共轭聚合物荧光“开关”的构建及对S腺苷甲硫氨酸的分子识别与检测
李慧芝等
1引言
细胞内的甲基化反应存在通用甲基供体S腺苷甲硫氨酸（SAdenosylmethionine，AdoMet，SAM），SAM含有活性甲基，细胞内几乎所有用于甲基化修饰的甲基都来自SAM甲硫高能键。由于甲基化反应的广泛性，SAM是细胞内参加反应的重要性仅次于ATP的一种辅酶。细胞内SAM浓度的微小改变，便会对细胞的生长、分化和功能产生重大影响＼[1＼]。因此，实现快速、灵敏、准确地检测SAM具有重要意义。
目前，已报道的测定SAM的方法有电化学法＼[2＼]、HPLC法＼[3，4＼]和分光光度法＼[5＼]。光度法依赖甲基转移酶、S腺苷高半胱氨酸核苷酶和S核糖基高半胱氨酸酶的催化作用，将SAM分解为高半胱氨酸，再对高半胱氨酸显色反应，操作比较繁琐，准确度也不理想。荧光光度法具有操作简单、灵敏度高、选择性好等特点，作为荧光传感器的有小分子＼[6，7＼]、聚合物＼[8，9＼]、量子点＼[10＼]等。近年来，基于荧光试剂和分析物质之间竞争作用使荧光试剂的荧光恢复得到较多关注＼[11，12＼]。水溶性荧光共轭聚合物＼[13，14＼]作为一类新型荧光传感材料，具有摩尔吸光系数大、荧光量子产率高等优点，还具有“分子导线”的功能，能够使荧光信号放大，常用于生物大分子和生物小分子的检测＼[15，16＼]。
本研究采用的水溶性阳离子共轭聚合物聚3（1（2三乙胺乙酰基）哌啶4亚甲基）噻吩 （poly 3{＼[1（2hydrazino2oxoethyl）piperidin4ylidene＼]methyl}thiophene，PMTH），是具有优良光电性能的荧光材料＼[17，18＼]。研究表明， Pb2+对PMTH荧光猝灭具有特异性，当体系存在SAM时，SAM与Pb2+的配位作用很强，使PMTH从Pb2+PMTH配合物中被置换出来，PMTH的荧光性能又恢复，开启了PMTH的“开关”荧光信号。本方法可以直接检测SAM，不需要酶催化。
3.4pH值的影响
由于SAM结构中有羟基、氨基和羧基，所以受体系pH值影响较大。实验表明，pH≤4.5时，即在比较强酸性条件下，SAM与Pb2+很难形成配合物；pH>4.5时，SAM与Pb2+可以形成配合物； pH>8.5时，Cu2+有干扰；pH=4.5～9.0之间Pb2+与SAM以1∶1的比例形成配合物。考察了Pb2+与PMTH反应的pH值范围，结果表明， pH=5.6～8.2时荧光强度达到最大，而且稳定，根据体系中两个反应情况，选择加入1.0 mL pH=7.2 TrisHCl缓冲溶液。
3.5孵育时间和温度对荧光恢复的影响
当所有的试剂都加入后，荧光强度恢复程度逐渐增大，在室温下孵育10 min，荧光强度恢复程度达到最大且稳定，且在5 h内荧光强度相对稳定，所以测定要在5 h内完成。温度升高， 孵育的时间缩短，但稳定的时间也相对缩短，提高温度不能提高体系的灵敏度，所以本实验采用在室温条件下孵育10 min。
4结论
合成了一种水溶性共轭聚噻吩衍生物PMTH，通过对Pb2+与PMTH互相作用的荧光光谱的研究，考察了Pb2+对PMTH的荧光猝灭性能。在Pb2+PMTH的体系中加入SAM后，由于SAM与Pb2+的配位能力更强， SAM可与Pb2+形成配合物，将Pb2+从PMTH链上置换出来，使PMTH的荧光强度恢复，恢复的荧
光强度与SAM的浓度在一定范围内呈良好的线性关系。通过PMTH的荧光开关信号，成功建立了识别和检测SAM的新方法。本方法具有高灵敏、高选择性， 可简便快速、无标记检测SAM，并成功用于人血清、尿液及针剂样品中SAM的检测。
3Jakub K， Alena D， Viktor K. J. Chromatogr. B， 2009， 877（22）： 2061-2066
4She Q B， Nagao I， Hayakawa T， Tsuge H. Biochem. Biophys. Res. Commun.， 1994， 205（30）： 1748-1754
5GU JinSong， TAN XiaoJun. Chem. J. Chinese Universities， 2012， 33（3）： 521-525
谷劲松， 谭晓军. 高等学校化学学报， 2012， 33（3）： 521-525
6Li C Y， Xu F， Li Y F， Zhou K， Zhou Y. Anal. Chim. Acta， 2012， 717： 122-126
7ZHANG Hao， LIU Chuanzhi， XU Ying， GUO Yuan， SONG Yu， YU YuanHua. Chinese J. Anal. Chem.， 2014， 42（1）： 104-108
