盐酸甲醇溶液提取气相色谱质谱法测定水生动植物样品丁基锡
肖小雨+贺根和+尹丽+黄翔峰
摘要采用四乙基硼酸钠（NaBEt4）为衍生剂，建立简单、高效的生物样品有机锡气相质谱（GCMS）分析方法。结果表明，冷冻干燥生物样品粉末0.1 g经15 mL 0.035 mol/L盐酸甲醇振荡提取1 h，定量提取液加入乙酸盐缓冲溶液（pH 4.8） 调节溶液酸度，用含内标物正己烷2 mL和0.5 mL 2%（m/V）NaBEt4水溶液衍生萃取30 min后，GCMS同时测定一丁基锡（ MBT）、二丁基锡（DBT）、三丁基锡（TBT）。在0.5～50 μg/L范围内，线性良好，3种有机锡加标回收率均在80%以上。此方法能快速简单对复杂生物样品中的有机锡进行分析，其检出限约为0.01 μg/L，3个平行样测量值标准偏差都在10%以内。
关键词盐酸甲醇溶液； 丁基锡； 气相色谱质谱； 水生动植物
1引言
有机锡化合物（OTCs）作为聚氯乙烯（PVC）稳定剂，农业杀虫剂，船体、海洋建筑以及钻井平台等的防污涂料已经在全世界范围得到广泛使用＼[1＼]。然而，OTCs在防污防害的同时，也对环境中的非目标生物造成急性或者潜在的危害，尤其以生物杀灭剂三丁基锡（TBT）危害最为严重＼[1～3＼]。研究发现，TBT不仅毒性大，而且能干扰生物体内荷尔蒙的合成、分泌、输送等过程，进而影响生物体的正常生长、发育和繁殖等生命活动＼[4～7＼]，给人类的健康生活带来潜在的危害。
目前，生物样品有机锡分析的方法已经有较多报道＼[8～12＼]，且主要以气相色谱技术为主，但是该分析方法要经过一个复杂的前处理过程，主要包括提取、净化、衍生和萃取等4个过程＼[1，2＼]，该复杂过程不仅耗时而且容易造成较大误差。为了更加有效地减小误差，使整个分析操作过程更加简单和快捷化，本实验以盐酸甲醇溶液为提取剂，提取冻干生物样品OTCs，然后直接用NaBEt4衍生剂和正己烷萃取剂对提取液同时衍生萃取，省去了传统方法的中净化步骤，建立水生植物样品中丁基锡化合物GCMS测定方法。
2实验方法
2.1仪器、试剂与材料
5975C质谱仪（配EI源）、7890A气相色谱仪（美国Agilent 公司）；6870液氮冷冻研磨机（美国TKISPEX 公司）； FD2C真空冷冻干燥机（北京博医康实验仪器有限公司）； KQ2200 B 超声清洗器（ 上海昆山公司）； pHS3C酸度计（上海雷磁仪器厂）； BS224S电子分析天平（赛多利斯科学仪器有限公司）； 聚四氟乙烯试管。所有玻璃仪器及试管在使用前都经过10%HNO3浸泡过夜，然后流水洗净，最后再用蒸馏水或纯净水洗干净，烘干备用。
三丁基锡 （TBT），二丁基锡 （DBT），一丁基锡（MBT）和四丁基锡（TEBT），均购自上海SigmaAldrich公司，纯度均大于96%；甲醇、正己烷（HPLC级，美国Tedia公司）；四乙基硼化钠（NaBEt4，纯度>98%，上海百灵威科技有限公司）；其它试剂均为国产分析纯。
小鲤鱼购自吉安花鸟市场，沉水植物金鱼藻取自赣江吉安段某支流，两种生物样品用去离子水和超纯水冲洗干净，在超低温冰箱中冷冻24 h，冷冻干燥72 h。碾磨粉碎，过100目孔径筛，标记后放干燥器备用。
2.2溶液配制
用甲醇溶液分别配制浓度为1.0 g/L的TBT，DBT，MBT标准储备液（TEBT使用正己烷配制），浓度以无机锡元素浓度计。根据需要，分别移取上述有机锡标准储备液配制相应浓度的有机锡标准工作溶液，并于冰箱中4 ℃黑暗保存不超过1星期。
配制0.035 mol/L HCl甲醇溶液、2%（m/V）NaBEt4溶液、3%（m/V）KOH溶液及相关缓冲溶液，其中NaBEt4溶液新鲜配制，并且在24 h内使用。
2.3样品前处理
2.3.1生物样品加标萃取准确称取0.1 g干燥生物样品于30 mL的特氟龙样品管中，分别加入25 ng和50 ng丁基锡混合标准工作液50 μL，样品管加盖密封吸附平衡后，分别用10 mL 0.035 mol/L盐酸甲醇溶液和5 mL 3% （m/V）KOH溶液，振荡萃取60 min，转速300 r/min，以6500 r/min离心15 min，取上清液，用0.45 μm聚四氟乙烯滤膜（空白及前期研究结果＼[13＼]表明该材质对有机锡不吸附）过滤后备用。同时增加OTCs的空白样品，所有样品做3组平行。
2.3.2生物样品萃取取在实验室富集初始浓度为3 μg/L TBT 5天的小鲤鱼和金鱼藻。3组平行生物样进行有机锡含量测定。
.4OTCs的衍生和萃取
参考文献＼[11＼]关于OTCs在植物样品的衍生和萃取方法及文献＼[8＼]关于OTCs在鱼类生物样品的衍生和萃取方法。本实验选取NaBEt4为衍生剂，正己烷为萃取剂，具体步骤为：5 mL OTCs提取液加入到装有40 mL 缓冲溶液的100 mL容量瓶中，然后再加入0.5 mL 2% NaBEt4溶液和2 mL含50 ng TEBT内标物的正己烷，加盖密封摇匀后恒温25 ℃条件下机械振荡 30 min，转速为300 r/min，取出后加纯净水至容量瓶瓶颈（不溢出），静置分层后取上层有机相进入GCMS分析。OTCs水样的衍生萃取步骤与生物样类似。
2.5GCMS测定
