基于石墨烯和室温离子液体复合物溶胶修饰的玻碳电极制备尿酸电化学传感器
付海莹+王建秀+邓留??
摘 要 将石墨烯（GN）与室温离子液体（IL）1 丁基 3 甲基咪唑六氟磷酸盐（BMIMPF6），以适当比例研磨成胶状IL GN， 修饰在玻碳电极（GC）上制备了IL GN/GC。利用原子力显微镜AFM表征IL GN的形成。由于石墨烯和室温离子液体的协同作用，该电极显示了对H2O2良好的催化性能，基于尿酸氧化酶将之制备成生物传感器， 用于尿酸（UA）直接电化学检测，并进行了传感器的抗干扰性能及实际血样中尿酸的检测实验。结果表明，此传感器检测尿酸的线性范围为0.002～4.5 mmol/L，相关系数为0.995，检出限为0.85 μmol/L，响应时间为10 s。此传感器制备简便，稳定性好，抗干扰能力强，可用于实际血清中尿酸的检测，为尿酸的测定提供了新方法。
关键词 石墨烯；室温离子液体；尿酸；电化学传感器
1 引 言
2004年，英国Manchester大学Geim等发现了石墨烯（Graphene），它具有完美的两维周期平面结构， 兼有石墨和碳纳米管等材料的一些优良性质， 例如高热导性和高机械强度， 更为奇特之处是它具有独特的电子结构和电学性质[1-3]。未修饰的石墨烯在水和其它常见有机溶液中的溶解能力非常差。大量的探索性的工作发现，经过功能化的石墨烯，不仅其溶解性显著改善，而且通过继承被修饰物的特性，还赋予了石墨烯新的物理化学性质[4，5]。近年来，很多文章报道了将生物活性分子共价键合到石墨烯表面，用于生物分析的研究，这些研究结果表明，石墨烯 生物分子复合纳米结构在生物化学领域有望成为具有重要应用潜能的分析材料[6，7]。
室温离子液体（IL）具有保持和促进蛋白质活性的能力，近年来已在生物和生物电化学领域中引起越来赿多的关注[8，9]。IL 是一种环境友好试剂，在室温时完全由离子组成，具有一定的粘度和独特的物理和化学性质，例如高的热稳定性、较小的蒸汽压和相对较高的离子导电性。尤为重要的是，其具有较好的电化学稳定性和保持甚至提高酶的生物活性的能力，使IL 在生物及生物电化学领域有着广阔的应用前景。本研究采用石墨烯与离子液体，通过简单的研磨可非常容易地将石墨烯分散均匀。IL GNs复合物可作为一种具有良好生物相容性的电子媒介体和固定酶的新型生物平台，尿酸酶 室温离子液体/石墨烯对尿酸表现出良好的安培响应，为临床尿酸检测提供了一种具有良好应用前景的检测方法。
2 实验部分
2.1 仪器和试剂
尿酸氧化酶 （Uox， Sigma 公司）。石墨粉、肼、KMnO4、H2SO4、氨水、尿酸（北京化学试剂公司）。 其它试剂均为分析纯。0.1 mol/L磷酸盐缓冲溶液（PBS，pH 7.4）作为支持电解液。实验用水均为Millipore Milli Q纯化过的超纯水。
2.2 修饰电极的制备
以石墨粉为原材料.通过Hummers法液相氧化合成氧化石墨[10]。将23 mL H2SO4冷却到0 ℃后加入1 g石墨粉，搅拌均匀得到溶液A。将适量KMnO4在搅拌下缓慢加入A溶液中。在35 ℃下水浴中反应2 h。然后缓慢加入适量去离子水稀释，过程中保持溶液不沸腾。再用30% H2O2处理， 然后趁热过滤。将得到的滤饼烘箱中100 ℃干燥，备用。将5 mL氧化石墨（1 g/L） 加入3.5 μL 肼和40.0 μL氨水，搅拌数分钟后在95 ℃油浴中1 h。冷却到室温后， 过滤后得到石墨烯。将20 mg 石墨烯和0.2 mL IL 的混合物在研钵中研磨约20 min， 得到黑色粘性的IL GNs 复合物。在光学显微镜下小心地将适量的IL GNs复合物刮涂于工作电极表面， 得到IL GNs/GC电极。Uox/IL GNs/GC电极的制备基本相同， 只是将Uox溶于IL中之后再与石墨烯混合。
2.3 实验方法
原子力显微镜（AFM）测试在SPA 400 仪器上进行，控制软件为SPI 3800（Seiko Instruments Industry Co.， Tokyo， Japan）。循环伏安实验和计时安培测量用CHI660B型电化学工作站（美国）测定，采用常规的三电极体系，未修饰的和修饰的玻碳电极（GC）为工作电极，旋状铂丝为对电极，Ag/AgCl 电极（饱和KCl 溶液）为参比电极。在实验前，通入高纯氮气至少30 min， 得到氮气饱和的溶液。所有实验均在室温下进行。
3 结果与讨论
3.1 离子液体 石墨烯复合膜的表征
