液相色谱能量相关二级质谱快速鉴定药物氧化降解产物
贺玖明等
摘 要 基于快速高分辨液相色谱（RRLC）的高分离能力和串联质谱技术的全扫描（TOFMS）功能，开展了无需选择母离子可获得子离子的能量相关二级质谱（MSE）分析方法的研究。探讨了快速获取和挖掘复杂混合物中全面的组分信息，并将本方法应用于药物氧化降解产物的快速分析鉴定。对莫西沙星原料在30% H2O2中进行氧化降解，采用RRLC进行分离，分别设定高低碰撞能量的TOFMS实验采集质谱数据，采用质量亏损过滤（MDF）进行数据处理，获取母离子与碎片离子等质谱信息，从而了解药物降解杂质的结构及相对含量。本方法为药物杂质分析和药品质量控制提供了新颖且高效的分析思路及手段。
关键词 高效液相色谱质谱联用；串联质谱；药物降解产物；结构分析；质量亏损过滤
1 引 言
药物杂质与药品质量、安全性密切相关，而且多数杂质具有潜在的生物活性，其性质与含量水平是药品临床使用中不良反应的重要因素之一[1，2]。因此，杂质研究及质量控制是药品安全保证的关键要素[2]，研发出适用于原料药中的工艺杂质和药物降解产物的快速分析鉴定的新技术、新方法是提高药品质量安全的重要手段和保障。
近年来，新技术新方法的发展对药物分析起到了重要的推动作用。超高压液相色谱（UPLC）[3，4]或快速高分辨液相色谱系统（RRLC）[5]与常规的高效液相色谱（HPLC）技术相比，大大提高了分析速度和分离能力，HPLC与串联质谱（MS/MS，MSn）的联用技术也已广泛应用于新药研发和药物质量控制的分离与快速分析[6～9]。利用质谱技术进行混合物成分的快速分析时，碎片离子或子离子能提供关键的结构信息。常用的串联质谱技术主要有选择母离子的碰撞诱导裂解（CID）和数据依赖性扫描（DDA和IDA）等。LCMS/MS技术在一次分析周期内无法同时设置太多的CID扫描，且对未知多组分混合物需要进行多次LCMS/MS分析。而DDA或IDA的扫描方式由于需要设置CID实验的激发阈值，如果该值太高会丢失混合物中低含量组分的结构信息，而太低则高含量组分有可能得不到理想的MS/MSCID谱。
本研究基于RRLC的高分离能力和空间串联质谱仪的全扫描（TOFMS）功能，开展了无需选择母离子可获得碎片离子的能量相关二级质谱[10～13]（MSE）分析方法研究，并采用质量亏损过滤[14]（Mass Defect Filter，MDF）从对复杂混合物的质谱数据进行处理，并应用于药物降解杂质的快速分析鉴定。研究表明，本方法可以简便、快速地获得混合物体系中药物杂质的母离子与子离子信息，从而为药物杂质分析和药品质量控制提供一种新颖且高效的分析手段。
2 实验部分
2.1 仪器与试剂
液相色谱分离采用Agilent 1200 RRLC高效液相色谱仪 （Agilent Technologies， Waldbronn， Germany）；质谱分析采用QSTAR Elite型四级杆飞行时间（Q/TOF）串联质谱仪（AB SCIEX， USA），配有电喷雾离子源（ESI），数据处理系统为Analyst QS 2.0。
甲醇、乙腈、甲酸（色谱纯，Merk，德国）；水（娃哈哈纯净水）。所有液相色谱用溶剂均经抽滤、超声脱气处理（津腾公司滤膜：水相，0.22 μm；有机相，0.22 μm）。药物盐酸莫西沙星（Matrix Scientific， USA， 047902），30% H2O2（国药集团化学试剂有限公司，批号：20120513）。
2.2 实验方法
色谱条件：Agilent 1200型RRLC液相色谱仪，包括二极管阵列检测器，二元梯度泵，在线脱气机，自动进样器； 色谱柱为Agilent ZOBAX SBC18 （150 mm × 4.6 mm， 5 μm，Agilent，USA）； 以甲醇（A）和0.3%甲酸（B）为流动相进行梯度洗脱：初始流动相平衡10 min； 0～10 min，5% 甲醇； 10～20 min，5%～22%甲醇； 20～23 min，22%～36%甲醇； 23～35 min，36%～38% 甲醇； 35～45 min，38%～70% 甲醇； 45～55 min，70%～80% 甲醇。流速为1.0 mL/min； 紫外吸收检测波长为190～400 nm； 柱温设定30 ℃。
质谱条件：采用Q/TOF型串联质谱仪正离子的TOFMS全扫描对莫西沙星的降解产物进行分析。检测条件如下： 喷雾电压（SV）： +5.5 kV； 解簇电压（DP）：+40 V； 入口电压（EP）：+9 V； 离子源温度：400 ℃； 雾化气（GS1）：50 arb； 干燥气（GS2）：50 arb。碰撞能量（CE）：+10 eV/+35 eV。质谱采集范围100～1000 Da，每秒采集1张谱图。Q/TOF型串联质谱仪分辨率高于10000（半峰宽）。使用的各种气路均为氮气。数据处理与信息挖掘采用软件PeakView 1.2（AB SCIEX， USA）。质量亏损过滤（MDF）参数如下：Defect设为179.5 mDa，Defect Tolerance 设为 30 mDa， Mass range设为350～500 Da。