色谱柱：DB5MS色谱柱（30 m×0.25 mm，0.25 μm）；进样口温度为 250 ℃； 进样模式为不分流进样，速度为100 mL/min，载气为氦气，EI=70 eV； 柱温箱升温程序为：60 ℃（2 min）25 ℃/min230 ℃（2 min）； 柱流速控制模式为恒流，流速1 mL/min ； 初始压力为71.85 kPa； 进样量为1.0 μL。质谱离子
[FQ（92＼.292，Y-WZ][HJ*4]表1GCMS分析丁基锡的保留时间与SIM选择条件
Table 1Retention time and SIM factors of butyltin compounds by GCMS
[HT6SS][BG（][BHDFG4，WK14，WK8，WK16W]丁基锡Butyltin保留时间Retention time
（min）定量与定性离子Qualitative ion and quantitative ion
（m/z）三丁基锡 Tributyltin， TBT10.20263*， 207， 291二丁基锡 Dibutyltin， DBT8.92263*， 207， 261一丁基锡 Monobutyltin， MBT7.41179*， 235， 233四丁基锡 Tetrabutyltin， TEBT11.28179*， 177， 233[BHDFG12，WKZQ0W]* 定量离子（Quanlitative ion）。[BG）W][HT5][HJ]
源温度：250 ℃； 接口温度：280 ℃； 溶剂延迟时间为6 min； 质谱检测模式为选择离子模式（SIM），各丁基锡的保留时间和定量、定性离子见表1。
3结果与讨论
3.1衍生化条件的优化
3.1.1pH对OTCs衍生化的影响NaBEt4是大多数研究者首选的OTCs衍生试剂，它已成功用于水样、生物样、沉积物、土壤、木材以及其它物质中不同形态甲基锡、丁基锡、苯基锡、环己基锡等有机锡化合物的测定＼[6，10，12，14，15＼]。为了解pH值（pH 2.0，4.8，7.0，8.0和10.0）＼[12＼]对NaBEt4衍生剂的衍生效果的影响， 0.5 mL 2% NaBEt4溶液＼[9＼]分别对含10 ng丁基锡混标物的水溶液衍生效率，各种OTCs在不同pH值下经衍生萃取分析所得的GCMS峰面积强度如图1所示。从图1可见，所有水样中加标OTCs的最大峰面积均发生在pH 4.8，但是内标物TEBT在两组混标物中峰面积响应值相当，而且几乎不随pH值变化， 这主要是因为其不需衍生化就可以直接被GCMS检测。这些结果表明，pH值对OTCs的衍生效率的影响较大，衍生和萃取效果整体上是随pH值的增大而先增大后减小，这与文献[1，9，16]的结果一致。因此，综合考虑各OTCs的衍生效率，本实验选择1 mol/L醋酸盐缓冲溶液（pH 4.8）作为生物样品中有机锡化合物萃取衍生缓冲溶液。
3.1.2衍生和萃取时间的影响在上述选出的pH缓冲溶液（pH 4.8）条件下，继而研究衍生和萃取时间对NaBEt4衍生效率的影响，10 mL 1 μg/L的丁基锡混合标准溶液加入40 mL pH 4.8缓冲溶液中，然后再分别加入0.5 mL 2% NaBEt4溶液和1 mL含10 ng内标TEBT的正己烷溶液同时进行衍生和萃取。依据文献＼[8＼]报道，当衍生萃取反应超过60 min，所有OTCs的电信号强度能基本维持不变，因此，本实验条件下，分别考察了反应10，30，60 和120 min时有机锡的衍生萃取回收效率，结果如图2所示。从图2发现，当反应时间为30 min时，所有OTCs的回收率都能达到80%以上，尤其是TBT和DBT，其回收率基本达到100%。但是当反应时间增加到60 min，甚至120 min，各OTCs回收率增加量不超过2%，因此，在保证分析准确的情况下，为了减少操作时间，本实验最终选取衍生化时间为3.2酸碱提取法对添加OTCs样品回收率比较
生物样品中OTCs常用的方法是酸提取法＼[10～12＼]和碱提取法＼[9＼]，并通常以超声、机械振荡等辅助手段增加提取效率。因此，本研究结合文献报道，首先选取对鱼和植物样均有良好提取效果的盐酸甲醇溶液对冻干样品加标OTCs进行提取，然后依据前面获得的衍生和萃取条件进行分析，结果列于表2。从表2可知，当0.1g生物样品中分别添加25和50 ng的OTCs，3组平行样中各OTCs加标回收率的平均值都能达到80.0%以上，而且OTCs两个浓度水平的加标回收率基本一致。但是，不同OTCs之间，其回收率略有差别，其中以一取代有机锡的回收率最低。如在鱼样中，TBT和DBT的回收率平均值在96.4%～105.0%，而MBT仅在81.0%左右； 相同的变化规律也能在金鱼藻样品中发现。这些结果与Carlierpinasseau等关于OTCs在淡水白鲑＼[10＼]和Simon等关于OTCs在水生植物伊乐藻＼[11＼]的研究结果基
6.2[BHDFG1*2，WKZQ0W][BG）W][HT5][HJ]
本一致，而化合物本身的理化特性差异（如其在水中的溶解度以及疏水性等）可能是造成OTCs回收率差别的主要原因，其中MBT的溶解度最大，回收率最低。
其次，Tang等＼[9＼]认为，富集在鱼体上OTCs往往是与鱼体各组织强烈结合在一起，采用强碱溶液将鱼类等生物体完全消解，对测定生物体OTCs含量可能更加准确，他们的研究结果表明，以KOH溶液提取标准参考鱼样中TBT，其回收率能达到83%以上。因此，本实验在上述文献的基础上，采用3% KOH溶液对上述加标OTCs的鱼样进行提取，然后经过同样的萃取衍生和测定步骤，最后所得结果见表3。从表3可见，KOH溶液对鱼样中的加标OTCs具有很好的回收效果，OTCs两个浓度的加标回收率均达80%以上。对于加标为50 ng的冻干鱼粉样品（0.1g），其3组平行样中TBT，DBT和MBT的加标平均回收率分别为103.0%，102.5%和80.7%。这些结果与酸性提取液的效果类似，因此，两种方法都可以
