二维液相色谱在药物和毒物分析中的应用进展
萧伟斌++蹇阳++李桦
摘 要 生物样品中药物、毒物及内源性物质的定性与定量分析在生命科学和药物研发中发挥重要作用。生物样品的基质复杂，干扰物多，待测物浓度与内源性物质相比明显偏低，且样品取样量少，因此要求生物分析方法的特异性强、灵敏度高、重现性好。二维液相色谱技术具有峰容量大、显著降低复杂样品的基质效应和残留现象，及可以实现样品分析的自动化等特点，已成为生物样品分离分析的有力工具，在环境、食品和药物分析中得到广泛应用。本文在简要介绍了二维液相色谱原理装置基础上，对其在生物样品中药物、毒物和内源性物质分析中的应用进展进行了综述。
1 引 言
药物代谢和药代动力学（DMPK）定量描绘药物及其它外源性物质经过各种途径进入机体后的吸收、分布、代谢、排泄过程及其机制，阐释机体对药物的处置、揭示药物在体内的生物转化以及与内源性和外源性物质的相互作用，为新药研发和临床安全、有效和合理用药提供科学依据。生物样品中药物及其代谢产物的定性与定量分析，是药物代谢研究的关键环节，复杂生物基质中低浓度药物和代谢产物的检测、定量分析和结构鉴定常是一个挑战性工作[ 1]。同时，在疾病发现和诊断、药物对机体的药效学研究、临床用药监测以及滥用药物和毒物的中毒分析中，也涉及大量的体内生物样品的分析，其对象包括血浆、血清、尿、唾液、胆汁等各种体液，以及组织样品和排泄物。药代 动力学和其它生物分析的样品基质均较复杂，干扰物多（蛋白质、脂肪、激素、神经递质和尿素等代谢物等），取样量少，待测物浓度与内源性物质相比明显偏低，因此要求生物分析方法的特异性强、灵敏度高、重现性好。药代动力学研究和临 床药物监测需要分析大量样本，对分析的通量和方便简便快速也有要求。目前，生物分析和药代动力学研究首选色谱法，连接不同类型的检测器（紫外、荧光、电化学、质谱等）的液相色谱可以适应不同类型化合物的检测，应用最为广泛。在过去的十多年中，随着质谱接口技术的快速发展和分析灵敏度的提高，选择性强、灵敏度高的液相色谱质谱联用技术（LCMS）已成为药代动力学研究及其它药物毒物生物分析的主导技术[ 2]，其中，液相色谱的分离功能对于复杂基质或多组分样品分析的灵敏度、重现性和准确性至关重要。二维液相色谱的出现，大大提高了分离效率，为这些样品的分离测定提供了有力工具[ 3]。
血浆、尿、组织等生物样品的成分复杂，在应用LCMS及时进行定性与定量分析时，一般需要进行样品的前处理，这是极为重要的环节，也常是最困难、最繁复的工作。前处理在复杂基质样品分析中是最为耗时的部分，其结果将直接影响定性与定量分析结果的可靠性。有人认为，约1/3的分析误差是由繁琐的前处理步骤产生的[ 4]，并占据了约2/3的工作量[ 5]。基于二维液相色谱的在线固相萃取技术，显著简化了样品前处理工作，使得高通量的全自动样品分析成为可能，在中药有效成分分析、药物质量分析、食品安全、环境科学等诸多领域得到广泛应用[ 6～9]。近年来，这一技术在药物代谢和生物分析中得以应用，并逐渐显示优势。
2 在线二维色谱原理、装置及特点
二维液相色谱是将分离机理不同而又相互独立的两支色谱柱串联起来构成的分离系统，通过柱切换技术完成样品在二维色谱柱之间的流动。分析时，样品经过第一维色谱柱的分离，进入切换阀的接口中，经捕集或切割后，被切换进入第二维色谱柱及检测器。二维色谱按切割组分进入二维柱方式分为中心切割和全二维方式；又可根据切割组分是否直接进入二维柱中，分为离线与在线两种类型。目前用于分析的二维液相色谱大多应用在线方式，即一维洗脱产物全部或部分直接进入到二维色谱柱中进行分离分析。
在装置方面，单泵系统与双泵系统均能实现在线二维液相色谱分离[ 10]。双泵系统可以采用临时搭建的方式或者选用整合式色谱仪。图1A所示的双泵系统通常需要使用者额外添加一个泵、色谱柱和切换阀，以实现多条流路的切换。样品首先通过一维泵将样品装载至一维色谱柱中进行洗脱分离，使用双样品环接口、停流模式或真空挥发的接口切换技术捕集洗脱产物，再用高浓度的二维泵流动相将保留在接口或一维柱上的分析物以正冲或者反冲模式从一维转移到二维分析柱上继续分离，由此能够获得更大的峰容量[ 11，12]。整合式色谱仪整合了二维色谱所需的双泵、管路套装与连接指导，例如UltiMate3000型液相色谱仪，通过软件操作和独特的阀切换技术（图2），实现在线二维色谱的多种应用[ 13，14]。应用单泵系统，如图1B所示，也可以实现二维色谱的操作[ 15，16]，输液泵将样品装载至SPE柱中，并将不保留物质冲洗至废液中，之后关闭废液位置，迫使梯度流动相经SPE柱流向分析柱。