采用原子力显微镜表征了离子液体 石墨烯复合膜的表面形貌（图1）。从图1可见，单层离子液体 石墨烯复合膜高度为1.8 nm，比未功能化的石墨烯厚度（0.5 nm）明显增大，说明IL成功修饰到了石墨烯表面。
3.2 IL GNs/GC修饰电极对H2O2的电化学还原性能
为考察室温IL GN/GC电极对H2O2的电化学还原性能， 明确实验是单一组分起作用， 还是室温离子液体和石墨烯的协同作用，将室温离子液体修饰的电极IL/GC、石墨烯修饰的电极GN/GC 和室温离子液体与石墨烯复合胶修饰的电极IL GN/GC 置于0.1 mol/L氮气饱和的PBS缓冲溶液（pH 7.4）中，分别在加入H2O2和不加入H2O2的情况下，以50 mV/s 的扫速进行循环伏安扫描。从图2可知，电极IL/GC（A），GN/GC（B），IL GN/GC（C）均出现明显的还原峰，峰电位分别起始于
， 0.08 V。说明3种电极都能催化H2O2的还原。同时测定了IL GNs膜自身的抗干扰性能。相比IL/GC，GN/GC的还原峰电位有了轻微的正移，但是还原电流比IL/GC大很多，这主要是因为石墨烯较大的比表面积。与此同时，复合溶胶修饰的电极IL GN/GC表现出更好的电催化活性，还原电位起始于
0.08 V，比IL/GC电极正移了40 mV，且峰型最好， 峰电流最大。图2表明，复合胶修饰的电极IL GN/GC表现出了对H2O2最好的电化学还原性能。复合溶胶电极中还原峰电流的改变不是因为室温离子液体或石墨烯单一组分作用，而是因为二者的协同作用，iIL GN >iGN+iIL。最近已有关于碳纳米管和氧化还原媒介体直接的综合体系的协同作用的报道[11，12]， 认为氧化还原媒介体的引入能够提高碳纳米管的电子和离子传输能力，同时增加了复合膜之间的电子交换。在这里，可以借用这种机理解释IL GN纳米复合胶的协同作用。另外， 通过不断加入干扰物质AA，DA，NE等，证明IL/GNs具有很好的抗干扰性能。同时，从图3可见，随着H2O2浓度增加，催化电流也逐渐增大。这些结果都表明IL GN复合溶胶能够作为一种媒介质应用于电化学生物传感器中，具有导电性和生物相容性好、成本低和毒性低等优点。
3.3 基于Uox IL GNs/GC修饰电极的电化学传感器对尿酸的检测在IL GN复合物中混合尿酸酶Uox，用于尿酸的催化，从而制备出检测尿酸的酶生物传感器。尿酸酶在氧气的存在下，尿酸氧化成尿囊素，同时产生H2O2。 通过检测产生的H2O2电化学还原电流就可以测定尿酸的浓度。电位在0～
0.3 mV，电流响应值持续增加，而这之后增加速度减慢，而且更加低的电位会导致噪声的增强，所以在实验中操作电压选择
mV。在电位
0.30 V的条件下，在电解质中不断加入不同浓度的尿酸，产生的稳定的电流 时间曲线见图4。实验中，传感器对尿酸的加入响应相当迅速，响应时间10 s以内。反应迅速的原因主要是在不断搅拌的电解质中，电极上Uox IL GN复合物对H2O2还原的协同作用。从i t曲线得出本方法检测尿酸的线性范围为0.002～4.5 mmol/L，检出限为0.85 μmol/L。 正常人体血清中尿酸浓度为0.3～0.5 mmol/L， 尿液中尿酸浓度为1.4～4.4 mmol/L，因此本传感器可用于实际血液和尿液样品中尿酸的检查。上述结果表明，石墨烯 室温离子液体复合胶能为基于尿酸酶的尿酸传感器提供一个生物相容性良好的平台。
3.4 基于IL GN/GC修饰电极的尿酸电化学传感器的抗干扰性能
在实际样品中，有一些与尿酸共存的电活性物质，如葡萄糖、AA、NE、DA等， 可能影响生物传感器的响应。图5显示了此传感器的抗干扰性能。在图5中， Glucose （5 mmol/L）， AA （0.1 mmol/L）， NE （0.1 mmol/L）， DA （0.1 mmol/L）几乎不引起电信号，而尿酸产生了非常明显的响应。结果表明，生理浓度范围内，葡萄糖、AA、NE、DA等不影响尿酸的测定。这种理想的选择性归功于检测过程中采用了比较低的操作电压，因此，本方法未使用选择性渗透膜或酶的预处理，对尿酸具有特异性的的响应。这一点相较于以前报道的传感器有
明显的优势[13]，同时这一结果也预示了这种传感器在实际样品的检测中的适用性。
3.5 实际样品中尿酸浓度的测定
采用本传感器对5份血清和尿样进行分析， 并与湖南省长沙市第四医院分光光度法的结果相符合（见表1），表明此传感器可用于实际样品的分析。
3.6 传感器的重现性和稳定性