供试品和空白对照溶液的制备：称取盐酸莫西沙星适量，加入适量30%双氧水，制得浓度为2.5 g/L的溶液，避光放置7天进行氧化降解； 取适量降解后的溶液加水稀释至50 μg/mL（以原莫西沙星计），作为供试品溶液。以30%双氧水作为溶剂，随行制备空白对照溶液。
3 结果与讨论
3.1 能量相关二级质谱MSE分析方法的建立
能量相关二级质谱（MSE）分析方法是一种基于UPLC、RRLC与MS/MS联用技术的质谱全扫描（TOFMS）功能，通过设定两个不同碰撞能量的全扫描质谱分析实验，同时获得所含组分的母离子与子离子信息[11～14]。通过低碰撞能量的实验1（Exp 1）获得分子离子峰； 通过高碰撞能量的实验2（Exp 2），不经Q1选择，将各组分同时送入碰撞室进行碎裂，以获得所有同时流出组分的碎片及结构信息。当混合物经液相色谱分离后，进入离子源实现离子化，所有离子全部通过四极杆分析器Q1（MS1），在低碰撞能量下（Low CE），直接通过碰撞室（Q2）而不发生碎裂，进入分析器2（MS2）分析，可以获得分子离子峰； 当在高碰撞能量下（High CE），离子在碰撞室（Q2）发生碎裂，经分析器2分析，获得碎片离子信息。在整个液相色谱分离洗脱时间内，低、高碰撞能量下循环进行质谱测定； 数据处理时，在相同保留时间内获得分别为低、高CE值的质谱图。
3.2 RRLCMSE方法在药物杂质分析中的应用
采用上述RRLCMSE方法，对莫西沙星（Moxifloxacin）的氧化氧化降解产物进行分析研究。将莫西沙星原料药在H2O2条件下加速氧化制得供试品，并以相应的溶剂作为空白对照，采用RRLCMSE方法对其进行分析。图1a 和1b分别为在紫外检测波长294～296 nm获得的色谱图和质谱100～1000 Da范围内检测获得的总离子流图。根据相应的质谱图判断，在保留时间21.69 min的最强色谱峰为主成分莫西沙星。对于杂质而言，在保留时间9.96 min的杂质色谱峰可以被清楚地观察到； 但其它低含量的杂质，因背景离子强度太高，不能直接识别。
Reference
1 MA FengYu， ZHANG DengFei， NIE JiuSheng. Chinese Health Service Management， 2004， 20（5）： 313-315
马凤余， 章登飞， 聂久胜. 中国卫生事业管理， 2004， 20（5）： 313-315
2 ZHANG ZheFeng. Drugs and Clinic， 2010， 25（5）： 327-333
张哲峰. 现代药物与临床， 2010， 25（5）： 327-333
3 Kadav A A， Vora D N. J. Pharm. Biomed. Anal.， 2008， 48（1）：120-126
4 Du J B， Deng P， Chen X Y， Wang H D， You T G， Zhong D F. Acta Pharmaceutica Sinica B， 2012， 2（2）： 157-165
5 Wharton M， Geary M， Sweetman P， Curtin L， O′Connor N. J. Chromatogr. Sci.， 2014， 52（3）： 187-194
6 Zheng Y J， He J M， Zhang R P， Wang Y C， Wang J X， Wang H Q， Wu Y， He W Y， Abliz Z. Rapid Commun. Mass Spectrom.， 2014， 28（10）： 1164-1174
7 HE JiuMing， LUO ZhiGang， LI Nong， ZHANG RuiPing， HE JingJing， Zeper Abliz. Chinese J. Anal. Chem.， 2011， 39（11）： 1743-1747
贺玖明， 罗志刚， 李 秾， 张瑞萍， 何菁菁， 再帕尔·阿不力孜. 分析化学， 2011， 39（11）： 1743-1747
8 Geng P， Zhang R， Aisa H A， He J， Zhu H， Abliz Z. Rapid Commun. Mass Spectrom.， 2007， 21（12）： 1877-1888
9 Liu Y， He J， Zhang R， Shi J， Abliz Z. J. Mass Spectrom.， 2009， 44： 1182-1187
10 Plumb R S， Johnson K A， Rainville P， Smith B W， Wilson I D， CastroPerez J M， Nicholson J K. Rapid Commun. Mass Spectrom.， 2006， 20（13）： 1989-1994