张 昊， 刘传志， 徐 影， 郭 元， 宋 禹， 于源华. 分析化学， 2014， 42（1）： 104-108
8Ho H A， Leclerc M. J. Am. Chem. Soc.， 2004， 126（5）： 1384-1387
9Miranda O R， You C， Philips R. J. Am. Chem. Soc.， 2007， 129（32）： 9856-9857
10ZHENG HuZhi， BAI WenJun， LONG YiJuan， GAO Mei， ZHANG LingYan. Scientia Sinica Chimica， 2011， 41（6）： 1031-1036
郑鹄志， 白文君， 隆异娟， 高 梅， 张凌燕. 中国科学： 化学， 2011， 41（6）： 1031-1036
11Yin C X， Gao F， Huo F J， Yang P. Chem. Commun.， 2004， 8： 934-935
12Huo F J， Sun Y Q， Su J， Chao J B， Zhi H J， Yin C X. Org. Lett.， 2009， 11（21）： 4918-4921
13Lou X， Zhang L， Qin J， Li Z. Langmuir， 2010， 26： 1566-1569
14CHEN YanGuo， XU BaoMing， HE ZhiKe， XIE WeiHong. Acta Chimica Sinica.， 2011， 69（ 11）： 1361-1365
陈彦国， 徐保明， 何治柯， 谢卫红. 化学学报， 2011， 69（ 11）： 1361-1365
15Fan H L， Jiang X H， Zhang T， Jin Q H. J. Biosens. Bioelectron.， 2012， 34（1）： 221-227
16An L L， Tang Y， Feng F. J. Mater. Chem， 2007， 17（39）： 4147-4152
17An L L， Liu L B， Wang S. Biomacromolecules， 2009， 10： 454-460
18LIU LuLin， SONG WenLi， ZHANG ZhiYong. Acta Polymerica Sinica， 2011， （7）： 724-729
柳露林， 宋文利， 张志勇. 高分子学报， 2011， （7）： 724-729
19Wang X Y， Zhao J J， Guo C X， Pei M S， Zhang G G. Sensor. Actuat. B， 2014， 193： 157-165
AbstractA novel fluorescent switch was constructed based on poly 3{[1（2hydrazino2oxoethyl） piperidin4ylidene]methyl}thiophene （PMTH） in the presence of Pb2+ or Sadenosylmethionine （SAM）. The switch turned off in the presence of Pb2+owing to complex effect， and the fluorescence intensity of PMTH solution was efficiently quenched by Pb2+ ions. Upon adding SAM to the Pb2+PMTH solution， which was stronger Pb2+ chelators， it could form more stable SAMPb2+， the Pb2+ ion was displaced from PMTH and the fluorescence of PMTH was recovered. By triggering the "turnon" signal of PMTH， a new discrimination ability toward SAM method for the determination of SAM was established. The effects of the interaction on the fluorescence spectral
Symbolm@@ 9 mol/L. The system was successfully applied for detecting SAM in human serum， urine and injection samples.
