杂质延迟法去除液相系统中全氟辛酸的干扰
张秀蓝+郭婧+李玲玲+董亮+史双昕+张利飞
摘 要 建立了高效液相色谱 串联质谱法（HPLC MS/MS）对水体中7种全氟烷基酸（C4～C10）和全氟辛烷磺酸的分析方法。水样抽滤除去颗粒物杂质，加入回收率指示物，再使用WAX固相萃取柱富集和净化，提取液浓缩后，使用HPLC/MS/MS分析检测。仪器分析过程中，由于液相系统无法避免含氟材料的使用，引入了较高的全氟辛酸（PFOA）污染。本研究使用杂质延迟法实现了液相系统中PFOA和样品中PFOA的分离。在系统干扰去除后，水体中PFOA的方法检出限降低为0.8 ng/L（取样量500 mL）， 最低定量浓度为3.2 ng/L；其它目标物的方法检出限为0.2～1.2 ng/L， 最低定量浓度为0.8～4.8 ng/L。本方法具有良好的重现性，6次平行样品测定中各检出化合物的相对标准偏差（RSD）均小于16%， 6次基体加标实验中各目标物的回收率为87%～129%， RSD<15%。杂质延迟法有效的去除了系统干扰，降低了方法检出限，提高了方法精密度。
关键词 水； 全氟辛酸； 全氟化合物； 杂质延迟法； 干扰去除
1 引 言
全氟化合物（PFCs）开始生产和使用于上世纪四、五十年代，由于其疏油、疏水的特性被广泛应用于纺织、造纸、食品包装、地毯、皮革、洗发香波和灭火泡沫等工业和民用行业[1～5]。由于C8的全氟辛基磺酸盐（PFOS）及其盐类和全氟辛酸（PFOA）的毒性， PFOS及其盐和全氟辛基磺酰氟被正式列入持久性有机污染物名单附件B加以限制[3]。目前，PFOA和PFOS在水体、土壤、沉积物、生物体，甚至人体血液和母乳中均有不同程度的检出[2～7]。2006年12月欧洲议会发布限制销售和使用PFOS的法令[8]。美国明尼苏达州规定了饮用水中PFOA和PFOS的最大允许浓度分别为0.4和0.2 μg/L[9]，新泽西州则将PFOA的非致癌限量定为0.04 μg/L[10]。作为斯德哥尔摩公约缔约国，我国对PFOS和PFOA的关注也逐渐增加。
然而， 在水环境PFCs的监测中，空白控制一直是最棘手的问题之一。存在两个原因： 样品采集和前处理过程中引入的空白干扰，可通过更换器皿材质（聚丙烯）和使用前溶剂清洗（甲醇）等方式去除[11，12]；仪器分析过程中引入的干扰，液相（LC）系统流路中无法避免含氟聚合物的使用（如脱气机等），这部分干扰无法直接去除。为保证测定结果的可靠性，国际标准化组织出台的标准ISO 25101（2009）[11]和美国环保署出台的EPA Method 573（2009）[12]均明确指出分析过程中引入的背景干扰不得高于测定值的1/10， 这就要求对仪器背景进行控制。为降低仪器分析带来的背景干扰，得到准确的数据结果，本研究利用杂质延迟法去除了HPLC系统中PFOA的干扰，并建立了水中多种全氟化合物的分析方法。
2 实验部分
2.1 仪器和与试剂
QQQ 6410高效液相色谱 串联质谱仪（HPLC/MS/MS， 美国Agilent公司）。
标准品全氟丁酸PFBA（98%），全氟戊酸PFPA（97%）， 全氟己酸PFHxA（96%），全氟庚酸PFHpA（99%）， 全氟辛酸PFOA（96%）， 全氟壬酸PFNA（97%）， 全氟癸酸PFDA（98%），均购自美国Sigma Alorich公司； 全氟辛烷磺酸PFOS（99%，德国Dr. Ehrenstorfer GmbH公司；碳标记同位素： 进样内标13C2 PFOA标准溶液（M2PFOA， 50 mg/L， 甲醇）， 回收率指示物13C8 PFOA标准溶液（M8PFOA， 50 mg/L，甲醇）和13C4 PFOS标准溶液（MPFOS， 50 mg/L，甲醇）均购自美国Wellington Laboratories公司。有机溶剂乙腈 （CH3CN）、甲醇（CH3OH）、乙酸（CH3COOH），均为HPLC级（美国J.T.Baker公司）；乙酸铵（CH3COONH4，HPLC级， 韩国DUKSAN公司）；氨水（50%， HPLC级， 美国Alfa Aesar公司）。