与传统的液相色谱和离线固相萃取色谱分析相比，在线二维色谱的优势在于峰容量明显提升、复杂样品的基质效应和残留现象显著降低、以及自动化样品前处理以提高分析的通量。在一维色谱模式下，如果峰数量超过了峰容量的37%，色谱峰分辨率将明显下降，而二维色谱的峰容量是一维与二维色谱分离峰容量的乘积[ 17～19]，分离效率大大提高，因此可以用于多组分、复杂基质样品的分离分析。将二维色谱的其中一维配置固相萃取柱，可以完成自动固相萃取、脱盐和除蛋白、以及低浓度分析物的富集，复杂基质样品可直接进样，样品的自动化前处理显著改善了基质效应和残留现象，提高分析的灵敏度和重现性，满足大批量样品的全自动和高通量分析要求。除此之外，由于整个分析过程在密闭系统中进行，可以减少样品污染及可能发生的分析物降解[ 9，20，21]。
利用在线固相萃取液质联用技术测定人血浆中的8OHdG含量，方法不仅省时省力，还可避免电化学检测法中内源性物质的干扰和免疫检测特异性低的问题，方法可用于评价疾病状态以及人体接触纳米颗粒后的氧化应激状态。
人体前列腺素E2（PGE2）由前列腺素E2合成酶1合成，在炎症反应、疼痛、发烧和血管调节中发挥了重要作用。Fabian等[ 50]通过测定A549微粒体孵育体系中前列腺素E2含量，筛选微粒体前列腺素E2合成酶1（mPGES 1）抑制剂。他们建立了在线固相萃取HPLCUV方法，分别设计了单SPE柱和并联SPE柱交替模式，并进行比较。结果证明，在线固相萃取法不需要任何前处理，灵敏度达到57 μg/L；与单柱相比，并联双柱模式分析时间显著缩短，为mPGES 1抑制剂的筛选提供了快速可靠的方法。同样，Heinig等建立在线萃取技术，以小鼠血浆、尿液和组织中糖皮质激素浓度水平作为生物标志物，进行11βHSD1抑制剂候选药的药效评价[ 51]。
内源性脑神经肽是重要的内源性调节剂，由于其含量较低和大脑组织基质的复杂性，使得定量测定很困难。一维液相色谱在测定脑神经肽时难以获得足够的分离度。Mihailova等[ 52]建立了两套在线二维液相色谱系统，即HILICRP和SCXRP色谱系统，通过比较确定适用于缺氧应激条件下大脑神经肽含量测定方法。实验结果显示，HILICRP系统可在一维柱分离后得到19个肽段，而传统的SCXRP系统的实际局限性仅得到6个，HILICRP系统比SCXRP系统获得多于3倍的肽段信息，表明HILICRP系统更适合脑神经肽的肽段组学比较研究。同时，为了防止HILIC和RP柱不兼容的问题，在两柱间再加了一根SPE柱，使得流动相间的切换能够平稳过渡。
3.6 手性化合物的分离和分析
在药物研究中，常常需要对样品中不同药物或药物手性异构体进行分离，二维液相色谱是手性化合物分离的有力工具之一。Mangani等[ 20]建立了多柱在线切换HPLC技术对血清中常用的6种治疗心血管疾病药物进行分离测定，其中β受体阻断剂吲哚洛尔是手性药物。血清样品先经过在线SPE进行纯化， 纯化样品洗脱进入RP18柱，用pH 2.5的流动相洗脱，将吲哚洛尔与其它药物完全分离，后 者经 UV检测；随后通过中心切割，将吲哚洛尔引入手性AGP柱以pH 7.0的流动相进行二维手性分离分析。通过对流动相pH的调整，同一二维色谱法也可应用于其他药物及其代谢产物的分离。Bester等[ 53]则应用在线二维液相色谱法分离检测生物样品（鱼油、灰欧肝等）中的六溴环十二烷（HBCD）。市场上HBCD是3种异构体 （αHBCD， βHBCD和γHBCD）的混合物，且每种异构体还存在手性异构，尽管通过手性柱可以手性分离异构体，但3种异构体间的完全分离非常困难。Bester等[53]的方法分别用Synergi polar plus柱和Nucleodex betaPM柱作为一维和二维柱，待测物先在一维柱上使异构体达到分离，再通过中心切割进入二维柱实现各手性异构体的分离。与以往的单柱或是串联柱方法相比，该方法的分析物色谱峰不受其它异构体峰或杂质峰影响，有效峰容量提高了2倍，各异构体在二维色谱上达到更充分的分离。
4 展 望