考察了Uox GN IL修饰电极的重现性，相同条件下制备的6 支电极， 对20 mmol/L UA进行检测，电化学信号的相对标准偏差为4.1%；同一只电极对同一样品重复3次测定的RSD为2.6%，还考察了该多层膜修饰电极的长期稳定性。将修饰电极贮存于4 ℃冰箱内，每天取出进行测量，结果表明，在2 个月后，电化学信号降低5.2%。
上述实验结果表明， 将离子液体和石墨烯复合物溶胶（IL GNs）修饰在玻碳电极表面， 由于石墨烯和离子液体的协同作用， 可大大改善电极的导电性和生物相容性，成为良好的生物电化学平台。 IL GNs复合物具有良好的催化能力和容易制备等特点， 有望在生物传感器和其它生物电化学相关领域得到更广泛的应用。
References
1 Geim A K， Novoselov K S.Nat. Mater，2007， 6（3）： 183-191
2 Neto A C， Guinea F， Peres N M R， Novoselov K S， Geim A K.Rev. Mod. Phys.， 2009， 81（1）： 109-162
3 Stankovich S， Dikin D A， Dommett G H， Kohlhaas K M， Zimney E J， Stach E A， Ruoff R S.Nature， 2006， 442（7100）： 282-286
4 Schniepp H C， Li J L， McAllister M J， Sai H， Herrera Alonso， Adamson D H， Aksay I A.J.Phys.Chem.B， 2006， 110（17）： 8535-8539
5 Park S， An J， Piner R D， Jung I， Yang D， Velamakanni A， Ruoff R S.Chem. Mat.， 2008， 20（21）： 6592-6594
6 Liu Y， Dong X， Chen P.Chem. Soc. Rev.， 2012， 41（6）： 2283-2307
7 Stankovich S， Dikin D A， Dommett G H， Kohlhaas K M， Zimney E J， Stach E A， Ruoff R S.Nature， 2006， 442（7100）： 282-286
8 GU Yan Long， SHI Feng， DENG You Quan.J. Chin. Sci. Bull.， 2004， 49（6）： 515-521
顾彦龙， 石 峰， 邓有权. 科学通报， 2004， 49（6）： 515-521
9 SUN Wei， GAO Rui Fang， BI Rui Feng， JIAO Kui.Chinese J. Anal. Chem.， 2007， 35（4）： 567-570
孙 伟， 高瑞芳， 毕瑞峰， 焦 奎. 分析化学， 2007， 35（4）： 567-570
10 Hummers Jr W S， Offeman R E.J. Am. Chem. Soc.， 1958， 80 （6）： 1339-1339
11 Zhang M， Gorski W.J. Am. Chem. Soc.， 2005， 127（7）： 2058-2059
12 Deng L， Liu Y， Yang G， Shang L， Wen D， Wang F， Xu Z， Dong S.Biomacromolecules， 2007， 8（7）： 2063-2071
13 Zhao H T， Ju H X.Anal. Biochem.， 2006， 350（1）： 138-144
0.08 V，比IL/GC电极正移了40 mV，且峰型最好， 峰电流最大。图2表明，复合胶修饰的电极IL GN/GC表现出了对H2O2最好的电化学还原性能。复合溶胶电极中还原峰电流的改变不是因为室温离子液体或石墨烯单一组分作用，而是因为二者的协同作用，iIL GN >iGN+iIL。最近已有关于碳纳米管和氧化还原媒介体直接的综合体系的协同作用的报道[11，12]， 认为氧化还原媒介体的引入能够提高碳纳米管的电子和离子传输能力，同时增加了复合膜之间的电子交换。在这里，可以借用这种机理解释IL GN纳米复合胶的协同作用。另外， 通过不断加入干扰物质AA，DA，NE等，证明IL/GNs具有很好的抗干扰性能。同时，从图3可见，随着H2O2浓度增加，催化电流也逐渐增大。这些结果都表明IL GN复合溶胶能够作为一种媒介质应用于电化学生物传感器中，具有导电性和生物相容性好、成本低和毒性低等优点。