KeywordsConjugated polymers； Fluorescence switch； Molecular recognition； SAdenosylmethionine； Lead ions
11Yin C X， Gao F， Huo F J， Yang P. Chem. Commun.， 2004， 8： 934-935
12Huo F J， Sun Y Q， Su J， Chao J B， Zhi H J， Yin C X. Org. Lett.， 2009， 11（21）： 4918-4921
13Lou X， Zhang L， Qin J， Li Z. Langmuir， 2010， 26： 1566-1569
14CHEN YanGuo， XU BaoMing， HE ZhiKe， XIE WeiHong. Acta Chimica Sinica.， 2011， 69（ 11）： 1361-1365
陈彦国， 徐保明， 何治柯， 谢卫红. 化学学报， 2011， 69（ 11）： 1361-1365
15Fan H L， Jiang X H， Zhang T， Jin Q H. J. Biosens. Bioelectron.， 2012， 34（1）： 221-227
16An L L， Tang Y， Feng F. J. Mater. Chem， 2007， 17（39）： 4147-4152
17An L L， Liu L B， Wang S. Biomacromolecules， 2009， 10： 454-460
18LIU LuLin， SONG WenLi， ZHANG ZhiYong. Acta Polymerica Sinica， 2011， （7）： 724-729
柳露林， 宋文利， 张志勇. 高分子学报， 2011， （7）： 724-729
19Wang X Y， Zhao J J， Guo C X， Pei M S， Zhang G G. Sensor. Actuat. B， 2014， 193： 157-165
AbstractA novel fluorescent switch was constructed based on poly 3{[1（2hydrazino2oxoethyl） piperidin4ylidene]methyl}thiophene （PMTH） in the presence of Pb2+ or Sadenosylmethionine （SAM）. The switch turned off in the presence of Pb2+owing to complex effect， and the fluorescence intensity of PMTH solution was efficiently quenched by Pb2+ ions. Upon adding SAM to the Pb2+PMTH solution， which was stronger Pb2+ chelators， it could form more stable SAMPb2+， the Pb2+ ion was displaced from PMTH and the fluorescence of PMTH was recovered. By triggering the "turnon" signal of PMTH， a new discrimination ability toward SAM method for the determination of SAM was established. The effects of the interaction on the fluorescence spectral
Symbolm@@ 9 mol/L. The system was successfully applied for detecting SAM in human serum， urine and injection samples.
KeywordsConjugated polymers； Fluorescence switch； Molecular recognition； SAdenosylmethionine； Lead ions
11Yin C X， Gao F， Huo F J， Yang P. Chem. Commun.， 2004， 8： 934-935
12Huo F J， Sun Y Q， Su J， Chao J B， Zhi H J， Yin C X. Org. Lett.， 2009， 11（21）： 4918-4921
13Lou X， Zhang L， Qin J， Li Z. Langmuir， 2010， 26： 1566-1569
14CHEN YanGuo， XU BaoMing， HE ZhiKe， XIE WeiHong. Acta Chimica Sinica.， 2011， 69（ 11）： 1361-1365
陈彦国， 徐保明， 何治柯， 谢卫红. 化学学报， 2011， 69（ 11）： 1361-1365
15Fan H L， Jiang X H， Zhang T， Jin Q H. J. Biosens. Bioelectron.， 2012， 34（1）： 221-227
16An L L， Tang Y， Feng F. J. Mater. Chem， 2007， 17（39）： 4147-4152
17An L L， Liu L B， Wang S. Biomacromolecules， 2009， 10： 454-460
18LIU LuLin， SONG WenLi， ZHANG ZhiYong. Acta Polymerica Sinica， 2011， （7）： 724-729
柳露林， 宋文利， 张志勇. 高分子学报， 2011， （7）： 724-729
19Wang X Y， Zhao J J， Guo C X， Pei M S， Zhang G G. Sensor. Actuat. B， 2014， 193： 157-165
AbstractA novel fluorescent switch was constructed based on poly 3{[1（2hydrazino2oxoethyl） piperidin4ylidene]methyl}thiophene （PMTH） in the presence of Pb2+ or Sadenosylmethionine （SAM）. The switch turned off in the presence of Pb2+owing to complex effect， and the fluorescence intensity of PMTH solution was efficiently quenched by Pb2+ ions. Upon adding SAM to the Pb2+PMTH solution， which was stronger Pb2+ chelators， it could form more stable SAMPb2+， the Pb2+ ion was displaced from PMTH and the fluorescence of PMTH was recovered. By triggering the "turnon" signal of PMTH， a new discrimination ability toward SAM method for the determination of SAM was established. The effects of the interaction on the fluorescence spectral
Symbolm@@ 9 mol/L. The system was successfully applied for detecting SAM in human serum， urine and injection samples.
