碳纳米管/纳米金复合膜电化学免疫传感器用于微囊藻毒素的检测研究
张新爱 申建忠 张帆 马海乐 韩恩 董晓娅
摘要利用核酸适配体特异的分子识别功能以及特定荧光基团之间的能量转移，建立了一种高灵敏度、高选择性测定雌二醇的光谱方法。研究了缓冲溶液的pH值、组成和浓度、核酸浓度、实验温度及响应时间等因素对检测雌二醇的影响。在最优的实验条件下（50 mmol/L BR缓冲溶液（pH 7.4），1.0×10mol/L核酸，实验温度45 ℃，响应时间19 min），体系荧光强度的改变值ΔI与雌二醇浓度的对数lgC呈良好的线性关系（r=0.9953），线性范围为1.0×10将本方法用于检测人体尿液中雌二醇的含量，雌二醇的加标回收率为94.0%～103.5%。
关键词适配体； 荧光共振能量转移； 雌二醇
1引言
雌二醇（17 βEstradiol）是一种天然类固醇雌激素，影响性特征的发展，在许多生理过程中起着至关重要的作用＼[1＼]。同时它也是一种重要的环境内分泌干扰物，可与共存的雌激素发生协同作用，促使雌激素活性增强＼[2，3＼]。雌二醇在人体的含量与乳腺癌等疾病有很大相关性，即使在很低的浓度下也有毒性或致癌作用＼[4＼]。
目前，雌二醇的检测技术主要分为三类：（1）色谱法，包括高效液相色谱法（HPLC）＼[5，6＼]、液相色谱质谱联用法（LCMS）＼[7，8＼]，以及气相色谱质谱联用法（GCMS）＼[9＼]，色谱法准确、可靠，但需要复杂的仪器，检测成本高，样品预处理复杂费时，衍生化还会造成目标类固醇的损失或降解，因此色谱法难以对大量样品进行快速检测，不能满足现场检测要求； （2）免疫学方法，包括酶联免疫吸附分析法（ELISA）＼[10＼]、化学发光免疫法（CLEIA）＼[11＼]、荧光标记免疫法＼[12＼]等，这类方法基于抗原抗体特异性相互作用从而具有很高的选择性，但因天然抗体稳定性较差，免疫法容易出现假阳性的结果； （3）电化学分析方法＼[13，14＼]，具有分析速度快、易于微型化、操作简便等特点，但该技术多基于对电极表面的修饰，大都存在修饰层稳定性和重现性差、传质和电荷传递速率慢、选择识别能力差等问题。
核酸适配体（Aptamer）是一段体外通过配体指数富集的系统进化（SELEX）技术筛选获得的寡核苷酸片段，可以是RNA 或单链DNA。单链寡核苷酸的一些二级结构，如发夹、茎环结构等，可使核酸分子形成多种三维结构，成为与靶标物质特定区域结合的基础。适配体能与DNA、RNA、蛋白质以及其它小分子靶物质特异性结合，具有亲和力高、特异性强、容易制备及修饰、稳定性好等特性，常被用于制备各种适配体传感器＼[15＼]。
荧光共振能量转移（Fluorescence resonance energy transfer，FRET） ＼[16＼]是指在不同的荧光基团中，若一个荧光基团（供体）的荧光发射光谱与另一个基团（受体）的吸收光谱有一定的重叠，当两个基团间的距离合适时（一般小于10 nm），即可观察到荧光能量由供体向受体转移的现象，即供体荧光猝灭和受体荧光增强。本研究以雌二醇适配体（P1）作为供受体之间的桥联媒介，在适配体的两条互补链（F1和F2）末端分别修饰上羧基荧光素（FAM）和羧基四甲基罗丹明（TAMRA），其中FAM作为荧光供体，TAMRA作为受体，用FRET法检测雌二醇，实验原理如图1所示。当适配体P1不存在时，互补链F1FAM和F2TAMRA游离在溶液中（图1a）；向溶液中加入P1与F1和F2上碱基充分杂交后，FAM和TAMRA距离靠近，发生荧光能量转移（图1b）；再加入目标物雌二醇，雌二醇与P1特异性的结合使F1和F2重新游离出来（图1c），FAM荧光恢复。从而建立一种基于适配体FRET的高灵敏度及选择性的检测方法。
2实验部分
2.1仪器与试剂
F4600型荧光光谱仪（日本日立公司），10 mL石英检测池（Lightpath Optical Ltd.， UK），雷磁PHS3C精密酸度计（上海仪电科学仪器股份有限公司），5804型离心机（德国Eppendorf公司），HH4型数显恒温水浴锅（国华电器有限公司）。
3结果与讨论
3.1FRET现象
当适配体P1不存在时，FAM标记的F1和TAMRA标记的F2链游离在溶液中，在485 nm的激发波长下，只能检测到FAM在520 nm处的荧光（图2a）；向溶液中加入P1充分杂交后，520 nm处FAM的荧光强度降低，同时在580 nm处出现TAMRA明显的发光（图2b）；再加入雌二醇与P1特异性结合后，引起520 nm发射光增强、580 nm发射光降低（图2c）。对照实验显示，雌二醇对FAM没有明显的荧光增强作用