2.2 样品前处理
量取水样500 mL，经过0.7 μm石英纤维膜过滤，去除水中颗粒物。加入回收率指示物（M8PFOA， MPFOS，10.0 ng），老化30 min。然后将样品以3～5 mL/min流速通过经过预处理后的WAX柱（WAX小柱的预处理： 依次用6 mL 0.5%氨水 甲醇、甲醇和高纯水淋洗）。样品完全通过WAX小柱后，使用6 mL pH=4.0 的醋酸铵（0.25 mmol/L）缓冲溶液淋洗小柱， 再加入高纯水清洗小柱。干燥10 min后， 加入3 mL甲醇去除杂质， 使用8 mL 0.5% 氨水 甲醇淋洗得到目标物。氮吹浓缩淋洗液小于0.5 mL，加入内标指示物（10.0 ng）和500 μL高纯水， 使用甲醇定容至1.0 mL， 4 ℃保存， 待测。
2.3 色谱条件
ZORBAX XDB C18分析柱（50 mm × 4.6 mm × 1.8 μm）；延迟柱：与分析柱相同， 串联在阻尼器和进样针之间； 分析柱温度：30 ℃； 流动相流速： 0.30 mL/min； A相乙腈， B相10 mmol/L醋酸铵溶液。梯度洗脱： 0～5 min， 70% B； 5～8 min， 70%～25% B； 9～12 min， 0% B； 12～20 min， 70% B。进样体积： 5.0 μL。
2.4 质谱条件
离子源：电喷雾离子源（ESI
；检测方式：多级反应监测（MRM）；干燥气流速：480 L/h；干燥气温度：350 ℃；毛细管电压：4000 eV；定量离子对、碰撞气能量和碰撞能见表1，标准溶液色谱图见图1。
3 结果与讨论
3.1 延迟柱的选择
由于LC系统中无法避免含氟聚合物的使用，可引入较高的PFOA假阳性污染。实验表明，在LC系统更换了一台新的脱气机后，仪器测定发现甲醇中有较高的PFOA，约5 ng/mL（见图2A）。为判断干扰来源，分别将10 mL甲醇和乙腈浓缩，结果显示污染不随溶剂浓缩发生变化，推断干扰来自于LC系统。流动相将LC系统中的PFOA溶出并带到检测器， 且系统背景对样品分析有固定的干扰：在梯度洗脱过程中，当液相为初始状态水相比例较大时，色谱柱对LC系统中的PFOA的吸附过程为主要过程； 随着有机相增加，吸附过程减弱，解析过程不断加强； 当有机相达到一定比例后，解析过程为主要过程，最终实现LC系统中的PFOA的被周期性检出，造成假阳性干扰（图2A和2B）。
在LC系统二元泵和进样针之间串联延迟柱就是利用了色谱柱对系统中干扰物能够捕集并释放的原理。该方法被应用于邻苯二甲酸酯的分析过程[13]。本研究在LC系统二元泵和进样针之间串联了1支与分析柱相同的色谱柱作为延迟柱。样品的分析过程为： 进样前， LC系统进样针之前被流动相溶出的PFOA在延迟柱顶端被吸附； 进样后， 延迟柱首先捕集再释放系统中的PFOA， 再进入分析柱，最后进入检测器。与此同时， 样品中PFOA直接通过分析柱进入检测器。由于延迟柱与分析柱完全一致，在忽略LC系统的延迟体积的情况下，可以认为当杂质峰抵达分析柱时，样品中的PFOA已进入检测器。因此， 杂质的出峰时间将比样品出峰时间长出分析柱的死时间（约为1.2 min， 详见图2D）。
在实际样品分析的过程中， LC系统的延迟体积越大， 系统平衡需要的时间越长，即样品分析的时间越长。因此， 在能够达到目标物分离条件下，建议使用柱体积较小的延迟柱。若使用与分析柱相同规格、粒径和径宽的色谱柱可根据液相理论知识推算延迟柱的长度。对比图1串联延迟柱前后空白溶液和标准溶液中PFOA的变化可知， 若要实现目标物和背景干扰的分离， 需满足公式（3）：
其中，N为柱效，t为目标物出峰时间，W为目标物峰宽， t1为目标物在分析柱的出峰时间， t2为串联延迟柱后样品中目标物的出峰时间， t0为延迟柱死时间， t杂为增加延迟柱后杂质峰出峰时间， W杂 为串联杂质峰后杂质的半峰宽。根据公式（1）可知，当延迟柱的填料规格、粒径和以及色谱柱直径一致时，延迟柱和分析柱的长度比值为柱效比值， 同时也是某一目标物保留时间或峰宽比值的平方。设分析柱长为1，延迟柱长为X， 则公式（3）变形为：
