp2 to dp30 and to a lesser extent for chondroitin oligosaccharides from dp2 to dp12， and diolHILIC column afforded excellent resolution of hyaluronan （dp2-dp30）， chondroitin sulfate （dp2-dp20） and heparin （dp4-dp20） oligosaccharides. In conclusion， different HILIC columns were investigated and on the basis of this， GAG oligosaccharides were separated and then analyzed by HILIC MS method. The developed methods have higher resolution and better compatibility of MS.
KeywordsHydrophilic interaction liquid chromatography； Quadrupoletimeofflight mass spectrometry； Glycosaminoglycan； Oligosaccharides
（Received 21 March 2015； accepted 31 May 2015）
摘要 建立了亲水相互作用液相色谱质谱联用分析糖胺聚糖类复杂样品的方法。在高分辨质谱联用条件下，流动相5 mmol/L醋酸铵缓冲溶液可有效使用。在此基础上，对不同的色谱柱进行了筛选。其中，氨基亲水相互作用色谱柱对糖胺聚糖类寡糖的分离效果不佳；酰胺基亲水相互作用色谱柱仅适用于透明质酸寡糖的分析，可以有效分离聚合度2～20的透明质酸寡糖；在较高温度下，两性离子基质的亲水相互作用色谱柱可以对聚合度2～30的透明质酸寡糖和聚合度2～12的硫酸软骨素寡糖有效分离；而二醇基亲水相互作用色谱柱对透明质酸（聚合度2～30）、硫酸软骨素（聚合度2～20）以及肝素（聚合度4～20）都适用，并呈现出较好的分离效果。本研究比较了不同类型的亲水相互作用色谱结合高分辨质谱对不同聚合度、不同电荷密度的糖胺聚糖寡糖的分离特点，建立了相应的高效分离和分析方法。本方法有较高的分辨率和质谱适用性。
关键词；亲水相互作用色谱； 四极杆/时间飞行质谱； 糖胺聚糖； 寡糖
1引言
糖胺聚糖是在细胞表面和细胞间基质中被发现的呈线性的酸性多糖。糖胺聚糖通过调节多种细胞活动从而参与到生理和病理学过程中，如细胞的扩增和分化，细胞与细胞的相互作用以及细胞与细胞间基质的相互作用等[1～3]。糖胺聚糖基于它们的单糖组成以及单糖之间糖苷键的位置和构象，可以大体分为4类：透明质酸（HA），硫酸皮肤素/硫酸软骨素（DS/CS），硫酸乙酰肝素/肝素（HS/HP）和硫酸角质素（KS）。糖胺聚糖类与蛋白质相互作用的特异性取决于糖胺聚糖种类、大小、糖组成、电荷密度和序列等[4，5]。相对于糖胺聚糖的其它结构特征，SO2
Symbolm@@ 4数目多少大体排序为HP>DS≈CS≈HS>HA [9 ]。糖胺聚糖类寡糖经常被作为模型，用于研究糖胺聚糖结构与活性的关系。针对不同糖胺聚糖构效关系研究、糖胺聚糖酶活力测定、糖胺聚糖降解程度、糖胺聚糖寡糖制备的监控，建立有效的糖胺聚糖寡糖在线分析方法至关重要。
目前，用于分析糖胺聚糖类寡糖的方法有强阴离子交换（SAX）高效液相色谱（HPLC）和反相离子对（IPRP）色谱 [10～12 ]等。然而，强阴离子交换色谱方法呈现出较低的分辨率和稳定性，同时它使用的高浓度的无机缓冲盐溶液限制了它与质谱的联用，从而无法在线检测所得寡糖的分子量、组成和序列；IPRP方法有较好的分辨率，而且所使用的挥发性离子对试剂可以用于质谱，但是它们通常残留在离子源和毛细管中，从而降低了质谱的灵敏度和分辨率 [13，14 ]。
本研究针对具有不同电荷密度的糖胺聚糖寡糖，采用4种基质的亲水相互作用色谱（HILIC）方法。研究表明，与SAX和IPRP方法相比，HILIC方法有更好的质谱兼容性； 同时，针对不同的糖胺聚糖寡糖可以选择不同的HILIC方法。2实验部分
2.1仪器与试剂
Agilent 1260 Infinity液相色谱仪串联四级杆/飞行时间（Q/TOF）质谱（6540，美国Agilent公司）。醋酸铵、硫酸软骨素A（CSA） 和HA（美国Sigma公司）；乙腈（德国Merck公司）；软骨素ABC酶（Chondroitinase ABC，北京艾德豪克国际技术有限公司）；低分子量肝素：依诺肝素为美国药典标准品（USP）。
2.2实验方法
2.2.1酶水解制备HA寡糖、CSA寡糖分别取2.0 mg HA和CSA样品溶于400 μL酶解缓冲液（10 mmol/L 磷酸盐缓冲液，pH 6.8），将HA和CSA样品配制成5 mg/mL溶液，分别加入软骨素酶ABC 5 mU，置于水浴箱中37℃反应4 h。酶解液高温灭活然后离心，上清液备用。
2.2.2寡糖的高效液相亲水相互作用色谱分析（HPLCHILIC）