经过十余年的快速发展，无论在仪器设备、技术上、还是在应用扩展方面，二维液相色谱均有显著进步。在原有液相色谱的基础上增加简单配置，如添加一个泵和六通阀，实现在线二维液相色谱。色谱仪器厂家也已开发出了多种整合式的在线二维液相色谱系统，如UltiMate 3000型液相色谱仪、RapidFireTM SPEMS系统等。目前，二维液相色谱多采用在线模式与质谱相连，成功应用于各种复杂基质样品中的小分子药物和大分子蛋白等的分析。本文总结了近几年在线二维液相色谱在药物代谢领域， 以及体内药物、毒物和内源物生物分析方面的应用进展。大量应用实例展示了在线二维液相色谱在复杂生物样品中药物、毒物和内源物分析中的优势，为生物分析中常见的基质干扰、前处理方法繁琐、通量低、重现性和准确性较差等问题提供了有效的解决方案，近年来在药代动力学研究及其它生物样品的分析中得以广泛应用。
但是，二维液相色谱的应用推广还有一些问题需要进一步解决。 例如，二维色谱柱系统选择和方法建立， 以及流动相的选择和匹配相对复杂，需要繁琐的软件设置和支持，对专业知识和技能有一定的要求；因兼容性问题，进入二维柱的样品常需要稀释，导致方法灵敏度降低，影响生物样品中痕量化合物的检测；以及固相萃取柱和色谱柱的选择性和可用性的限制等。随着二维液相色谱的不断发展完善，以及应用面的扩大和经验的积累和总结，这一技术在体内药物、毒物和内源性物质分析中将具有 良好的应用前景。
References
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Application of Twodimensional Liquid Chromatography
Analysis of Drugs and Toxicants
XIAO WeiBin， JIAN Yang， LI Hua*
（Beijing Institute of Pharmacology and Toxicology， State Key Laboratory of Toxicology and
Medical Countermeasures， Beijing 100850，China）
Abstract Qualitative and quantitative analyses of biological samples containing drugs， toxicants and endogenous substances play an important role in the researches of life sciences， as well as in new drug discovery and development. Biological samples are characterized by complex matrix， multiple endogenous interferences， significantly lower concentrations of measured analytes compared to endogenous components and small sampling volume. Consequently， it often requires bioanalysis methods with superior specificity， high sensitivity and good reproducibility. The twodimensional liquid chromatography （2DLC） technique， which allows for high peak capacity， significant reduced matrix effect and carryover of complex matrix samples and automated sample pretreatment and analysis， has been the powerful solution to the separation and analysis of biological sample and widely applied to environment， food and pharmaceutical analysis. On the basis of introduction of the principle and equipments of 2DLC， the application of this technique in the pharmacokinetics， toxicological and biological study was reviewed.