实验可测得t1， t0和W， 进而计算得到满足公式（4）的最小X值。根据上述公式计算推断， 在色谱柱填料规格、粒径和径宽相同的条件下， 延迟柱长度需大于分析柱的0.6，才能实现目标物与系统干扰分离。
3.2 全程序空白和方法检出限
在串联延迟柱后，样品的全程序空白得到了较好的控制， 6次平行测定中PFOA的浓度均不高于0.2 ng/L， 但仍不可避免有微量的FPNA和PFDA的检出， 浓度分别为0.22和0.16 ng/L。
根据全程序空白低浓度加标平行样（6次平行）3倍标准偏差（s）计算方法的检出限。实验步骤如2.2节所述， 准确量取高纯水500 mL， 加入标准物质各0/5 ng（即1/0 ng/L）和回收率指示物（MPFOS和M8PFOA），经WAX小柱富集净化，淋洗液浓缩定容至1 mL，仪器分析前加入内标指示物。检出限和最低定量浓度计算依据为： 检出限=2.57s （n=6， a=0.05时， t=2.57）； 最低定量浓度=4s。 6次低浓度空白加标的回收率为74%～118%， 相对标准偏差（RSD）为3.7%～23%。根据6次低浓度空白加标的实验结果计算得到方法检出限为0.2～1.2 ng/L， 方法最低定量浓度为0.8～4.8 ng/L。在去除了仪器干扰后，各目标目的方法检出限和最低定量浓度较EPA 537[12]均有不同程度降低。
3.3 实际样品测定和方法精密度
采集了北京某公园景观水，进行了6次平行样和6次基体加标测定， 结果见表2。水样中PFBA和PFPA浓度较高， 依次为4.2和2.4 ng/L， PFOA 1.2 ng/L， PFOS未检出。平行样测定有较好的重现性，各目标物浓度的RSD<20%。基体加标实验中各目标物回收率为87%～129%， RSD<15%。说明本方法具有较好的重现性和准确性。
实验表明，通过在液相系统阻尼器和进样针之间串联色谱柱为延迟柱，能够实现对流路中PFOA的假阳性干扰实现去除。在安装了延迟柱后，样品目标物的保留时间略有延迟，分析的平衡时间也将延长，但方法全程序空白能够较好的控制，从而降低方法检出限和定量下限。
Reference
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杂质延迟法检测水中邻苯二甲酸脂——液相色谱串联质谱法. 岛津应用文集， 色谱分析
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关键词 水； 全氟辛酸； 全氟化合物； 杂质延迟法； 干扰去除
1 引 言
全氟化合物（PFCs）开始生产和使用于上世纪四、五十年代，由于其疏油、疏水的特性被广泛应用于纺织、造纸、食品包装、地毯、皮革、洗发香波和灭火泡沫等工业和民用行业[1～5]。由于C8的全氟辛基磺酸盐（PFOS）及其盐类和全氟辛酸（PFOA）的毒性， PFOS及其盐和全氟辛基磺酰氟被正式列入持久性有机污染物名单附件B加以限制[3]。目前，PFOA和PFOS在水体、土壤、沉积物、生物体，甚至人体血液和母乳中均有不同程度的检出[2～7]。2006年12月欧洲议会发布限制销售和使用PFOS的法令[8]。美国明尼苏达州规定了饮用水中PFOA和PFOS的最大允许浓度分别为0.4和0.2 μg/L[9]，新泽西州则将PFOA的非致癌限量定为0.04 μg/L[10]。作为斯德哥尔摩公约缔约国，我国对PFOS和PFOA的关注也逐渐增加。