11 Bateman K P， CastroPerez J， Wrona M， Shockcor J P， Yu K， Oballa R， NicollGriffith D A. Rapid Commun. Mass Spectrom.， 2007， 21（9）： 1485-1496
12 Wrona M， Mauriala T， Bateman K P， MortishireSmith R J， O′Connor D. Rapid Commun. Mass Spectrom.， 2005， 19（18）： 2597-2602
13 Ramos A A， Yang H， Rosen L E， Yao X. Anal. Chem.， 2006， 78（18）： 6391-6397
14 Zhang H， Zhang D， Ray K， Zhu M. J. Mass Spectrom.， 2009， 44（7）： 999-1016
摘 要 基于快速高分辨液相色谱（RRLC）的高分离能力和串联质谱技术的全扫描（TOFMS）功能，开展了无需选择母离子可获得子离子的能量相关二级质谱（MSE）分析方法的研究。探讨了快速获取和挖掘复杂混合物中全面的组分信息，并将本方法应用于药物氧化降解产物的快速分析鉴定。对莫西沙星原料在30% H2O2中进行氧化降解，采用RRLC进行分离，分别设定高低碰撞能量的TOFMS实验采集质谱数据，采用质量亏损过滤（MDF）进行数据处理，获取母离子与碎片离子等质谱信息，从而了解药物降解杂质的结构及相对含量。本方法为药物杂质分析和药品质量控制提供了新颖且高效的分析思路及手段。
关键词 高效液相色谱质谱联用；串联质谱；药物降解产物；结构分析；质量亏损过滤
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药物杂质与药品质量、安全性密切相关，而且多数杂质具有潜在的生物活性，其性质与含量水平是药品临床使用中不良反应的重要因素之一[1，2]。因此，杂质研究及质量控制是药品安全保证的关键要素[2]，研发出适用于原料药中的工艺杂质和药物降解产物的快速分析鉴定的新技术、新方法是提高药品质量安全的重要手段和保障。
近年来，新技术新方法的发展对药物分析起到了重要的推动作用。超高压液相色谱（UPLC）[3，4]或快速高分辨液相色谱系统（RRLC）[5]与常规的高效液相色谱（HPLC）技术相比，大大提高了分析速度和分离能力，HPLC与串联质谱（MS/MS，MSn）的联用技术也已广泛应用于新药研发和药物质量控制的分离与快速分析[6～9]。利用质谱技术进行混合物成分的快速分析时，碎片离子或子离子能提供关键的结构信息。常用的串联质谱技术主要有选择母离子的碰撞诱导裂解（CID）和数据依赖性扫描（DDA和IDA）等。LCMS/MS技术在一次分析周期内无法同时设置太多的CID扫描，且对未知多组分混合物需要进行多次LCMS/MS分析。而DDA或IDA的扫描方式由于需要设置CID实验的激发阈值，如果该值太高会丢失混合物中低含量组分的结构信息，而太低则高含量组分有可能得不到理想的MS/MSCID谱。
本研究基于RRLC的高分离能力和空间串联质谱仪的全扫描（TOFMS）功能，开展了无需选择母离子可获得碎片离子的能量相关二级质谱[10～13]（MSE）分析方法研究，并采用质量亏损过滤[14]（Mass Defect Filter，MDF）从对复杂混合物的质谱数据进行处理，并应用于药物降解杂质的快速分析鉴定。研究表明，本方法可以简便、快速地获得混合物体系中药物杂质的母离子与子离子信息，从而为药物杂质分析和药品质量控制提供一种新颖且高效的分析手段。
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液相色谱分离采用Agilent 1200 RRLC高效液相色谱仪 （Agilent Technologies， Waldbronn， Germany）；质谱分析采用QSTAR Elite型四级杆飞行时间（Q/TOF）串联质谱仪（AB SCIEX， USA），配有电喷雾离子源（ESI），数据处理系统为Analyst QS 2.0。
甲醇、乙腈、甲酸（色谱纯，Merk，德国）；水（娃哈哈纯净水）。所有液相色谱用溶剂均经抽滤、超声脱气处理（津腾公司滤膜：水相，0.22 μm；有机相，0.22 μm）。药物盐酸莫西沙星（Matrix Scientific， USA， 047902），30% H2O2（国药集团化学试剂有限公司，批号：20120513）。
2.2 实验方法