Keywords Two dimensional liquid chromatography； Online solid phase extraction； Pharmacokinetics； Bioanalysis； Review
（Received 31 August 2014； accepted 20 October 2014）
（Beijing Institute of Pharmacology and Toxicology， State Key Laboratory of Toxicology and
Medical Countermeasures， Beijing 100850，China）
Abstract Qualitative and quantitative analyses of biological samples containing drugs， toxicants and endogenous substances play an important role in the researches of life sciences， as well as in new drug discovery and development. Biological samples are characterized by complex matrix， multiple endogenous interferences， significantly lower concentrations of measured analytes compared to endogenous components and small sampling volume. Consequently， it often requires bioanalysis methods with superior specificity， high sensitivity and good reproducibility. The twodimensional liquid chromatography （2DLC） technique， which allows for high peak capacity， significant reduced matrix effect and carryover of complex matrix samples and automated sample pretreatment and analysis， has been the powerful solution to the separation and analysis of biological sample and widely applied to environment， food and pharmaceutical analysis. On the basis of introduction of the principle and equipments of 2DLC， the application of this technique in the pharmacokinetics， toxicological and biological study was reviewed.
Keywords Two dimensional liquid chromatography； Online solid phase extraction； Pharmacokinetics； Bioanalysis； Review
（Received 31 August 2014； accepted 20 October 2014）
（Beijing Institute of Pharmacology and Toxicology， State Key Laboratory of Toxicology and
Medical Countermeasures， Beijing 100850，China）
Abstract Qualitative and quantitative analyses of biological samples containing drugs， toxicants and endogenous substances play an important role in the researches of life sciences， as well as in new drug discovery and development. Biological samples are characterized by complex matrix， multiple endogenous interferences， significantly lower concentrations of measured analytes compared to endogenous components and small sampling volume. Consequently， it often requires bioanalysis methods with superior specificity， high sensitivity and good reproducibility. The twodimensional liquid chromatography （2DLC） technique， which allows for high peak capacity， significant reduced matrix effect and carryover of complex matrix samples and automated sample pretreatment and analysis， has been the powerful solution to the separation and analysis of biological sample and widely applied to environment， food and pharmaceutical analysis. On the basis of introduction of the principle and equipments of 2DLC， the application of this technique in the pharmacokinetics， toxicological and biological study was reviewed.
Keywords Two dimensional liquid chromatography； Online solid phase extraction； Pharmacokinetics； Bioanalysis； Review