然而， 在水环境PFCs的监测中，空白控制一直是最棘手的问题之一。存在两个原因： 样品采集和前处理过程中引入的空白干扰，可通过更换器皿材质（聚丙烯）和使用前溶剂清洗（甲醇）等方式去除[11，12]；仪器分析过程中引入的干扰，液相（LC）系统流路中无法避免含氟聚合物的使用（如脱气机等），这部分干扰无法直接去除。为保证测定结果的可靠性，国际标准化组织出台的标准ISO 25101（2009）[11]和美国环保署出台的EPA Method 573（2009）[12]均明确指出分析过程中引入的背景干扰不得高于测定值的1/10， 这就要求对仪器背景进行控制。为降低仪器分析带来的背景干扰，得到准确的数据结果，本研究利用杂质延迟法去除了HPLC系统中PFOA的干扰，并建立了水中多种全氟化合物的分析方法。
2 实验部分
2.1 仪器和与试剂
QQQ 6410高效液相色谱 串联质谱仪（HPLC/MS/MS， 美国Agilent公司）。
标准品全氟丁酸PFBA（98%），全氟戊酸PFPA（97%）， 全氟己酸PFHxA（96%），全氟庚酸PFHpA（99%）， 全氟辛酸PFOA（96%）， 全氟壬酸PFNA（97%）， 全氟癸酸PFDA（98%），均购自美国Sigma Alorich公司； 全氟辛烷磺酸PFOS（99%，德国Dr. Ehrenstorfer GmbH公司；碳标记同位素： 进样内标13C2 PFOA标准溶液（M2PFOA， 50 mg/L， 甲醇）， 回收率指示物13C8 PFOA标准溶液（M8PFOA， 50 mg/L，甲醇）和13C4 PFOS标准溶液（MPFOS， 50 mg/L，甲醇）均购自美国Wellington Laboratories公司。有机溶剂乙腈 （CH3CN）、甲醇（CH3OH）、乙酸（CH3COOH），均为HPLC级（美国J.T.Baker公司）；乙酸铵（CH3COONH4，HPLC级， 韩国DUKSAN公司）；氨水（50%， HPLC级， 美国Alfa Aesar公司）。
2.2 样品前处理
量取水样500 mL，经过0.7 μm石英纤维膜过滤，去除水中颗粒物。加入回收率指示物（M8PFOA， MPFOS，10.0 ng），老化30 min。然后将样品以3～5 mL/min流速通过经过预处理后的WAX柱（WAX小柱的预处理： 依次用6 mL 0.5%氨水 甲醇、甲醇和高纯水淋洗）。样品完全通过WAX小柱后，使用6 mL pH=4.0 的醋酸铵（0.25 mmol/L）缓冲溶液淋洗小柱， 再加入高纯水清洗小柱。干燥10 min后， 加入3 mL甲醇去除杂质， 使用8 mL 0.5% 氨水 甲醇淋洗得到目标物。氮吹浓缩淋洗液小于0.5 mL，加入内标指示物（10.0 ng）和500 μL高纯水， 使用甲醇定容至1.0 mL， 4 ℃保存， 待测。
2.3 色谱条件
ZORBAX XDB C18分析柱（50 mm × 4.6 mm × 1.8 μm）；延迟柱：与分析柱相同， 串联在阻尼器和进样针之间； 分析柱温度：30 ℃； 流动相流速： 0.30 mL/min； A相乙腈， B相10 mmol/L醋酸铵溶液。梯度洗脱： 0～5 min， 70% B； 5～8 min， 70%～25% B； 9～12 min， 0% B； 12～20 min， 70% B。进样体积： 5.0 μL。
2.4 质谱条件
离子源：电喷雾离子源（ESI
；检测方式：多级反应监测（MRM）；干燥气流速：480 L/h；干燥气温度：350 ℃；毛细管电压：4000 eV；定量离子对、碰撞气能量和碰撞能见表1，标准溶液色谱图见图1。
3 结果与讨论
3.1 延迟柱的选择
由于LC系统中无法避免含氟聚合物的使用，可引入较高的PFOA假阳性污染。实验表明，在LC系统更换了一台新的脱气机后，仪器测定发现甲醇中有较高的PFOA，约5 ng/mL（见图2A）。为判断干扰来源，分别将10 mL甲醇和乙腈浓缩，结果显示污染不随溶剂浓缩发生变化，推断干扰来自于LC系统。流动相将LC系统中的PFOA溶出并带到检测器， 且系统背景对样品分析有固定的干扰：在梯度洗脱过程中，当液相为初始状态水相比例较大时，色谱柱对LC系统中的PFOA的吸附过程为主要过程； 随着有机相增加，吸附过程减弱，解析过程不断加强； 当有机相达到一定比例后，解析过程为主要过程，最终实现LC系统中的PFOA的被周期性检出，造成假阳性干扰（图2A和2B）。