对TAMRA也无明显的淬灭作用，说明FAM荧光增强是由于雌二醇与适配体P1结合导致F1和F2游离出来引起的。鉴于520 nm处的发射光比580 nm处的发光更灵敏，故以520 nm处荧光强度的改变ΔI作为定量依据。
3.2实验条件对发光的影响
3.2.1缓冲溶液的pH值、种类和浓度的影响FAM和TAMRA间能否发生荧光能量转移主要取决于适配体与其互补链的碱基配对，而碱基配对受pH的影响显著，与缓冲介质的种类及浓度也相关
体系为研究对象，探讨上述因素的影响。研究表明，在相同浓度下，与PBS缓冲液、TrisHCl缓冲液、NaHCO3Na2CO3缓冲液相比，在BR缓冲液中荧光信号最强且稳定。改变BR的浓度进行实验，浓度为50 mmol/L 时荧光最强。向体系中加入雌二醇，记录不同pH值下ΔI值，结果表明，pH 7.4时可获得最大的ΔI值。综合以上实验结果，本研究选择pH 7.4的50 mmol/L BR缓冲溶液作为分析底液。
3.2.2核酸浓度的影响
分别测定适配体P1与其互补链F1和F2浓度为5.0×10， 1.0×10 mol/L时体系发光情况。随着核酸浓度增加，F1/F2/P1体系发光强度迅速增加，当核酸浓度高于1.0×10 mol/L时，发光强度增加幅度降低，考虑本底发光强度较大会增大实验误差，且高浓度下碱基错配的几率增大，故选择1.0×10mol/L作为最佳核酸浓度。在此浓度下FAM的发光强度能够满足实验需要，且加入雌二醇溶液后520 nm处荧光改变值ΔI最大。
3.2.3实验温度的影响温度决定核酸链杂交的速率和杂交双链的稳定性。分别记录25， 30， 35， 40， 45， 50和60 ℃下F1/F2/P1/雌二醇体系的荧光强度。随温度升高，荧光呈现先增大后减小的趋势，45 ℃时荧光最强。推测温度不仅影响核酸的构型，同时也影响供体FAM的荧光效率，温度升高FAM荧光效率下降，导致向受体TAMRA转移的能量降低＼[18＼]。因此选择45 ℃作为最佳工作温度。
3.2.4荧光体系的响应时间和稳定性研究
分别考察培养时间对F1/F2/P1体系以及加入雌二醇后发光强度的影响。向F1/F2溶液中加入P1后，在0～15 min内，520 nm处荧光强度随时间逐渐降低，580 nm处荧光强度逐渐增大， 15 min以后荧光几乎不再变化，说明适配体P1与其互补链F1和F2已杂交完全。再向该体系中加入雌二醇，520 nm处荧光增大，4 min后达稳定，说明适配体P1能够快速地识别雌二醇，显示P1与雌二醇之间高的亲和性。实验结果表明，在20 min内能够完成对体系荧光变化的测定。
将含有F1/F2/P1/雌二醇的BR缓冲溶液密封，在4 ℃避光储存，2天后检测，荧光信号没有显著的变化； 5天后，荧光强度下降5.8%，表明此体系具有良好的稳定性，能够弥补不适合现场检测的不足。
另外，对仪器参数也进行了优化，选择光电倍增管高压为700 V，激发和发射狭缝均为10 nm。
3.3雌二醇的线性响应范围和检出限
在最优的实验条件下，检测不同浓度的雌二醇对1.0×10
mol/L的发光体系平行测定5次，结果的相对标准偏差（RSD）小于3.3%。与雌二醇常用检测方法的对比结果（表1）表明，本方法将适配体的特异性识别与FRET技术结合，具有较高的灵敏度和分析效率。mol/L雌二醇的发光体系， 当控制荧光强度变化在±5%以内，1000倍的CaCl2， MgCl2， KH2PO4， Na2SO4， NaCl， KNO3和NH4Cl，450倍的肌酸酐、葡萄糖、果糖，300倍的尿素、L酪氨酸、L组氨酸、L赖氨酸、L缬氨酸、甘氨酸，200倍的尿酸、抗坏血酸，50倍的Al3+、Fe3+（50倍），25倍的Pb2+、Cd2+、Ni2+、Hg2+对体系没有干扰。重金属离子对该发光体系的干扰稍大，推测重金属离子与核酸结合后，使核酸构型改变，单链结构发生折叠，阻碍适配体与互补链碱基配对，引起FAM与TAMRA之间距离改变，不利于两者之间荧光能量转移。实际样品中重金属离子含量远低于实验所用浓度。因此，本方法具有较好的选择性和抗干扰能力。
3.5实际样品分析
将本方法用于人体尿液中雌二醇含量的检测，样品取自5名志愿者，未经任何前处理直接检测，每个样品平行测定3次取其平均值，结果在5.9×10
Symbolm@@ 10 mol/L之间，均在正常值范围内，如表2所示，在每个样品中加入雌二醇进行精密度和回收率实验，平行测定5次，相对标准偏差（RSD）为3.3%～6.7%， 回收率为94.0%～103.5%。由此可见，本方法具有较高的准确度和精密度，适合实际样品分析。4结论