3.3 基于Uox IL GNs/GC修饰电极的电化学传感器对尿酸的检测在IL GN复合物中混合尿酸酶Uox，用于尿酸的催化，从而制备出检测尿酸的酶生物传感器。尿酸酶在氧气的存在下，尿酸氧化成尿囊素，同时产生H2O2。 通过检测产生的H2O2电化学还原电流就可以测定尿酸的浓度。电位在0～
0.3 mV，电流响应值持续增加，而这之后增加速度减慢，而且更加低的电位会导致噪声的增强，所以在实验中操作电压选择
mV。在电位
0.30 V的条件下，在电解质中不断加入不同浓度的尿酸，产生的稳定的电流 时间曲线见图4。实验中，传感器对尿酸的加入响应相当迅速，响应时间10 s以内。反应迅速的原因主要是在不断搅拌的电解质中，电极上Uox IL GN复合物对H2O2还原的协同作用。从i t曲线得出本方法检测尿酸的线性范围为0.002～4.5 mmol/L，检出限为0.85 μmol/L。 正常人体血清中尿酸浓度为0.3～0.5 mmol/L， 尿液中尿酸浓度为1.4～4.4 mmol/L，因此本传感器可用于实际血液和尿液样品中尿酸的检查。上述结果表明，石墨烯 室温离子液体复合胶能为基于尿酸酶的尿酸传感器提供一个生物相容性良好的平台。
3.4 基于IL GN/GC修饰电极的尿酸电化学传感器的抗干扰性能
在实际样品中，有一些与尿酸共存的电活性物质，如葡萄糖、AA、NE、DA等， 可能影响生物传感器的响应。图5显示了此传感器的抗干扰性能。在图5中， Glucose （5 mmol/L）， AA （0.1 mmol/L）， NE （0.1 mmol/L）， DA （0.1 mmol/L）几乎不引起电信号，而尿酸产生了非常明显的响应。结果表明，生理浓度范围内，葡萄糖、AA、NE、DA等不影响尿酸的测定。这种理想的选择性归功于检测过程中采用了比较低的操作电压，因此，本方法未使用选择性渗透膜或酶的预处理，对尿酸具有特异性的的响应。这一点相较于以前报道的传感器有
明显的优势[13]，同时这一结果也预示了这种传感器在实际样品的检测中的适用性。
3.5 实际样品中尿酸浓度的测定
采用本传感器对5份血清和尿样进行分析， 并与湖南省长沙市第四医院分光光度法的结果相符合（见表1），表明此传感器可用于实际样品的分析。
3.6 传感器的重现性和稳定性
考察了Uox GN IL修饰电极的重现性，相同条件下制备的6 支电极， 对20 mmol/L UA进行检测，电化学信号的相对标准偏差为4.1%；同一只电极对同一样品重复3次测定的RSD为2.6%，还考察了该多层膜修饰电极的长期稳定性。将修饰电极贮存于4 ℃冰箱内，每天取出进行测量，结果表明，在2 个月后，电化学信号降低5.2%。
上述实验结果表明， 将离子液体和石墨烯复合物溶胶（IL GNs）修饰在玻碳电极表面， 由于石墨烯和离子液体的协同作用， 可大大改善电极的导电性和生物相容性，成为良好的生物电化学平台。 IL GNs复合物具有良好的催化能力和容易制备等特点， 有望在生物传感器和其它生物电化学相关领域得到更广泛的应用。
References
1 Geim A K， Novoselov K S.Nat. Mater，2007， 6（3）： 183-191
2 Neto A C， Guinea F， Peres N M R， Novoselov K S， Geim A K.Rev. Mod. Phys.， 2009， 81（1）： 109-162
3 Stankovich S， Dikin D A， Dommett G H， Kohlhaas K M， Zimney E J， Stach E A， Ruoff R S.Nature， 2006， 442（7100）： 282-286
4 Schniepp H C， Li J L， McAllister M J， Sai H， Herrera Alonso， Adamson D H， Aksay I A.J.Phys.Chem.B， 2006， 110（17）： 8535-8539
5 Park S， An J， Piner R D， Jung I， Yang D， Velamakanni A， Ruoff R S.Chem. Mat.， 2008， 20（21）： 6592-6594
6 Liu Y， Dong X， Chen P.Chem. Soc. Rev.， 2012， 41（6）： 2283-2307