[FQ（14＼.272，Y-WZ][HJ*4]表3碱性KOH提取鱼粉样品中丁基锡化合物的加标回收率和精密度
生物体直接从水环境富集OTCs应该具有本质的差别，而采用这两种方法同时对同一实际环境生物样品有机锡含量分析的对比研究还没有报道。因此，本实验分别采用HCl甲醇溶液和KOH对同一鱼样（0.1 g冻干鱼样）中富集的TBT进行提取对比，并分别依据本实验和Tang等＼[9＼]获得的最佳衍生和萃取条件进行衍生和萃取，最后经过GCMS分析。结果表明，两种方法都能提取出生物体内富集的TBT及其相应代谢产物DBT和MBT，但是提取效率不一样。通过计算发现，对于TBT来说，盐酸甲醇提取后的平均值为2.63 μg/g（干重），而KOH提取后的平均值为2.43 μg/g（干重），两种方法的检测结果相当（p>0.05）；但是降解产物DBT和MBT在酸性条件下检出结果却是碱性条件下检出结果的两倍或者两倍以上的关系，其中DBT平均值分别为0.12和0.043 μg/g（干重），MBT平均值分别为0.029和0.011 μg/g（干重），检测结果存在显著性差异（0.01
配制0.5～50 μg/L的系列标准溶液，并加入10 ng内标物，按照水样处理方法衍生萃取，最终定容至1.0 mL，然后采用相应的GCMS检测条件分析测定，最后以有机锡和内标物的面积比（y）对有机锡
[TS（]
和内标物的浓度比（x）作线性回归分析，各有机锡的回归方程如表4所示。3种物质在0.5～50 μg/L范围内线性均良好，回归系数R2>0.998。并采用加标（10 μg/L）样品进行平行测定，得出各丁基锡的检出限为0. 01～0.12 μg/L，详见表4。 4种丁机锡标准气相色谱图以及鲤鱼和金鱼藻富集三丁基锡后在酸性条件下的气相色谱图分别如图3（a， b和c），其中图3（b和c）中检查到的MBT和DBT均为TBT在动植物体内的降解产物。
4结论
生物样品中有机锡化合物分析方法一般要经过提取、净化、衍生（气相分析系统）、萃取和检测等5个过程。本研究以0.035 mol/L HCl甲醇溶液提取并配以0.5 mL 2% NaBEt4衍生和1 mL含一定内标浓度的正己烷萃取生物样品中有机锡化合物，最后通过GCMS进行定性和定量分析， 0.1 g冻干生物样品粉末中各种有机锡化合物的加标回收率均能到达80%以上，最佳衍生pH=4.8，衍生时间为30 min。此方法不仅省去了传统生物样品中净化的步骤，有效减小了实验误差，而且能将衍生和萃取步骤同时进行，使实验操作简单、快捷，是一种高效的有机锡化合物分析方法。实验发现，盐酸甲醇提取液能更加有效地将鱼体内富集的有机锡化合物提取出来。
References
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15QI JiaLin， YANG GuiPeng， WANG ZhaoKun， NIU ZengYuan. Chinese J. Anal. Chem.， 2013， 41（1）： 119-122
戚佳琳， 杨桂朋， 王兆锟， 牛增元. 分析化学， 2013， 41（1）： 119-122
16Pellegrino C， Massanisso P， Morabito R. Trends Anal. Chem.， 2000， 19（23）： 97-106
AbstractA simple and efficient method for the determination of organotin compounds （OTCs） in biota by GCMS coupling with sodium tetraethylborate （NaBEt4） derivatization was established. The results showed that recoveries for each OTCs spiked in blank freezedryed biological samples （0.1 g） following extraction （15 mL 0.035 mol/L methanolic HCl solution for 1 h ） and derivatization （2 mL contained internal standard nhexane and 0.5 mL of 2% （m/V） NaBEt4 solution for 30 min） were above 80%. The method is fast and easy to operate for the determination of OTCs in complex biological samples. The minimum limit of detection was about 0.01 μg/L， and relative standard deviation values were within 10% for three parallel samples.