本研究利用核酸适配体对目标分子特定的识别能力，结合荧光共振能量转移法测定雌二醇，实验表明，本方法能够抵抗高浓度无机盐、糖类、氨基酸、尿酸等生理体系中共存物质的干扰，具有较高的灵敏度、选择性、重现性以及稳定性，适合实际样品分析，为小分子检测提供了一种新思路。
References
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12WANG ChuanTao， WANG ShuGao， DU LingYun. J. Hebei Normal University （Natural Science Edition）， 2007， 31（2）： 218-221
王传涛， 王术皓， 杜凌云， 庄惠生. 河北师范大学学报（自然科学版）， 2007， 31（2）： 218-221
13Janegitz B C， Santos F A， Faria R C， Zucolotto V. Mater. Sci. Eng. C， 2014， 37： 14-19
14Hao G G， Zheng D Y， Gan T， Hu C G， Hu S S. J. Exp. Nanosci.， 2011， 6（1）： 13-28
15WANG Kun， TAO ZhanHui， XU Lei. Chinese J. Anal. Chem.， 2014， 42（2）： 298-304
王 昆， 陶占辉， 徐 蕾. 分析化学， 2014， 42（2）： 298-304
16Sapsford K E， Berti L， Medintz I L. Angew. Chem. Int. Ed.， 2006， 45（28）： 4562-4588
17Kim Y S， Jung H S， Matsuura T， Lee H Y， Kawai T， Gu M B. Biosens. Bioelectron.， 2007， 22（11）： 2525-2531
18Liu H L， Wang Y H， Shen A G， Zhou X D， Hu J M. Talanta， 2012， 93（15）： 330-335
AbstractA highly sensitive fluorescence spectroscopic method was established for the selective determination of estradiol， which took advantages of the excellent molecular recognition capability of aptamer and the energy transfer between the specific fluorescent groups. The effects of the pH value， buffer constituent and concentration， the concentration of DNA， the experimental temperature and response time on the detection of estradiol were studied. Under the optimal conditions （50 mmol/L BR buffer solution with pH value at 7.4， 1.0×10 7 mol/L for each DNA strand， incubation at 45 ℃， response time 19 min）， the change of the fluorescence intensity （ΔI） versus the logarithm of the concentration of estradiol （lgC） was linear over a concentration range from 1.0×10
mol/L with good linear correlation （r=0.9953）. The limit of detection （LOD） was found to be 6.0×10mol/L （S/N=3）. This method was successfully applied to the detection of estradiol in human urine， with the recovery in the range of 94.0%-103.5%. This method showed good precision and accuracy.