7 Stankovich S， Dikin D A， Dommett G H， Kohlhaas K M， Zimney E J， Stach E A， Ruoff R S.Nature， 2006， 442（7100）： 282-286
8 GU Yan Long， SHI Feng， DENG You Quan.J. Chin. Sci. Bull.， 2004， 49（6）： 515-521
顾彦龙， 石 峰， 邓有权. 科学通报， 2004， 49（6）： 515-521
9 SUN Wei， GAO Rui Fang， BI Rui Feng， JIAO Kui.Chinese J. Anal. Chem.， 2007， 35（4）： 567-570
孙 伟， 高瑞芳， 毕瑞峰， 焦 奎. 分析化学， 2007， 35（4）： 567-570
10 Hummers Jr W S， Offeman R E.J. Am. Chem. Soc.， 1958， 80 （6）： 1339-1339
11 Zhang M， Gorski W.J. Am. Chem. Soc.， 2005， 127（7）： 2058-2059
12 Deng L， Liu Y， Yang G， Shang L， Wen D， Wang F， Xu Z， Dong S.Biomacromolecules， 2007， 8（7）： 2063-2071
13 Zhao H T， Ju H X.Anal. Biochem.， 2006， 350（1）： 138-144
0.08 V，比IL/GC电极正移了40 mV，且峰型最好， 峰电流最大。图2表明，复合胶修饰的电极IL GN/GC表现出了对H2O2最好的电化学还原性能。复合溶胶电极中还原峰电流的改变不是因为室温离子液体或石墨烯单一组分作用，而是因为二者的协同作用，iIL GN >iGN+iIL。最近已有关于碳纳米管和氧化还原媒介体直接的综合体系的协同作用的报道[11，12]， 认为氧化还原媒介体的引入能够提高碳纳米管的电子和离子传输能力，同时增加了复合膜之间的电子交换。在这里，可以借用这种机理解释IL GN纳米复合胶的协同作用。另外， 通过不断加入干扰物质AA，DA，NE等，证明IL/GNs具有很好的抗干扰性能。同时，从图3可见，随着H2O2浓度增加，催化电流也逐渐增大。这些结果都表明IL GN复合溶胶能够作为一种媒介质应用于电化学生物传感器中，具有导电性和生物相容性好、成本低和毒性低等优点。
3.3 基于Uox IL GNs/GC修饰电极的电化学传感器对尿酸的检测在IL GN复合物中混合尿酸酶Uox，用于尿酸的催化，从而制备出检测尿酸的酶生物传感器。尿酸酶在氧气的存在下，尿酸氧化成尿囊素，同时产生H2O2。 通过检测产生的H2O2电化学还原电流就可以测定尿酸的浓度。电位在0～
0.3 mV，电流响应值持续增加，而这之后增加速度减慢，而且更加低的电位会导致噪声的增强，所以在实验中操作电压选择
mV。在电位
0.30 V的条件下，在电解质中不断加入不同浓度的尿酸，产生的稳定的电流 时间曲线见图4。实验中，传感器对尿酸的加入响应相当迅速，响应时间10 s以内。反应迅速的原因主要是在不断搅拌的电解质中，电极上Uox IL GN复合物对H2O2还原的协同作用。从i t曲线得出本方法检测尿酸的线性范围为0.002～4.5 mmol/L，检出限为0.85 μmol/L。 正常人体血清中尿酸浓度为0.3～0.5 mmol/L， 尿液中尿酸浓度为1.4～4.4 mmol/L，因此本传感器可用于实际血液和尿液样品中尿酸的检查。上述结果表明，石墨烯 室温离子液体复合胶能为基于尿酸酶的尿酸传感器提供一个生物相容性良好的平台。
3.4 基于IL GN/GC修饰电极的尿酸电化学传感器的抗干扰性能
在实际样品中，有一些与尿酸共存的电活性物质，如葡萄糖、AA、NE、DA等， 可能影响生物传感器的响应。图5显示了此传感器的抗干扰性能。在图5中， Glucose （5 mmol/L）， AA （0.1 mmol/L）， NE （0.1 mmol/L）， DA （0.1 mmol/L）几乎不引起电信号，而尿酸产生了非常明显的响应。结果表明，生理浓度范围内，葡萄糖、AA、NE、DA等不影响尿酸的测定。这种理想的选择性归功于检测过程中采用了比较低的操作电压，因此，本方法未使用选择性渗透膜或酶的预处理，对尿酸具有特异性的的响应。这一点相较于以前报道的传感器有