KeywordsHydrochloric acidmethanol solution； Butyltin compounds； Gas chromatographymass spectrometry； Aquatic animal and plant products
周群芳， 江桂斌， 吴迪靖. 分析化学， 2001， 29（4）： 453-456
15QI JiaLin， YANG GuiPeng， WANG ZhaoKun， NIU ZengYuan. Chinese J. Anal. Chem.， 2013， 41（1）： 119-122
戚佳琳， 杨桂朋， 王兆锟， 牛增元. 分析化学， 2013， 41（1）： 119-122
16Pellegrino C， Massanisso P， Morabito R. Trends Anal. Chem.， 2000， 19（23）： 97-106
AbstractA simple and efficient method for the determination of organotin compounds （OTCs） in biota by GCMS coupling with sodium tetraethylborate （NaBEt4） derivatization was established. The results showed that recoveries for each OTCs spiked in blank freezedryed biological samples （0.1 g） following extraction （15 mL 0.035 mol/L methanolic HCl solution for 1 h ） and derivatization （2 mL contained internal standard nhexane and 0.5 mL of 2% （m/V） NaBEt4 solution for 30 min） were above 80%. The method is fast and easy to operate for the determination of OTCs in complex biological samples. The minimum limit of detection was about 0.01 μg/L， and relative standard deviation values were within 10% for three parallel samples.
KeywordsHydrochloric acidmethanol solution； Butyltin compounds； Gas chromatographymass spectrometry； Aquatic animal and plant products
周群芳， 江桂斌， 吴迪靖. 分析化学， 2001， 29（4）： 453-456
15QI JiaLin， YANG GuiPeng， WANG ZhaoKun， NIU ZengYuan. Chinese J. Anal. Chem.， 2013， 41（1）： 119-122
戚佳琳， 杨桂朋， 王兆锟， 牛增元. 分析化学， 2013， 41（1）： 119-122
16Pellegrino C， Massanisso P， Morabito R. Trends Anal. Chem.， 2000， 19（23）： 97-106
AbstractA simple and efficient method for the determination of organotin compounds （OTCs） in biota by GCMS coupling with sodium tetraethylborate （NaBEt4） derivatization was established. The results showed that recoveries for each OTCs spiked in blank freezedryed biological samples （0.1 g） following extraction （15 mL 0.035 mol/L methanolic HCl solution for 1 h ） and derivatization （2 mL contained internal standard nhexane and 0.5 mL of 2% （m/V） NaBEt4 solution for 30 min） were above 80%. The method is fast and easy to operate for the determination of OTCs in complex biological samples. The minimum limit of detection was about 0.01 μg/L， and relative standard deviation values were within 10% for three parallel samples.