流动相A为5 mmol/L醋酸铵溶液，流动相B为5 mmol/L醋酸铵95%乙腈溶液，紫外检测器设置为232 nm在线检测。氨基HILIC色谱柱（250 mm×4.6 mm， 5 μm， 日本COSMOSIL公司）；酰胺基HILIC色谱柱（250 mm×4.6 mm， 5 μm，北京华谱新创公司），柱温30℃，流速0.5 mL/min，30 min内流动相B从90% 降到 35%进行梯度洗脱；两性离子（ZIC）HILIC色谱柱 （100 mm×2.1 mm， 5 μm，德国 Merck公司），柱温30℃/85℃，流速0.3 mL/min，25 min内流动相B从90% 降到 35%进行梯度洗脱；二醇基HILIC色谱柱 （150 mm×2.0 mm， 3 μm LUNA， 加拿大Phenonenex公司），柱温30℃，流速0.3 mL/min，25 min内流动相B从90% 降到 35%进行梯度洗脱。
2.2.3寡糖的质谱分析
氮气用作雾化气，雾化压力为30 Pa。喷雾电压为3.5 kV，氮气流速为8 L/min，干燥过程中温度为350℃。碎片电压为100 V。在m/z 100～2000的范围内进行全离子流扫描。所有数据都在负离子模式下进行采集，经Mass Hunter工作站下处理。3结果与讨论
3.1氨基HILIC色谱柱对糖胺聚糖类寡糖的分析
在文献＼[15＼]中，氨基HILIC色谱柱已被用于糖胺聚糖二糖分析＼[15＼]，但该法以高浓度不挥发性缓冲盐作为流动相，因此无法与质谱联用，而且对于寡糖的分离和分析并没有直接的报道。本实验使用氨基HILIC色谱柱进行糖胺聚糖的寡糖分析，结果表明，即使在高浓度醋酸铵缓冲盐的条件下，寡聚糖仍然无法被完全洗脱（谱图未显示），而据经验100 mmol/L以上的挥发性盐已经对质谱检测造成了影响。造成这种现象可能是该氨基柱中树脂表面键合的氨基基团与糖胺聚糖寡糖结合作用太强，
3.2酰胺基HILIC色谱柱对糖胺聚糖类寡糖的分离
采用酰胺基HILIC色谱柱分别对HA、CSA和HP进行分析，结果表明，HA寡聚糖能够得到很好的分离，如图1所示。根据相应质谱结果（图谱未显示），色谱图中每个峰得到了准确的归属。其中HA寡聚糖在聚合度2～20的范围内能够得到很好的分离。然而在使用此色谱柱对CSA与HP寡糖混合物进行分离时，在合理的缓冲盐浓度范围内无法有效洗脱寡糖（谱图未显示）。该色谱柱树脂表面的酰胺基团具有较弱的离子作用，能够与含有较少负电荷的HA的寡聚糖产生适当的相互作用，并能够有效分离HA寡糖。
3.3两性离子（ZIC）HILIC色谱柱对糖胺聚糖类寡糖的分析
本实验使用ZICHILIC色谱柱分别对3种糖胺聚糖类寡糖进行了分析。结果表明，HA寡糖在聚合度2～28的范围内达到较好分离，如图2A所示，其中质谱结果确认了它们的聚合度（图谱未显示）。ZICHILIC的两性离子基质使得HA寡聚糖达到了更高的分辨率。然而HA的每一个寡糖都分裂成了两个峰，这是由寡糖还原端产生的α和β构型共存导致的（图2A）。根据文献＼[16，17＼]，增加柱温可以减少或消除这种现象。因此，本实验中将柱温升高到85
SymbolpB@ C，每个HA寡糖在常温下出现的双峰完全消失，同时还保留了较高的分辨率（图2B）。此外，此色谱柱也对CSA具有较好的分辨率（图2C）。但此色谱柱不适用于HP的分离分析。
3.4二醇基（Diol）HILIC色谱柱对糖胺聚糖类寡糖的分离
使用DiolHILIC色谱柱分别对3种寡聚糖进行了分离。结果表明，HA寡糖在聚合度2～30范围内能够得到有效分离（图3A）；CSA寡糖在聚合度2～20范围内达到较好分离（图3B）；HP寡糖在聚合度4～20范围内也得到了较高分辨率的分离（图3C）。质谱数据确定了每个相应色谱峰的聚合度（图谱未显示）。在图3可见，只有HA寡聚糖中一些低聚合度的寡糖出现了α、β共存导致的分岔现象。此类型色谱柱树脂表面二醇基的弱电离作用使得具有不同分子大小和不同电荷密度的这类聚阴离子寡糖都能得到较好的分离效果。
色谱柱30℃条件下所得HA（A）， CSA（B）， 肝素（C）的分离效果谱图。
HA oligosaccharides （A）， CSA oligosaccharides （B） and heparin（HP） oligosaccharides obtained on the diolHILIC column at 30℃. 4结 论
建立了亲水相互作用液相色谱质谱联用分析糖胺聚糖类复杂样品的方法。对4种具有不同基质的HILIC色谱柱进行了评价。对于HA寡聚糖，具有最低的电荷密度，可以使用酰胺基HILIC、ZICHILIC和DiolHILIC在5 mmol/L乙酸铵存在下用常规的正相色谱条件进行分析。对于CSA寡糖，平均每个二糖单位中含有一个羧基和一个硫酸根，可以使用ZICHILIC和DiolHILIC色谱柱在5 mmol/L乙酸铵的存在下用常规的正相色谱条件进行分析。而肝素寡糖只能使用DiolHILIC色谱柱在以上条件下进行分离。以上方法均在低浓度的挥发性缓冲盐条件下进行，能够与质谱高效结合。其中，ZICHILIC需要较高的柱温消除α、β共存，而DiolHILIC色谱柱能够在较低温度条件下实现不同大小分子及不同电荷密度的糖胺聚糖类寡糖的高效分离分析。
References
1Wu Z L， Zhang L， Beeler D L， Kuberan B， Rosenberg R D. Faseb J.， 2002， 16（6）： 539-545
2Capila，Linhardt R J. Angew. Chem. Intl. Ed， 2002， 41（3）： 391-412
3Bernfield M， Gotte M， Park P W， Reizes O， Fitzgerald M L， Lincecum J， Zako M. Annu. Rev. Biochem.， 1999， 68： 729-777