色谱条件：Agilent 1200型RRLC液相色谱仪，包括二极管阵列检测器，二元梯度泵，在线脱气机，自动进样器； 色谱柱为Agilent ZOBAX SBC18 （150 mm × 4.6 mm， 5 μm，Agilent，USA）； 以甲醇（A）和0.3%甲酸（B）为流动相进行梯度洗脱：初始流动相平衡10 min； 0～10 min，5% 甲醇； 10～20 min，5%～22%甲醇； 20～23 min，22%～36%甲醇； 23～35 min，36%～38% 甲醇； 35～45 min，38%～70% 甲醇； 45～55 min，70%～80% 甲醇。流速为1.0 mL/min； 紫外吸收检测波长为190～400 nm； 柱温设定30 ℃。
质谱条件：采用Q/TOF型串联质谱仪正离子的TOFMS全扫描对莫西沙星的降解产物进行分析。检测条件如下： 喷雾电压（SV）： +5.5 kV； 解簇电压（DP）：+40 V； 入口电压（EP）：+9 V； 离子源温度：400 ℃； 雾化气（GS1）：50 arb； 干燥气（GS2）：50 arb。碰撞能量（CE）：+10 eV/+35 eV。质谱采集范围100～1000 Da，每秒采集1张谱图。Q/TOF型串联质谱仪分辨率高于10000（半峰宽）。使用的各种气路均为氮气。数据处理与信息挖掘采用软件PeakView 1.2（AB SCIEX， USA）。质量亏损过滤（MDF）参数如下：Defect设为179.5 mDa，Defect Tolerance 设为 30 mDa， Mass range设为350～500 Da。
供试品和空白对照溶液的制备：称取盐酸莫西沙星适量，加入适量30%双氧水，制得浓度为2.5 g/L的溶液，避光放置7天进行氧化降解； 取适量降解后的溶液加水稀释至50 μg/mL（以原莫西沙星计），作为供试品溶液。以30%双氧水作为溶剂，随行制备空白对照溶液。
3 结果与讨论
3.1 能量相关二级质谱MSE分析方法的建立
能量相关二级质谱（MSE）分析方法是一种基于UPLC、RRLC与MS/MS联用技术的质谱全扫描（TOFMS）功能，通过设定两个不同碰撞能量的全扫描质谱分析实验，同时获得所含组分的母离子与子离子信息[11～14]。通过低碰撞能量的实验1（Exp 1）获得分子离子峰； 通过高碰撞能量的实验2（Exp 2），不经Q1选择，将各组分同时送入碰撞室进行碎裂，以获得所有同时流出组分的碎片及结构信息。当混合物经液相色谱分离后，进入离子源实现离子化，所有离子全部通过四极杆分析器Q1（MS1），在低碰撞能量下（Low CE），直接通过碰撞室（Q2）而不发生碎裂，进入分析器2（MS2）分析，可以获得分子离子峰； 当在高碰撞能量下（High CE），离子在碰撞室（Q2）发生碎裂，经分析器2分析，获得碎片离子信息。在整个液相色谱分离洗脱时间内，低、高碰撞能量下循环进行质谱测定； 数据处理时，在相同保留时间内获得分别为低、高CE值的质谱图。
3.2 RRLCMSE方法在药物杂质分析中的应用
采用上述RRLCMSE方法，对莫西沙星（Moxifloxacin）的氧化氧化降解产物进行分析研究。将莫西沙星原料药在H2O2条件下加速氧化制得供试品，并以相应的溶剂作为空白对照，采用RRLCMSE方法对其进行分析。图1a 和1b分别为在紫外检测波长294～296 nm获得的色谱图和质谱100～1000 Da范围内检测获得的总离子流图。根据相应的质谱图判断，在保留时间21.69 min的最强色谱峰为主成分莫西沙星。对于杂质而言，在保留时间9.96 min的杂质色谱峰可以被清楚地观察到； 但其它低含量的杂质，因背景离子强度太高，不能直接识别。
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7 HE JiuMing， LUO ZhiGang， LI Nong， ZHANG RuiPing， HE JingJing， Zeper Abliz. Chinese J. Anal. Chem.， 2011， 39（11）： 1743-1747
贺玖明， 罗志刚， 李 秾， 张瑞萍， 何菁菁， 再帕尔·阿不力孜. 分析化学， 2011， 39（11）： 1743-1747
8 Geng P， Zhang R， Aisa H A， He J， Zhu H， Abliz Z. Rapid Commun. Mass Spectrom.， 2007， 21（12）： 1877-1888
9 Liu Y， He J， Zhang R， Shi J， Abliz Z. J. Mass Spectrom.， 2009， 44： 1182-1187
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13 Ramos A A， Yang H， Rosen L E， Yao X. Anal. Chem.， 2006， 78（18）： 6391-6397
14 Zhang H， Zhang D， Ray K， Zhu M. J. Mass Spectrom.， 2009， 44（7）： 999-1016