KeywordsAptamer； Fluorescence resonance energy transfer； Estradiol
12WANG ChuanTao， WANG ShuGao， DU LingYun. J. Hebei Normal University （Natural Science Edition）， 2007， 31（2）： 218-221
王传涛， 王术皓， 杜凌云， 庄惠生. 河北师范大学学报（自然科学版）， 2007， 31（2）： 218-221
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王 昆， 陶占辉， 徐 蕾. 分析化学， 2014， 42（2）： 298-304
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18Liu H L， Wang Y H， Shen A G， Zhou X D， Hu J M. Talanta， 2012， 93（15）： 330-335
AbstractA highly sensitive fluorescence spectroscopic method was established for the selective determination of estradiol， which took advantages of the excellent molecular recognition capability of aptamer and the energy transfer between the specific fluorescent groups. The effects of the pH value， buffer constituent and concentration， the concentration of DNA， the experimental temperature and response time on the detection of estradiol were studied. Under the optimal conditions （50 mmol/L BR buffer solution with pH value at 7.4， 1.0×10 7 mol/L for each DNA strand， incubation at 45 ℃， response time 19 min）， the change of the fluorescence intensity （ΔI） versus the logarithm of the concentration of estradiol （lgC） was linear over a concentration range from 1.0×10
mol/L with good linear correlation （r=0.9953）. The limit of detection （LOD） was found to be 6.0×10mol/L （S/N=3）. This method was successfully applied to the detection of estradiol in human urine， with the recovery in the range of 94.0%-103.5%. This method showed good precision and accuracy.
KeywordsAptamer； Fluorescence resonance energy transfer； Estradiol
12WANG ChuanTao， WANG ShuGao， DU LingYun. J. Hebei Normal University （Natural Science Edition）， 2007， 31（2）： 218-221
王传涛， 王术皓， 杜凌云， 庄惠生. 河北师范大学学报（自然科学版）， 2007， 31（2）： 218-221
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王 昆， 陶占辉， 徐 蕾. 分析化学， 2014， 42（2）： 298-304
16Sapsford K E， Berti L， Medintz I L. Angew. Chem. Int. Ed.， 2006， 45（28）： 4562-4588
17Kim Y S， Jung H S， Matsuura T， Lee H Y， Kawai T， Gu M B. Biosens. Bioelectron.， 2007， 22（11）： 2525-2531
18Liu H L， Wang Y H， Shen A G， Zhou X D， Hu J M. Talanta， 2012， 93（15）： 330-335
AbstractA highly sensitive fluorescence spectroscopic method was established for the selective determination of estradiol， which took advantages of the excellent molecular recognition capability of aptamer and the energy transfer between the specific fluorescent groups. The effects of the pH value， buffer constituent and concentration， the concentration of DNA， the experimental temperature and response time on the detection of estradiol were studied. Under the optimal conditions （50 mmol/L BR buffer solution with pH value at 7.4， 1.0×10 7 mol/L for each DNA strand， incubation at 45 ℃， response time 19 min）， the change of the fluorescence intensity （ΔI） versus the logarithm of the concentration of estradiol （lgC） was linear over a concentration range from 1.0×10
mol/L with good linear correlation （r=0.9953）. The limit of detection （LOD） was found to be 6.0×10mol/L （S/N=3）. This method was successfully applied to the detection of estradiol in human urine， with the recovery in the range of 94.0%-103.5%. This method showed good precision and accuracy.