4Taylor K R， Gallo R L. Faseb J.， 2006， 20（1）： 9-22
5Sasisekharan R， Raman R， Prabhakar V. Annu. Rev. Biomed. Eng.， 2006， 8： 181-231
6Leymarie N， McComb M E， Naimy H， Staples G O， Zaia J. Int. J. Mass Spectrom.， 2012， 312： 144-154
7Pfeiler E. Comp. Biochem. Physiol.， 1998， 119： 137-144
8Maimone M M， Tollefsen D M. J. Biol. Chem.， 1990， 265（30）： 18263-18271
9Liu L， Linhardt R J， Zhang Z. Carbohydr. Polym.， 2014， 106： 343-350
10Mourier P， Anger P， Martinez C， Herman F， Viskov C. Anal. Chem. Res.， 2015， 3： 46-53
11Thanawiroon C， Linhardt R J. J. Chromatogr. A， 2003， 1014（12）： 215-223
12Linhardt R J， Gu K N， Loganathan D， Carter S R. Anal. Biochem.， 1989， 181（2）： 288-296
13Wang Z， Li D， Sun X， Bai X， Jin L， Chi L. Anal. Biochem.， 2014， 451： 35-41
14Nuijs A L N V， Tarcomnicu I， Covaci A. J. Chromatogr. A， 2011， 1218： 5964-5974
15Aral T， Aral H， Ziyadanoullar B， Ziyadanoullar R. Talanta， 2015， 131： 64-73
16Gill V L， Aich U， Rao S， Pohl C， Zaia J. Anal. Chem.， 2013， 85（2）： 1138-1145
17Johnsen E， Wilson S R， Odsbu I， Krapp A， Malerod H， Skarstad K， Lundanes E. J. Chromatogr. A， 2011， 1218（35）： 5981-5986
AbstractA hydrophilic interaction liquid chromatography （HILIC）mass spectrometric （MS） method was developed for the analysis of glycosaminoglycan （GAG） oligosaccharides. By using 5 mmol/L NH4Ac as the mobile phase which was compatible with MS， four types of HILIC columns were investigated to analyze GAG oligosaccharides. The results showed that， aminoHILIC column was unsuitable for all glycosaminoglycan （GAG） oligosaccharides， amideHILIC column was useful only for hyaluronan oligosaccharides from dp2 to dp20， zwitterionic phase HILIC column was useful for hyaluronan oligosaccharides from dp2 to dp30 and to a lesser extent for chondroitin oligosaccharides from dp2 to dp12， and diolHILIC column afforded excellent resolution of hyaluronan （dp2-dp30）， chondroitin sulfate （dp2-dp20） and heparin （dp4-dp20） oligosaccharides. In conclusion， different HILIC columns were investigated and on the basis of this， GAG oligosaccharides were separated and then analyzed by HILIC MS method. The developed methods have higher resolution and better compatibility of MS.
KeywordsHydrophilic interaction liquid chromatography； Quadrupoletimeofflight mass spectrometry； Glycosaminoglycan； Oligosaccharides
（Received 21 March 2015； accepted 31 May 2015）