KeywordsHydrochloric acidmethanol solution； Butyltin compounds； Gas chromatographymass spectrometry； Aquatic animal and plant products
摘要采用四乙基硼酸钠（NaBEt4）为衍生剂，建立简单、高效的生物样品有机锡气相质谱（GCMS）分析方法。结果表明，冷冻干燥生物样品粉末0.1 g经15 mL 0.035 mol/L盐酸甲醇振荡提取1 h，定量提取液加入乙酸盐缓冲溶液（pH 4.8） 调节溶液酸度，用含内标物正己烷2 mL和0.5 mL 2%（m/V）NaBEt4水溶液衍生萃取30 min后，GCMS同时测定一丁基锡（ MBT）、二丁基锡（DBT）、三丁基锡（TBT）。在0.5～50 μg/L范围内，线性良好，3种有机锡加标回收率均在80%以上。此方法能快速简单对复杂生物样品中的有机锡进行分析，其检出限约为0.01 μg/L，3个平行样测量值标准偏差都在10%以内。
关键词盐酸甲醇溶液； 丁基锡； 气相色谱质谱； 水生动植物
1引言
有机锡化合物（OTCs）作为聚氯乙烯（PVC）稳定剂，农业杀虫剂，船体、海洋建筑以及钻井平台等的防污涂料已经在全世界范围得到广泛使用＼[1＼]。然而，OTCs在防污防害的同时，也对环境中的非目标生物造成急性或者潜在的危害，尤其以生物杀灭剂三丁基锡（TBT）危害最为严重＼[1～3＼]。研究发现，TBT不仅毒性大，而且能干扰生物体内荷尔蒙的合成、分泌、输送等过程，进而影响生物体的正常生长、发育和繁殖等生命活动＼[4～7＼]，给人类的健康生活带来潜在的危害。
目前，生物样品有机锡分析的方法已经有较多报道＼[8～12＼]，且主要以气相色谱技术为主，但是该分析方法要经过一个复杂的前处理过程，主要包括提取、净化、衍生和萃取等4个过程＼[1，2＼]，该复杂过程不仅耗时而且容易造成较大误差。为了更加有效地减小误差，使整个分析操作过程更加简单和快捷化，本实验以盐酸甲醇溶液为提取剂，提取冻干生物样品OTCs，然后直接用NaBEt4衍生剂和正己烷萃取剂对提取液同时衍生萃取，省去了传统方法的中净化步骤，建立水生植物样品中丁基锡化合物GCMS测定方法。
2实验方法
2.1仪器、试剂与材料
5975C质谱仪（配EI源）、7890A气相色谱仪（美国Agilent 公司）；6870液氮冷冻研磨机（美国TKISPEX 公司）； FD2C真空冷冻干燥机（北京博医康实验仪器有限公司）； KQ2200 B 超声清洗器（ 上海昆山公司）； pHS3C酸度计（上海雷磁仪器厂）； BS224S电子分析天平（赛多利斯科学仪器有限公司）； 聚四氟乙烯试管。所有玻璃仪器及试管在使用前都经过10%HNO3浸泡过夜，然后流水洗净，最后再用蒸馏水或纯净水洗干净，烘干备用。
三丁基锡 （TBT），二丁基锡 （DBT），一丁基锡（MBT）和四丁基锡（TEBT），均购自上海SigmaAldrich公司，纯度均大于96%；甲醇、正己烷（HPLC级，美国Tedia公司）；四乙基硼化钠（NaBEt4，纯度>98%，上海百灵威科技有限公司）；其它试剂均为国产分析纯。
小鲤鱼购自吉安花鸟市场，沉水植物金鱼藻取自赣江吉安段某支流，两种生物样品用去离子水和超纯水冲洗干净，在超低温冰箱中冷冻24 h，冷冻干燥72 h。碾磨粉碎，过100目孔径筛，标记后放干燥器备用。
2.2溶液配制
用甲醇溶液分别配制浓度为1.0 g/L的TBT，DBT，MBT标准储备液（TEBT使用正己烷配制），浓度以无机锡元素浓度计。根据需要，分别移取上述有机锡标准储备液配制相应浓度的有机锡标准工作溶液，并于冰箱中4 ℃黑暗保存不超过1星期。
配制0.035 mol/L HCl甲醇溶液、2%（m/V）NaBEt4溶液、3%（m/V）KOH溶液及相关缓冲溶液，其中NaBEt4溶液新鲜配制，并且在24 h内使用。
2.3样品前处理
2.3.1生物样品加标萃取准确称取0.1 g干燥生物样品于30 mL的特氟龙样品管中，分别加入25 ng和50 ng丁基锡混合标准工作液50 μL，样品管加盖密封吸附平衡后，分别用10 mL 0.035 mol/L盐酸甲醇溶液和5 mL 3% （m/V）KOH溶液，振荡萃取60 min，转速300 r/min，以6500 r/min离心15 min，取上清液，用0.45 μm聚四氟乙烯滤膜（空白及前期研究结果＼[13＼]表明该材质对有机锡不吸附）过滤后备用。同时增加OTCs的空白样品，所有样品做3组平行。
2.3.2生物样品萃取取在实验室富集初始浓度为3 μg/L TBT 5天的小鲤鱼和金鱼藻。3组平行生物样进行有机锡含量测定。
.4OTCs的衍生和萃取
参考文献＼[11＼]关于OTCs在植物样品的衍生和萃取方法及文献＼[8＼]关于OTCs在鱼类生物样品的衍生和萃取方法。本实验选取NaBEt4为衍生剂，正己烷为萃取剂，具体步骤为：5 mL OTCs提取液加入到装有40 mL 缓冲溶液的100 mL容量瓶中，然后再加入0.5 mL 2% NaBEt4溶液和2 mL含50 ng TEBT内标物的正己烷，加盖密封摇匀后恒温25 ℃条件下机械振荡 30 min，转速为300 r/min，取出后加纯净水至容量瓶瓶颈（不溢出），静置分层后取上层有机相进入GCMS分析。OTCs水样的衍生萃取步骤与生物样类似。