KeywordsAptamer； Fluorescence resonance energy transfer； Estradiol
摘要利用核酸适配体特异的分子识别功能以及特定荧光基团之间的能量转移，建立了一种高灵敏度、高选择性测定雌二醇的光谱方法。研究了缓冲溶液的pH值、组成和浓度、核酸浓度、实验温度及响应时间等因素对检测雌二醇的影响。在最优的实验条件下（50 mmol/L BR缓冲溶液（pH 7.4），1.0×10mol/L核酸，实验温度45 ℃，响应时间19 min），体系荧光强度的改变值ΔI与雌二醇浓度的对数lgC呈良好的线性关系（r=0.9953），线性范围为1.0×10将本方法用于检测人体尿液中雌二醇的含量，雌二醇的加标回收率为94.0%～103.5%。
关键词适配体； 荧光共振能量转移； 雌二醇
1引言
雌二醇（17 βEstradiol）是一种天然类固醇雌激素，影响性特征的发展，在许多生理过程中起着至关重要的作用＼[1＼]。同时它也是一种重要的环境内分泌干扰物，可与共存的雌激素发生协同作用，促使雌激素活性增强＼[2，3＼]。雌二醇在人体的含量与乳腺癌等疾病有很大相关性，即使在很低的浓度下也有毒性或致癌作用＼[4＼]。
目前，雌二醇的检测技术主要分为三类：（1）色谱法，包括高效液相色谱法（HPLC）＼[5，6＼]、液相色谱质谱联用法（LCMS）＼[7，8＼]，以及气相色谱质谱联用法（GCMS）＼[9＼]，色谱法准确、可靠，但需要复杂的仪器，检测成本高，样品预处理复杂费时，衍生化还会造成目标类固醇的损失或降解，因此色谱法难以对大量样品进行快速检测，不能满足现场检测要求； （2）免疫学方法，包括酶联免疫吸附分析法（ELISA）＼[10＼]、化学发光免疫法（CLEIA）＼[11＼]、荧光标记免疫法＼[12＼]等，这类方法基于抗原抗体特异性相互作用从而具有很高的选择性，但因天然抗体稳定性较差，免疫法容易出现假阳性的结果； （3）电化学分析方法＼[13，14＼]，具有分析速度快、易于微型化、操作简便等特点，但该技术多基于对电极表面的修饰，大都存在修饰层稳定性和重现性差、传质和电荷传递速率慢、选择识别能力差等问题。
核酸适配体（Aptamer）是一段体外通过配体指数富集的系统进化（SELEX）技术筛选获得的寡核苷酸片段，可以是RNA 或单链DNA。单链寡核苷酸的一些二级结构，如发夹、茎环结构等，可使核酸分子形成多种三维结构，成为与靶标物质特定区域结合的基础。适配体能与DNA、RNA、蛋白质以及其它小分子靶物质特异性结合，具有亲和力高、特异性强、容易制备及修饰、稳定性好等特性，常被用于制备各种适配体传感器＼[15＼]。
荧光共振能量转移（Fluorescence resonance energy transfer，FRET） ＼[16＼]是指在不同的荧光基团中，若一个荧光基团（供体）的荧光发射光谱与另一个基团（受体）的吸收光谱有一定的重叠，当两个基团间的距离合适时（一般小于10 nm），即可观察到荧光能量由供体向受体转移的现象，即供体荧光猝灭和受体荧光增强。本研究以雌二醇适配体（P1）作为供受体之间的桥联媒介，在适配体的两条互补链（F1和F2）末端分别修饰上羧基荧光素（FAM）和羧基四甲基罗丹明（TAMRA），其中FAM作为荧光供体，TAMRA作为受体，用FRET法检测雌二醇，实验原理如图1所示。当适配体P1不存在时，互补链F1FAM和F2TAMRA游离在溶液中（图1a）；向溶液中加入P1与F1和F2上碱基充分杂交后，FAM和TAMRA距离靠近，发生荧光能量转移（图1b）；再加入目标物雌二醇，雌二醇与P1特异性的结合使F1和F2重新游离出来（图1c），FAM荧光恢复。从而建立一种基于适配体FRET的高灵敏度及选择性的检测方法。
2实验部分
2.1仪器与试剂
F4600型荧光光谱仪（日本日立公司），10 mL石英检测池（Lightpath Optical Ltd.， UK），雷磁PHS3C精密酸度计（上海仪电科学仪器股份有限公司），5804型离心机（德国Eppendorf公司），HH4型数显恒温水浴锅（国华电器有限公司）。
3结果与讨论
3.1FRET现象
当适配体P1不存在时，FAM标记的F1和TAMRA标记的F2链游离在溶液中，在485 nm的激发波长下，只能检测到FAM在520 nm处的荧光（图2a）；向溶液中加入P1充分杂交后，520 nm处FAM的荧光强度降低，同时在580 nm处出现TAMRA明显的发光（图2b）；再加入雌二醇与P1特异性结合后，引起520 nm发射光增强、580 nm发射光降低（图2c）。对照实验显示，雌二醇对FAM没有明显的荧光增强作用