KeywordsConjugated polymers； Fluorescence switch； Molecular recognition； SAdenosylmethionine； Lead ions
1引言
细胞内的甲基化反应存在通用甲基供体S腺苷甲硫氨酸（SAdenosylmethionine，AdoMet，SAM），SAM含有活性甲基，细胞内几乎所有用于甲基化修饰的甲基都来自SAM甲硫高能键。由于甲基化反应的广泛性，SAM是细胞内参加反应的重要性仅次于ATP的一种辅酶。细胞内SAM浓度的微小改变，便会对细胞的生长、分化和功能产生重大影响＼[1＼]。因此，实现快速、灵敏、准确地检测SAM具有重要意义。
目前，已报道的测定SAM的方法有电化学法＼[2＼]、HPLC法＼[3，4＼]和分光光度法＼[5＼]。光度法依赖甲基转移酶、S腺苷高半胱氨酸核苷酶和S核糖基高半胱氨酸酶的催化作用，将SAM分解为高半胱氨酸，再对高半胱氨酸显色反应，操作比较繁琐，准确度也不理想。荧光光度法具有操作简单、灵敏度高、选择性好等特点，作为荧光传感器的有小分子＼[6，7＼]、聚合物＼[8，9＼]、量子点＼[10＼]等。近年来，基于荧光试剂和分析物质之间竞争作用使荧光试剂的荧光恢复得到较多关注＼[11，12＼]。水溶性荧光共轭聚合物＼[13，14＼]作为一类新型荧光传感材料，具有摩尔吸光系数大、荧光量子产率高等优点，还具有“分子导线”的功能，能够使荧光信号放大，常用于生物大分子和生物小分子的检测＼[15，16＼]。
本研究采用的水溶性阳离子共轭聚合物聚3（1（2三乙胺乙酰基）哌啶4亚甲基）噻吩 （poly 3{＼[1（2hydrazino2oxoethyl）piperidin4ylidene＼]methyl}thiophene，PMTH），是具有优良光电性能的荧光材料＼[17，18＼]。研究表明， Pb2+对PMTH荧光猝灭具有特异性，当体系存在SAM时，SAM与Pb2+的配位作用很强，使PMTH从Pb2+PMTH配合物中被置换出来，PMTH的荧光性能又恢复，开启了PMTH的“开关”荧光信号。本方法可以直接检测SAM，不需要酶催化。
3.4pH值的影响
由于SAM结构中有羟基、氨基和羧基，所以受体系pH值影响较大。实验表明，pH≤4.5时，即在比较强酸性条件下，SAM与Pb2+很难形成配合物；pH>4.5时，SAM与Pb2+可以形成配合物； pH>8.5时，Cu2+有干扰；pH=4.5～9.0之间Pb2+与SAM以1∶1的比例形成配合物。考察了Pb2+与PMTH反应的pH值范围，结果表明， pH=5.6～8.2时荧光强度达到最大，而且稳定，根据体系中两个反应情况，选择加入1.0 mL pH=7.2 TrisHCl缓冲溶液。
3.5孵育时间和温度对荧光恢复的影响
当所有的试剂都加入后，荧光强度恢复程度逐渐增大，在室温下孵育10 min，荧光强度恢复程度达到最大且稳定，且在5 h内荧光强度相对稳定，所以测定要在5 h内完成。温度升高， 孵育的时间缩短，但稳定的时间也相对缩短，提高温度不能提高体系的灵敏度，所以本实验采用在室温条件下孵育10 min。
4结论
合成了一种水溶性共轭聚噻吩衍生物PMTH，通过对Pb2+与PMTH互相作用的荧光光谱的研究，考察了Pb2+对PMTH的荧光猝灭性能。在Pb2+PMTH的体系中加入SAM后，由于SAM与Pb2+的配位能力更强， SAM可与Pb2+形成配合物，将Pb2+从PMTH链上置换出来，使PMTH的荧光强度恢复，恢复的荧
光强度与SAM的浓度在一定范围内呈良好的线性关系。通过PMTH的荧光开关信号，成功建立了识别和检测SAM的新方法。本方法具有高灵敏、高选择性， 可简便快速、无标记检测SAM，并成功用于人血清、尿液及针剂样品中SAM的检测。
3Jakub K， Alena D， Viktor K. J. Chromatogr. B， 2009， 877（22）： 2061-2066
4She Q B， Nagao I， Hayakawa T， Tsuge H. Biochem. Biophys. Res. Commun.， 1994， 205（30）： 1748-1754
5GU JinSong， TAN XiaoJun. Chem. J. Chinese Universities， 2012， 33（3）： 521-525
谷劲松， 谭晓军. 高等学校化学学报， 2012， 33（3）： 521-525
6Li C Y， Xu F， Li Y F， Zhou K， Zhou Y. Anal. Chim. Acta， 2012， 717： 122-126
7ZHANG Hao， LIU Chuanzhi， XU Ying， GUO Yuan， SONG Yu， YU YuanHua. Chinese J. Anal. Chem.， 2014， 42（1）： 104-108