（Received 31 August 2014； accepted 20 October 2014）
摘 要 生物样品中药物、毒物及内源性物质的定性与定量分析在生命科学和药物研发中发挥重要作用。生物样品的基质复杂，干扰物多，待测物浓度与内源性物质相比明显偏低，且样品取样量少，因此要求生物分析方法的特异性强、灵敏度高、重现性好。二维液相色谱技术具有峰容量大、显著降低复杂样品的基质效应和残留现象，及可以实现样品分析的自动化等特点，已成为生物样品分离分析的有力工具，在环境、食品和药物分析中得到广泛应用。本文在简要介绍了二维液相色谱原理装置基础上，对其在生物样品中药物、毒物和内源性物质分析中的应用进展进行了综述。
1 引 言
药物代谢和药代动力学（DMPK）定量描绘药物及其它外源性物质经过各种途径进入机体后的吸收、分布、代谢、排泄过程及其机制，阐释机体对药物的处置、揭示药物在体内的生物转化以及与内源性和外源性物质的相互作用，为新药研发和临床安全、有效和合理用药提供科学依据。生物样品中药物及其代谢产物的定性与定量分析，是药物代谢研究的关键环节，复杂生物基质中低浓度药物和代谢产物的检测、定量分析和结构鉴定常是一个挑战性工作[ 1]。同时，在疾病发现和诊断、药物对机体的药效学研究、临床用药监测以及滥用药物和毒物的中毒分析中，也涉及大量的体内生物样品的分析，其对象包括血浆、血清、尿、唾液、胆汁等各种体液，以及组织样品和排泄物。药代 动力学和其它生物分析的样品基质均较复杂，干扰物多（蛋白质、脂肪、激素、神经递质和尿素等代谢物等），取样量少，待测物浓度与内源性物质相比明显偏低，因此要求生物分析方法的特异性强、灵敏度高、重现性好。药代动力学研究和临 床药物监测需要分析大量样本，对分析的通量和方便简便快速也有要求。目前，生物分析和药代动力学研究首选色谱法，连接不同类型的检测器（紫外、荧光、电化学、质谱等）的液相色谱可以适应不同类型化合物的检测，应用最为广泛。在过去的十多年中，随着质谱接口技术的快速发展和分析灵敏度的提高，选择性强、灵敏度高的液相色谱质谱联用技术（LCMS）已成为药代动力学研究及其它药物毒物生物分析的主导技术[ 2]，其中，液相色谱的分离功能对于复杂基质或多组分样品分析的灵敏度、重现性和准确性至关重要。二维液相色谱的出现，大大提高了分离效率，为这些样品的分离测定提供了有力工具[ 3]。
血浆、尿、组织等生物样品的成分复杂，在应用LCMS及时进行定性与定量分析时，一般需要进行样品的前处理，这是极为重要的环节，也常是最困难、最繁复的工作。前处理在复杂基质样品分析中是最为耗时的部分，其结果将直接影响定性与定量分析结果的可靠性。有人认为，约1/3的分析误差是由繁琐的前处理步骤产生的[ 4]，并占据了约2/3的工作量[ 5]。基于二维液相色谱的在线固相萃取技术，显著简化了样品前处理工作，使得高通量的全自动样品分析成为可能，在中药有效成分分析、药物质量分析、食品安全、环境科学等诸多领域得到广泛应用[ 6～9]。近年来，这一技术在药物代谢和生物分析中得以应用，并逐渐显示优势。
2 在线二维色谱原理、装置及特点
二维液相色谱是将分离机理不同而又相互独立的两支色谱柱串联起来构成的分离系统，通过柱切换技术完成样品在二维色谱柱之间的流动。分析时，样品经过第一维色谱柱的分离，进入切换阀的接口中，经捕集或切割后，被切换进入第二维色谱柱及检测器。二维色谱按切割组分进入二维柱方式分为中心切割和全二维方式；又可根据切割组分是否直接进入二维柱中，分为离线与在线两种类型。目前用于分析的二维液相色谱大多应用在线方式，即一维洗脱产物全部或部分直接进入到二维色谱柱中进行分离分析。
在装置方面，单泵系统与双泵系统均能实现在线二维液相色谱分离[ 10]。双泵系统可以采用临时搭建的方式或者选用整合式色谱仪。图1A所示的双泵系统通常需要使用者额外添加一个泵、色谱柱和切换阀，以实现多条流路的切换。样品首先通过一维泵将样品装载至一维色谱柱中进行洗脱分离，使用双样品环接口、停流模式或真空挥发的接口切换技术捕集洗脱产物，再用高浓度的二维泵流动相将保留在接口或一维柱上的分析物以正冲或者反冲模式从一维转移到二维分析柱上继续分离，由此能够获得更大的峰容量[ 11，12]。整合式色谱仪整合了二维色谱所需的双泵、管路套装与连接指导，例如UltiMate3000型液相色谱仪，通过软件操作和独特的阀切换技术（图2），实现在线二维色谱的多种应用[ 13，14]。应用单泵系统，如图1B所示，也可以实现二维色谱的操作[ 15，16]，输液泵将样品装载至SPE柱中，并将不保留物质冲洗至废液中，之后关闭废液位置，迫使梯度流动相经SPE柱流向分析柱。
与传统的液相色谱和离线固相萃取色谱分析相比，在线二维色谱的优势在于峰容量明显提升、复杂样品的基质效应和残留现象显著降低、以及自动化样品前处理以提高分析的通量。在一维色谱模式下，如果峰数量超过了峰容量的37%，色谱峰分辨率将明显下降，而二维色谱的峰容量是一维与二维色谱分离峰容量的乘积[ 17～19]，分离效率大大提高，因此可以用于多组分、复杂基质样品的分离分析。将二维色谱的其中一维配置固相萃取柱，可以完成自动固相萃取、脱盐和除蛋白、以及低浓度分析物的富集，复杂基质样品可直接进样，样品的自动化前处理显著改善了基质效应和残留现象，提高分析的灵敏度和重现性，满足大批量样品的全自动和高通量分析要求。除此之外，由于整个分析过程在密闭系统中进行，可以减少样品污染及可能发生的分析物降解[ 9，20，21]。
利用在线固相萃取液质联用技术测定人血浆中的8OHdG含量，方法不仅省时省力，还可避免电化学检测法中内源性物质的干扰和免疫检测特异性低的问题，方法可用于评价疾病状态以及人体接触纳米颗粒后的氧化应激状态。
人体前列腺素E2（PGE2）由前列腺素E2合成酶1合成，在炎症反应、疼痛、发烧和血管调节中发挥了重要作用。Fabian等[ 50]通过测定A549微粒体孵育体系中前列腺素E2含量，筛选微粒体前列腺素E2合成酶1（mPGES 1）抑制剂。他们建立了在线固相萃取HPLCUV方法，分别设计了单SPE柱和并联SPE柱交替模式，并进行比较。结果证明，在线固相萃取法不需要任何前处理，灵敏度达到57 μg/L；与单柱相比，并联双柱模式分析时间显著缩短，为mPGES 1抑制剂的筛选提供了快速可靠的方法。同样，Heinig等建立在线萃取技术，以小鼠血浆、尿液和组织中糖皮质激素浓度水平作为生物标志物，进行11βHSD1抑制剂候选药的药效评价[ 51]。