对TAMRA也无明显的淬灭作用，说明FAM荧光增强是由于雌二醇与适配体P1结合导致F1和F2游离出来引起的。鉴于520 nm处的发射光比580 nm处的发光更灵敏，故以520 nm处荧光强度的改变ΔI作为定量依据。
3.2实验条件对发光的影响
3.2.1缓冲溶液的pH值、种类和浓度的影响FAM和TAMRA间能否发生荧光能量转移主要取决于适配体与其互补链的碱基配对，而碱基配对受pH的影响显著，与缓冲介质的种类及浓度也相关
体系为研究对象，探讨上述因素的影响。研究表明，在相同浓度下，与PBS缓冲液、TrisHCl缓冲液、NaHCO3Na2CO3缓冲液相比，在BR缓冲液中荧光信号最强且稳定。改变BR的浓度进行实验，浓度为50 mmol/L 时荧光最强。向体系中加入雌二醇，记录不同pH值下ΔI值，结果表明，pH 7.4时可获得最大的ΔI值。综合以上实验结果，本研究选择pH 7.4的50 mmol/L BR缓冲溶液作为分析底液。
3.2.2核酸浓度的影响
分别测定适配体P1与其互补链F1和F2浓度为5.0×10， 1.0×10 mol/L时体系发光情况。随着核酸浓度增加，F1/F2/P1体系发光强度迅速增加，当核酸浓度高于1.0×10 mol/L时，发光强度增加幅度降低，考虑本底发光强度较大会增大实验误差，且高浓度下碱基错配的几率增大，故选择1.0×10mol/L作为最佳核酸浓度。在此浓度下FAM的发光强度能够满足实验需要，且加入雌二醇溶液后520 nm处荧光改变值ΔI最大。
3.2.3实验温度的影响温度决定核酸链杂交的速率和杂交双链的稳定性。分别记录25， 30， 35， 40， 45， 50和60 ℃下F1/F2/P1/雌二醇体系的荧光强度。随温度升高，荧光呈现先增大后减小的趋势，45 ℃时荧光最强。推测温度不仅影响核酸的构型，同时也影响供体FAM的荧光效率，温度升高FAM荧光效率下降，导致向受体TAMRA转移的能量降低＼[18＼]。因此选择45 ℃作为最佳工作温度。
3.2.4荧光体系的响应时间和稳定性研究
分别考察培养时间对F1/F2/P1体系以及加入雌二醇后发光强度的影响。向F1/F2溶液中加入P1后，在0～15 min内，520 nm处荧光强度随时间逐渐降低，580 nm处荧光强度逐渐增大， 15 min以后荧光几乎不再变化，说明适配体P1与其互补链F1和F2已杂交完全。再向该体系中加入雌二醇，520 nm处荧光增大，4 min后达稳定，说明适配体P1能够快速地识别雌二醇，显示P1与雌二醇之间高的亲和性。实验结果表明，在20 min内能够完成对体系荧光变化的测定。
将含有F1/F2/P1/雌二醇的BR缓冲溶液密封，在4 ℃避光储存，2天后检测，荧光信号没有显著的变化； 5天后，荧光强度下降5.8%，表明此体系具有良好的稳定性，能够弥补不适合现场检测的不足。
另外，对仪器参数也进行了优化，选择光电倍增管高压为700 V，激发和发射狭缝均为10 nm。
3.3雌二醇的线性响应范围和检出限
在最优的实验条件下，检测不同浓度的雌二醇对1.0×10
mol/L的发光体系平行测定5次，结果的相对标准偏差（RSD）小于3.3%。与雌二醇常用检测方法的对比结果（表1）表明，本方法将适配体的特异性识别与FRET技术结合，具有较高的灵敏度和分析效率。mol/L雌二醇的发光体系， 当控制荧光强度变化在±5%以内，1000倍的CaCl2， MgCl2， KH2PO4， Na2SO4， NaCl， KNO3和NH4Cl，450倍的肌酸酐、葡萄糖、果糖，300倍的尿素、L酪氨酸、L组氨酸、L赖氨酸、L缬氨酸、甘氨酸，200倍的尿酸、抗坏血酸，50倍的Al3+、Fe3+（50倍），25倍的Pb2+、Cd2+、Ni2+、Hg2+对体系没有干扰。重金属离子对该发光体系的干扰稍大，推测重金属离子与核酸结合后，使核酸构型改变，单链结构发生折叠，阻碍适配体与互补链碱基配对，引起FAM与TAMRA之间距离改变，不利于两者之间荧光能量转移。实际样品中重金属离子含量远低于实验所用浓度。因此，本方法具有较好的选择性和抗干扰能力。
3.5实际样品分析
将本方法用于人体尿液中雌二醇含量的检测，样品取自5名志愿者，未经任何前处理直接检测，每个样品平行测定3次取其平均值，结果在5.9×10
Symbolm@@ 10 mol/L之间，均在正常值范围内，如表2所示，在每个样品中加入雌二醇进行精密度和回收率实验，平行测定5次，相对标准偏差（RSD）为3.3%～6.7%， 回收率为94.0%～103.5%。由此可见，本方法具有较高的准确度和精密度，适合实际样品分析。4结论
本研究利用核酸适配体对目标分子特定的识别能力，结合荧光共振能量转移法测定雌二醇，实验表明，本方法能够抵抗高浓度无机盐、糖类、氨基酸、尿酸等生理体系中共存物质的干扰，具有较高的灵敏度、选择性、重现性以及稳定性，适合实际样品分析，为小分子检测提供了一种新思路。