张 昊， 刘传志， 徐 影， 郭 元， 宋 禹， 于源华. 分析化学， 2014， 42（1）： 104-108
8Ho H A， Leclerc M. J. Am. Chem. Soc.， 2004， 126（5）： 1384-1387
9Miranda O R， You C， Philips R. J. Am. Chem. Soc.， 2007， 129（32）： 9856-9857
10ZHENG HuZhi， BAI WenJun， LONG YiJuan， GAO Mei， ZHANG LingYan. Scientia Sinica Chimica， 2011， 41（6）： 1031-1036
郑鹄志， 白文君， 隆异娟， 高 梅， 张凌燕. 中国科学： 化学， 2011， 41（6）： 1031-1036
11Yin C X， Gao F， Huo F J， Yang P. Chem. Commun.， 2004， 8： 934-935
12Huo F J， Sun Y Q， Su J， Chao J B， Zhi H J， Yin C X. Org. Lett.， 2009， 11（21）： 4918-4921
13Lou X， Zhang L， Qin J， Li Z. Langmuir， 2010， 26： 1566-1569
14CHEN YanGuo， XU BaoMing， HE ZhiKe， XIE WeiHong. Acta Chimica Sinica.， 2011， 69（ 11）： 1361-1365
陈彦国， 徐保明， 何治柯， 谢卫红. 化学学报， 2011， 69（ 11）： 1361-1365
15Fan H L， Jiang X H， Zhang T， Jin Q H. J. Biosens. Bioelectron.， 2012， 34（1）： 221-227
16An L L， Tang Y， Feng F. J. Mater. Chem， 2007， 17（39）： 4147-4152
17An L L， Liu L B， Wang S. Biomacromolecules， 2009， 10： 454-460
18LIU LuLin， SONG WenLi， ZHANG ZhiYong. Acta Polymerica Sinica， 2011， （7）： 724-729
柳露林， 宋文利， 张志勇. 高分子学报， 2011， （7）： 724-729
19Wang X Y， Zhao J J， Guo C X， Pei M S， Zhang G G. Sensor. Actuat. B， 2014， 193： 157-165
AbstractA novel fluorescent switch was constructed based on poly 3{[1（2hydrazino2oxoethyl） piperidin4ylidene]methyl}thiophene （PMTH） in the presence of Pb2+ or Sadenosylmethionine （SAM）. The switch turned off in the presence of Pb2+owing to complex effect， and the fluorescence intensity of PMTH solution was efficiently quenched by Pb2+ ions. Upon adding SAM to the Pb2+PMTH solution， which was stronger Pb2+ chelators， it could form more stable SAMPb2+， the Pb2+ ion was displaced from PMTH and the fluorescence of PMTH was recovered. By triggering the "turnon" signal of PMTH， a new discrimination ability toward SAM method for the determination of SAM was established. The effects of the interaction on the fluorescence spectral
Symbolm@@ 9 mol/L. The system was successfully applied for detecting SAM in human serum， urine and injection samples.