2.5GCMS测定
色谱柱：DB5MS色谱柱（30 m×0.25 mm，0.25 μm）；进样口温度为 250 ℃； 进样模式为不分流进样，速度为100 mL/min，载气为氦气，EI=70 eV； 柱温箱升温程序为：60 ℃（2 min）25 ℃/min230 ℃（2 min）； 柱流速控制模式为恒流，流速1 mL/min ； 初始压力为71.85 kPa； 进样量为1.0 μL。质谱离子
[FQ（92＼.292，Y-WZ][HJ*4]表1GCMS分析丁基锡的保留时间与SIM选择条件
Table 1Retention time and SIM factors of butyltin compounds by GCMS
[HT6SS][BG（][BHDFG4，WK14，WK8，WK16W]丁基锡Butyltin保留时间Retention time
（min）定量与定性离子Qualitative ion and quantitative ion
（m/z）三丁基锡 Tributyltin， TBT10.20263*， 207， 291二丁基锡 Dibutyltin， DBT8.92263*， 207， 261一丁基锡 Monobutyltin， MBT7.41179*， 235， 233四丁基锡 Tetrabutyltin， TEBT11.28179*， 177， 233[BHDFG12，WKZQ0W]* 定量离子（Quanlitative ion）。[BG）W][HT5][HJ]
源温度：250 ℃； 接口温度：280 ℃； 溶剂延迟时间为6 min； 质谱检测模式为选择离子模式（SIM），各丁基锡的保留时间和定量、定性离子见表1。
3结果与讨论
3.1衍生化条件的优化
3.1.1pH对OTCs衍生化的影响NaBEt4是大多数研究者首选的OTCs衍生试剂，它已成功用于水样、生物样、沉积物、土壤、木材以及其它物质中不同形态甲基锡、丁基锡、苯基锡、环己基锡等有机锡化合物的测定＼[6，10，12，14，15＼]。为了解pH值（pH 2.0，4.8，7.0，8.0和10.0）＼[12＼]对NaBEt4衍生剂的衍生效果的影响， 0.5 mL 2% NaBEt4溶液＼[9＼]分别对含10 ng丁基锡混标物的水溶液衍生效率，各种OTCs在不同pH值下经衍生萃取分析所得的GCMS峰面积强度如图1所示。从图1可见，所有水样中加标OTCs的最大峰面积均发生在pH 4.8，但是内标物TEBT在两组混标物中峰面积响应值相当，而且几乎不随pH值变化， 这主要是因为其不需衍生化就可以直接被GCMS检测。这些结果表明，pH值对OTCs的衍生效率的影响较大，衍生和萃取效果整体上是随pH值的增大而先增大后减小，这与文献[1，9，16]的结果一致。因此，综合考虑各OTCs的衍生效率，本实验选择1 mol/L醋酸盐缓冲溶液（pH 4.8）作为生物样品中有机锡化合物萃取衍生缓冲溶液。
3.1.2衍生和萃取时间的影响在上述选出的pH缓冲溶液（pH 4.8）条件下，继而研究衍生和萃取时间对NaBEt4衍生效率的影响，10 mL 1 μg/L的丁基锡混合标准溶液加入40 mL pH 4.8缓冲溶液中，然后再分别加入0.5 mL 2% NaBEt4溶液和1 mL含10 ng内标TEBT的正己烷溶液同时进行衍生和萃取。依据文献＼[8＼]报道，当衍生萃取反应超过60 min，所有OTCs的电信号强度能基本维持不变，因此，本实验条件下，分别考察了反应10，30，60 和120 min时有机锡的衍生萃取回收效率，结果如图2所示。从图2发现，当反应时间为30 min时，所有OTCs的回收率都能达到80%以上，尤其是TBT和DBT，其回收率基本达到100%。但是当反应时间增加到60 min，甚至120 min，各OTCs回收率增加量不超过2%，因此，在保证分析准确的情况下，为了减少操作时间，本实验最终选取衍生化时间为3.2酸碱提取法对添加OTCs样品回收率比较
生物样品中OTCs常用的方法是酸提取法＼[10～12＼]和碱提取法＼[9＼]，并通常以超声、机械振荡等辅助手段增加提取效率。因此，本研究结合文献报道，首先选取对鱼和植物样均有良好提取效果的盐酸甲醇溶液对冻干样品加标OTCs进行提取，然后依据前面获得的衍生和萃取条件进行分析，结果列于表2。从表2可知，当0.1g生物样品中分别添加25和50 ng的OTCs，3组平行样中各OTCs加标回收率的平均值都能达到80.0%以上，而且OTCs两个浓度水平的加标回收率基本一致。但是，不同OTCs之间，其回收率略有差别，其中以一取代有机锡的回收率最低。如在鱼样中，TBT和DBT的回收率平均值在96.4%～105.0%，而MBT仅在81.0%左右； 相同的变化规律也能在金鱼藻样品中发现。这些结果与Carlierpinasseau等关于OTCs在淡水白鲑＼[10＼]和Simon等关于OTCs在水生植物伊乐藻＼[11＼]的研究结果基
6.2[BHDFG1*2，WKZQ0W][BG）W][HT5][HJ]
本一致，而化合物本身的理化特性差异（如其在水中的溶解度以及疏水性等）可能是造成OTCs回收率差别的主要原因，其中MBT的溶解度最大，回收率最低。