内源性脑神经肽是重要的内源性调节剂，由于其含量较低和大脑组织基质的复杂性，使得定量测定很困难。一维液相色谱在测定脑神经肽时难以获得足够的分离度。Mihailova等[ 52]建立了两套在线二维液相色谱系统，即HILICRP和SCXRP色谱系统，通过比较确定适用于缺氧应激条件下大脑神经肽含量测定方法。实验结果显示，HILICRP系统可在一维柱分离后得到19个肽段，而传统的SCXRP系统的实际局限性仅得到6个，HILICRP系统比SCXRP系统获得多于3倍的肽段信息，表明HILICRP系统更适合脑神经肽的肽段组学比较研究。同时，为了防止HILIC和RP柱不兼容的问题，在两柱间再加了一根SPE柱，使得流动相间的切换能够平稳过渡。
3.6 手性化合物的分离和分析
在药物研究中，常常需要对样品中不同药物或药物手性异构体进行分离，二维液相色谱是手性化合物分离的有力工具之一。Mangani等[ 20]建立了多柱在线切换HPLC技术对血清中常用的6种治疗心血管疾病药物进行分离测定，其中β受体阻断剂吲哚洛尔是手性药物。血清样品先经过在线SPE进行纯化， 纯化样品洗脱进入RP18柱，用pH 2.5的流动相洗脱，将吲哚洛尔与其它药物完全分离，后 者经 UV检测；随后通过中心切割，将吲哚洛尔引入手性AGP柱以pH 7.0的流动相进行二维手性分离分析。通过对流动相pH的调整，同一二维色谱法也可应用于其他药物及其代谢产物的分离。Bester等[ 53]则应用在线二维液相色谱法分离检测生物样品（鱼油、灰欧肝等）中的六溴环十二烷（HBCD）。市场上HBCD是3种异构体 （αHBCD， βHBCD和γHBCD）的混合物，且每种异构体还存在手性异构，尽管通过手性柱可以手性分离异构体，但3种异构体间的完全分离非常困难。Bester等[53]的方法分别用Synergi polar plus柱和Nucleodex betaPM柱作为一维和二维柱，待测物先在一维柱上使异构体达到分离，再通过中心切割进入二维柱实现各手性异构体的分离。与以往的单柱或是串联柱方法相比，该方法的分析物色谱峰不受其它异构体峰或杂质峰影响，有效峰容量提高了2倍，各异构体在二维色谱上达到更充分的分离。
4 展 望
经过十余年的快速发展，无论在仪器设备、技术上、还是在应用扩展方面，二维液相色谱均有显著进步。在原有液相色谱的基础上增加简单配置，如添加一个泵和六通阀，实现在线二维液相色谱。色谱仪器厂家也已开发出了多种整合式的在线二维液相色谱系统，如UltiMate 3000型液相色谱仪、RapidFireTM SPEMS系统等。目前，二维液相色谱多采用在线模式与质谱相连，成功应用于各种复杂基质样品中的小分子药物和大分子蛋白等的分析。本文总结了近几年在线二维液相色谱在药物代谢领域， 以及体内药物、毒物和内源物生物分析方面的应用进展。大量应用实例展示了在线二维液相色谱在复杂生物样品中药物、毒物和内源物分析中的优势，为生物分析中常见的基质干扰、前处理方法繁琐、通量低、重现性和准确性较差等问题提供了有效的解决方案，近年来在药代动力学研究及其它生物样品的分析中得以广泛应用。
但是，二维液相色谱的应用推广还有一些问题需要进一步解决。 例如，二维色谱柱系统选择和方法建立， 以及流动相的选择和匹配相对复杂，需要繁琐的软件设置和支持，对专业知识和技能有一定的要求；因兼容性问题，进入二维柱的样品常需要稀释，导致方法灵敏度降低，影响生物样品中痕量化合物的检测；以及固相萃取柱和色谱柱的选择性和可用性的限制等。随着二维液相色谱的不断发展完善，以及应用面的扩大和经验的积累和总结，这一技术在体内药物、毒物和内源性物质分析中将具有 良好的应用前景。
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Application of Twodimensional Liquid Chromatography
Analysis of Drugs and Toxicants
XIAO WeiBin， JIAN Yang， LI Hua*
（Beijing Institute of Pharmacology and Toxicology， State Key Laboratory of Toxicology and
Medical Countermeasures， Beijing 100850，China）
Abstract Qualitative and quantitative analyses of biological samples containing drugs， toxicants and endogenous substances play an important role in the researches of life sciences， as well as in new drug discovery and development. Biological samples are characterized by complex matrix， multiple endogenous interferences， significantly lower concentrations of measured analytes compared to endogenous components and small sampling volume. Consequently， it often requires bioanalysis methods with superior specificity， high sensitivity and good reproducibility. The twodimensional liquid chromatography （2DLC） technique， which allows for high peak capacity， significant reduced matrix effect and carryover of complex matrix samples and automated sample pretreatment and analysis， has been the powerful solution to the separation and analysis of biological sample and widely applied to environment， food and pharmaceutical analysis. On the basis of introduction of the principle and equipments of 2DLC， the application of this technique in the pharmacokinetics， toxicological and biological study was reviewed.
Keywords Two dimensional liquid chromatography； Online solid phase extraction； Pharmacokinetics； Bioanalysis； Review