KeywordsConjugated polymers； Fluorescence switch； Molecular recognition； SAdenosylmethionine； Lead ions
11Yin C X， Gao F， Huo F J， Yang P. Chem. Commun.， 2004， 8： 934-935
12Huo F J， Sun Y Q， Su J， Chao J B， Zhi H J， Yin C X. Org. Lett.， 2009， 11（21）： 4918-4921
13Lou X， Zhang L， Qin J， Li Z. Langmuir， 2010， 26： 1566-1569
14CHEN YanGuo， XU BaoMing， HE ZhiKe， XIE WeiHong. Acta Chimica Sinica.， 2011， 69（ 11）： 1361-1365
陈彦国， 徐保明， 何治柯， 谢卫红. 化学学报， 2011， 69（ 11）： 1361-1365
15Fan H L， Jiang X H， Zhang T， Jin Q H. J. Biosens. Bioelectron.， 2012， 34（1）： 221-227
16An L L， Tang Y， Feng F. J. Mater. Chem， 2007， 17（39）： 4147-4152
17An L L， Liu L B， Wang S. Biomacromolecules， 2009， 10： 454-460
18LIU LuLin， SONG WenLi， ZHANG ZhiYong. Acta Polymerica Sinica， 2011， （7）： 724-729
柳露林， 宋文利， 张志勇. 高分子学报， 2011， （7）： 724-729
19Wang X Y， Zhao J J， Guo C X， Pei M S， Zhang G G. Sensor. Actuat. B， 2014， 193： 157-165
AbstractA novel fluorescent switch was constructed based on poly 3{[1（2hydrazino2oxoethyl） piperidin4ylidene]methyl}thiophene （PMTH） in the presence of Pb2+ or Sadenosylmethionine （SAM）. The switch turned off in the presence of Pb2+owing to complex effect， and the fluorescence intensity of PMTH solution was efficiently quenched by Pb2+ ions. Upon adding SAM to the Pb2+PMTH solution， which was stronger Pb2+ chelators， it could form more stable SAMPb2+， the Pb2+ ion was displaced from PMTH and the fluorescence of PMTH was recovered. By triggering the "turnon" signal of PMTH， a new discrimination ability toward SAM method for the determination of SAM was established. The effects of the interaction on the fluorescence spectral
Symbolm@@ 9 mol/L. The system was successfully applied for detecting SAM in human serum， urine and injection samples.
KeywordsConjugated polymers； Fluorescence switch； Molecular recognition； SAdenosylmethionine； Lead ions
11Yin C X， Gao F， Huo F J， Yang P. Chem. Commun.， 2004， 8： 934-935
12Huo F J， Sun Y Q， Su J， Chao J B， Zhi H J， Yin C X. Org. Lett.， 2009， 11（21）： 4918-4921
13Lou X， Zhang L， Qin J， Li Z. Langmuir， 2010， 26： 1566-1569
14CHEN YanGuo， XU BaoMing， HE ZhiKe， XIE WeiHong. Acta Chimica Sinica.， 2011， 69（ 11）： 1361-1365
陈彦国， 徐保明， 何治柯， 谢卫红. 化学学报， 2011， 69（ 11）： 1361-1365
15Fan H L， Jiang X H， Zhang T， Jin Q H. J. Biosens. Bioelectron.， 2012， 34（1）： 221-227
16An L L， Tang Y， Feng F. J. Mater. Chem， 2007， 17（39）： 4147-4152
17An L L， Liu L B， Wang S. Biomacromolecules， 2009， 10： 454-460
18LIU LuLin， SONG WenLi， ZHANG ZhiYong. Acta Polymerica Sinica， 2011， （7）： 724-729
柳露林， 宋文利， 张志勇. 高分子学报， 2011， （7）： 724-729
19Wang X Y， Zhao J J， Guo C X， Pei M S， Zhang G G. Sensor. Actuat. B， 2014， 193： 157-165
AbstractA novel fluorescent switch was constructed based on poly 3{[1（2hydrazino2oxoethyl） piperidin4ylidene]methyl}thiophene （PMTH） in the presence of Pb2+ or Sadenosylmethionine （SAM）. The switch turned off in the presence of Pb2+owing to complex effect， and the fluorescence intensity of PMTH solution was efficiently quenched by Pb2+ ions. Upon adding SAM to the Pb2+PMTH solution， which was stronger Pb2+ chelators， it could form more stable SAMPb2+， the Pb2+ ion was displaced from PMTH and the fluorescence of PMTH was recovered. By triggering the "turnon" signal of PMTH， a new discrimination ability toward SAM method for the determination of SAM was established. The effects of the interaction on the fluorescence spectral
Symbolm@@ 9 mol/L. The system was successfully applied for detecting SAM in human serum， urine and injection samples.
KeywordsConjugated polymers； Fluorescence switch； Molecular recognition； SAdenosylmethionine； Lead ions