在LC系统二元泵和进样针之间串联延迟柱就是利用了色谱柱对系统中干扰物能够捕集并释放的原理。该方法被应用于邻苯二甲酸酯的分析过程[13]。本研究在LC系统二元泵和进样针之间串联了1支与分析柱相同的色谱柱作为延迟柱。样品的分析过程为： 进样前， LC系统进样针之前被流动相溶出的PFOA在延迟柱顶端被吸附； 进样后， 延迟柱首先捕集再释放系统中的PFOA， 再进入分析柱，最后进入检测器。与此同时， 样品中PFOA直接通过分析柱进入检测器。由于延迟柱与分析柱完全一致，在忽略LC系统的延迟体积的情况下，可以认为当杂质峰抵达分析柱时，样品中的PFOA已进入检测器。因此， 杂质的出峰时间将比样品出峰时间长出分析柱的死时间（约为1.2 min， 详见图2D）。
在实际样品分析的过程中， LC系统的延迟体积越大， 系统平衡需要的时间越长，即样品分析的时间越长。因此， 在能够达到目标物分离条件下，建议使用柱体积较小的延迟柱。若使用与分析柱相同规格、粒径和径宽的色谱柱可根据液相理论知识推算延迟柱的长度。对比图1串联延迟柱前后空白溶液和标准溶液中PFOA的变化可知， 若要实现目标物和背景干扰的分离， 需满足公式（3）：
其中，N为柱效，t为目标物出峰时间，W为目标物峰宽， t1为目标物在分析柱的出峰时间， t2为串联延迟柱后样品中目标物的出峰时间， t0为延迟柱死时间， t杂为增加延迟柱后杂质峰出峰时间， W杂 为串联杂质峰后杂质的半峰宽。根据公式（1）可知，当延迟柱的填料规格、粒径和以及色谱柱直径一致时，延迟柱和分析柱的长度比值为柱效比值， 同时也是某一目标物保留时间或峰宽比值的平方。设分析柱长为1，延迟柱长为X， 则公式（3）变形为：
实验可测得t1， t0和W， 进而计算得到满足公式（4）的最小X值。根据上述公式计算推断， 在色谱柱填料规格、粒径和径宽相同的条件下， 延迟柱长度需大于分析柱的0.6，才能实现目标物与系统干扰分离。
3.2 全程序空白和方法检出限
在串联延迟柱后，样品的全程序空白得到了较好的控制， 6次平行测定中PFOA的浓度均不高于0.2 ng/L， 但仍不可避免有微量的FPNA和PFDA的检出， 浓度分别为0.22和0.16 ng/L。
根据全程序空白低浓度加标平行样（6次平行）3倍标准偏差（s）计算方法的检出限。实验步骤如2.2节所述， 准确量取高纯水500 mL， 加入标准物质各0/5 ng（即1/0 ng/L）和回收率指示物（MPFOS和M8PFOA），经WAX小柱富集净化，淋洗液浓缩定容至1 mL，仪器分析前加入内标指示物。检出限和最低定量浓度计算依据为： 检出限=2.57s （n=6， a=0.05时， t=2.57）； 最低定量浓度=4s。 6次低浓度空白加标的回收率为74%～118%， 相对标准偏差（RSD）为3.7%～23%。根据6次低浓度空白加标的实验结果计算得到方法检出限为0.2～1.2 ng/L， 方法最低定量浓度为0.8～4.8 ng/L。在去除了仪器干扰后，各目标目的方法检出限和最低定量浓度较EPA 537[12]均有不同程度降低。
3.3 实际样品测定和方法精密度
采集了北京某公园景观水，进行了6次平行样和6次基体加标测定， 结果见表2。水样中PFBA和PFPA浓度较高， 依次为4.2和2.4 ng/L， PFOA 1.2 ng/L， PFOS未检出。平行样测定有较好的重现性，各目标物浓度的RSD<20%。基体加标实验中各目标物回收率为87%～129%， RSD<15%。说明本方法具有较好的重现性和准确性。
实验表明，通过在液相系统阻尼器和进样针之间串联色谱柱为延迟柱，能够实现对流路中PFOA的假阳性干扰实现去除。在安装了延迟柱后，样品目标物的保留时间略有延迟，分析的平衡时间也将延长，但方法全程序空白能够较好的控制，从而降低方法检出限和定量下限。
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