其次，Tang等＼[9＼]认为，富集在鱼体上OTCs往往是与鱼体各组织强烈结合在一起，采用强碱溶液将鱼类等生物体完全消解，对测定生物体OTCs含量可能更加准确，他们的研究结果表明，以KOH溶液提取标准参考鱼样中TBT，其回收率能达到83%以上。因此，本实验在上述文献的基础上，采用3% KOH溶液对上述加标OTCs的鱼样进行提取，然后经过同样的萃取衍生和测定步骤，最后所得结果见表3。从表3可见，KOH溶液对鱼样中的加标OTCs具有很好的回收效果，OTCs两个浓度的加标回收率均达80%以上。对于加标为50 ng的冻干鱼粉样品（0.1g），其3组平行样中TBT，DBT和MBT的加标平均回收率分别为103.0%，102.5%和80.7%。这些结果与酸性提取液的效果类似，因此，两种方法都可以
[FQ（14＼.272，Y-WZ][HJ*4]表3碱性KOH提取鱼粉样品中丁基锡化合物的加标回收率和精密度
生物体直接从水环境富集OTCs应该具有本质的差别，而采用这两种方法同时对同一实际环境生物样品有机锡含量分析的对比研究还没有报道。因此，本实验分别采用HCl甲醇溶液和KOH对同一鱼样（0.1 g冻干鱼样）中富集的TBT进行提取对比，并分别依据本实验和Tang等＼[9＼]获得的最佳衍生和萃取条件进行衍生和萃取，最后经过GCMS分析。结果表明，两种方法都能提取出生物体内富集的TBT及其相应代谢产物DBT和MBT，但是提取效率不一样。通过计算发现，对于TBT来说，盐酸甲醇提取后的平均值为2.63 μg/g（干重），而KOH提取后的平均值为2.43 μg/g（干重），两种方法的检测结果相当（p>0.05）；但是降解产物DBT和MBT在酸性条件下检出结果却是碱性条件下检出结果的两倍或者两倍以上的关系，其中DBT平均值分别为0.12和0.043 μg/g（干重），MBT平均值分别为0.029和0.011 μg/g（干重），检测结果存在显著性差异（0.01
配制0.5～50 μg/L的系列标准溶液，并加入10 ng内标物，按照水样处理方法衍生萃取，最终定容至1.0 mL，然后采用相应的GCMS检测条件分析测定，最后以有机锡和内标物的面积比（y）对有机锡
[TS（]
和内标物的浓度比（x）作线性回归分析，各有机锡的回归方程如表4所示。3种物质在0.5～50 μg/L范围内线性均良好，回归系数R2>0.998。并采用加标（10 μg/L）样品进行平行测定，得出各丁基锡的检出限为0. 01～0.12 μg/L，详见表4。 4种丁机锡标准气相色谱图以及鲤鱼和金鱼藻富集三丁基锡后在酸性条件下的气相色谱图分别如图3（a， b和c），其中图3（b和c）中检查到的MBT和DBT均为TBT在动植物体内的降解产物。
4结论
生物样品中有机锡化合物分析方法一般要经过提取、净化、衍生（气相分析系统）、萃取和检测等5个过程。本研究以0.035 mol/L HCl甲醇溶液提取并配以0.5 mL 2% NaBEt4衍生和1 mL含一定内标浓度的正己烷萃取生物样品中有机锡化合物，最后通过GCMS进行定性和定量分析， 0.1 g冻干生物样品粉末中各种有机锡化合物的加标回收率均能到达80%以上，最佳衍生pH=4.8，衍生时间为30 min。此方法不仅省去了传统生物样品中净化的步骤，有效减小了实验误差，而且能将衍生和萃取步骤同时进行，使实验操作简单、快捷，是一种高效的有机锡化合物分析方法。实验发现，盐酸甲醇提取液能更加有效地将鱼体内富集的有机锡化合物提取出来。
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AbstractA simple and efficient method for the determination of organotin compounds （OTCs） in biota by GCMS coupling with sodium tetraethylborate （NaBEt4） derivatization was established. The results showed that recoveries for each OTCs spiked in blank freezedryed biological samples （0.1 g） following extraction （15 mL 0.035 mol/L methanolic HCl solution for 1 h ） and derivatization （2 mL contained internal standard nhexane and 0.5 mL of 2% （m/V） NaBEt4 solution for 30 min） were above 80%. The method is fast and easy to operate for the determination of OTCs in complex biological samples. The minimum limit of detection was about 0.01 μg/L， and relative standard deviation values were within 10% for three parallel samples.