（Received 31 August 2014； accepted 20 October 2014）
（Beijing Institute of Pharmacology and Toxicology， State Key Laboratory of Toxicology and
Medical Countermeasures， Beijing 100850，China）
Abstract Qualitative and quantitative analyses of biological samples containing drugs， toxicants and endogenous substances play an important role in the researches of life sciences， as well as in new drug discovery and development. Biological samples are characterized by complex matrix， multiple endogenous interferences， significantly lower concentrations of measured analytes compared to endogenous components and small sampling volume. Consequently， it often requires bioanalysis methods with superior specificity， high sensitivity and good reproducibility. The twodimensional liquid chromatography （2DLC） technique， which allows for high peak capacity， significant reduced matrix effect and carryover of complex matrix samples and automated sample pretreatment and analysis， has been the powerful solution to the separation and analysis of biological sample and widely applied to environment， food and pharmaceutical analysis. On the basis of introduction of the principle and equipments of 2DLC， the application of this technique in the pharmacokinetics， toxicological and biological study was reviewed.
Keywords Two dimensional liquid chromatography； Online solid phase extraction； Pharmacokinetics； Bioanalysis； Review
（Received 31 August 2014； accepted 20 October 2014）
（Beijing Institute of Pharmacology and Toxicology， State Key Laboratory of Toxicology and
Medical Countermeasures， Beijing 100850，China）
Abstract Qualitative and quantitative analyses of biological samples containing drugs， toxicants and endogenous substances play an important role in the researches of life sciences， as well as in new drug discovery and development. Biological samples are characterized by complex matrix， multiple endogenous interferences， significantly lower concentrations of measured analytes compared to endogenous components and small sampling volume. Consequently， it often requires bioanalysis methods with superior specificity， high sensitivity and good reproducibility. The twodimensional liquid chromatography （2DLC） technique， which allows for high peak capacity， significant reduced matrix effect and carryover of complex matrix samples and automated sample pretreatment and analysis， has been the powerful solution to the separation and analysis of biological sample and widely applied to environment， food and pharmaceutical analysis. On the basis of introduction of the principle and equipments of 2DLC， the application of this technique in the pharmacokinetics， toxicological and biological study was reviewed.
Keywords Two dimensional liquid chromatography； Online solid phase extraction； Pharmacokinetics； Bioanalysis； Review
（Received 31 August 2014； accepted 20 October 2014）