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18Liu H L， Wang Y H， Shen A G， Zhou X D， Hu J M. Talanta， 2012， 93（15）： 330-335
AbstractA highly sensitive fluorescence spectroscopic method was established for the selective determination of estradiol， which took advantages of the excellent molecular recognition capability of aptamer and the energy transfer between the specific fluorescent groups. The effects of the pH value， buffer constituent and concentration， the concentration of DNA， the experimental temperature and response time on the detection of estradiol were studied. Under the optimal conditions （50 mmol/L BR buffer solution with pH value at 7.4， 1.0×10 7 mol/L for each DNA strand， incubation at 45 ℃， response time 19 min）， the change of the fluorescence intensity （ΔI） versus the logarithm of the concentration of estradiol （lgC） was linear over a concentration range from 1.0×10
mol/L with good linear correlation （r=0.9953）. The limit of detection （LOD） was found to be 6.0×10mol/L （S/N=3）. This method was successfully applied to the detection of estradiol in human urine， with the recovery in the range of 94.0%-103.5%. This method showed good precision and accuracy.
KeywordsAptamer； Fluorescence resonance energy transfer； Estradiol
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mol/L with good linear correlation （r=0.9953）. The limit of detection （LOD） was found to be 6.0×10mol/L （S/N=3）. This method was successfully applied to the detection of estradiol in human urine， with the recovery in the range of 94.0%-103.5%. This method showed good precision and accuracy.
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mol/L with good linear correlation （r=0.9953）. The limit of detection （LOD） was found to be 6.0×10mol/L （S/N=3）. This method was successfully applied to the detection of estradiol in human urine， with the recovery in the range of 94.0%-103.5%. This method showed good precision and accuracy.
KeywordsAptamer； Fluorescence resonance energy transfer； Estradiol