KeywordsHydrochloric acidmethanol solution； Butyltin compounds； Gas chromatographymass spectrometry； Aquatic animal and plant products
周群芳， 江桂斌， 吴迪靖. 分析化学， 2001， 29（4）： 453-456
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16Pellegrino C， Massanisso P， Morabito R. Trends Anal. Chem.， 2000， 19（23）： 97-106
AbstractA simple and efficient method for the determination of organotin compounds （OTCs） in biota by GCMS coupling with sodium tetraethylborate （NaBEt4） derivatization was established. The results showed that recoveries for each OTCs spiked in blank freezedryed biological samples （0.1 g） following extraction （15 mL 0.035 mol/L methanolic HCl solution for 1 h ） and derivatization （2 mL contained internal standard nhexane and 0.5 mL of 2% （m/V） NaBEt4 solution for 30 min） were above 80%. The method is fast and easy to operate for the determination of OTCs in complex biological samples. The minimum limit of detection was about 0.01 μg/L， and relative standard deviation values were within 10% for three parallel samples.
KeywordsHydrochloric acidmethanol solution； Butyltin compounds； Gas chromatographymass spectrometry； Aquatic animal and plant products
周群芳， 江桂斌， 吴迪靖. 分析化学， 2001， 29（4）： 453-456
15QI JiaLin， YANG GuiPeng， WANG ZhaoKun， NIU ZengYuan. Chinese J. Anal. Chem.， 2013， 41（1）： 119-122
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AbstractA simple and efficient method for the determination of organotin compounds （OTCs） in biota by GCMS coupling with sodium tetraethylborate （NaBEt4） derivatization was established. The results showed that recoveries for each OTCs spiked in blank freezedryed biological samples （0.1 g） following extraction （15 mL 0.035 mol/L methanolic HCl solution for 1 h ） and derivatization （2 mL contained internal standard nhexane and 0.5 mL of 2% （m/V） NaBEt4 solution for 30 min） were above 80%. The method is fast and easy to operate for the determination of OTCs in complex biological samples. The minimum limit of detection was about 0.01 μg/L， and relative standard deviation values were within 10% for three parallel samples.
KeywordsHydrochloric acidmethanol solution； Butyltin compounds； Gas chromatographymass spectrometry； Aquatic animal and plant products