明显的优势[13]，同时这一结果也预示了这种传感器在实际样品的检测中的适用性。
3.5 实际样品中尿酸浓度的测定
采用本传感器对5份血清和尿样进行分析， 并与湖南省长沙市第四医院分光光度法的结果相符合（见表1），表明此传感器可用于实际样品的分析。
3.6 传感器的重现性和稳定性
考察了Uox GN IL修饰电极的重现性，相同条件下制备的6 支电极， 对20 mmol/L UA进行检测，电化学信号的相对标准偏差为4.1%；同一只电极对同一样品重复3次测定的RSD为2.6%，还考察了该多层膜修饰电极的长期稳定性。将修饰电极贮存于4 ℃冰箱内，每天取出进行测量，结果表明，在2 个月后，电化学信号降低5.2%。
上述实验结果表明， 将离子液体和石墨烯复合物溶胶（IL GNs）修饰在玻碳电极表面， 由于石墨烯和离子液体的协同作用， 可大大改善电极的导电性和生物相容性，成为良好的生物电化学平台。 IL GNs复合物具有良好的催化能力和容易制备等特点， 有望在生物传感器和其它生物电化学相关领域得到更广泛的应用。
References
1 Geim A K， Novoselov K S.Nat. Mater，2007， 6（3）： 183-191
2 Neto A C， Guinea F， Peres N M R， Novoselov K S， Geim A K.Rev. Mod. Phys.， 2009， 81（1）： 109-162
3 Stankovich S， Dikin D A， Dommett G H， Kohlhaas K M， Zimney E J， Stach E A， Ruoff R S.Nature， 2006， 442（7100）： 282-286
4 Schniepp H C， Li J L， McAllister M J， Sai H， Herrera Alonso， Adamson D H， Aksay I A.J.Phys.Chem.B， 2006， 110（17）： 8535-8539
5 Park S， An J， Piner R D， Jung I， Yang D， Velamakanni A， Ruoff R S.Chem. Mat.， 2008， 20（21）： 6592-6594
6 Liu Y， Dong X， Chen P.Chem. Soc. Rev.， 2012， 41（6）： 2283-2307
7 Stankovich S， Dikin D A， Dommett G H， Kohlhaas K M， Zimney E J， Stach E A， Ruoff R S.Nature， 2006， 442（7100）： 282-286
8 GU Yan Long， SHI Feng， DENG You Quan.J. Chin. Sci. Bull.， 2004， 49（6）： 515-521
顾彦龙， 石 峰， 邓有权. 科学通报， 2004， 49（6）： 515-521
9 SUN Wei， GAO Rui Fang， BI Rui Feng， JIAO Kui.Chinese J. Anal. Chem.， 2007， 35（4）： 567-570
孙 伟， 高瑞芳， 毕瑞峰， 焦 奎. 分析化学， 2007， 35（4）： 567-570
10 Hummers Jr W S， Offeman R E.J. Am. Chem. Soc.， 1958， 80 （6）： 1339-1339
11 Zhang M， Gorski W.J. Am. Chem. Soc.， 2005， 127（7）： 2058-2059
12 Deng L， Liu Y， Yang G， Shang L， Wen D， Wang F， Xu Z， Dong S.Biomacromolecules， 2007， 8（7）： 2063-2071
13 Zhao H T， Ju H X.Anal. Biochem.， 2006， 350（1）： 138-144
摘 要 将石墨烯（GN）与室温离子液体（IL）1 丁基 3 甲基咪唑六氟磷酸盐（BMIMPF6），以适当比例研磨成胶状IL GN， 修饰在玻碳电极（GC）上制备了IL GN/GC。利用原子力显微镜AFM表征IL GN的形成。由于石墨烯和室温离子液体的协同作用，该电极显示了对H2O2良好的催化性能，基于尿酸氧化酶将之制备成生物传感器， 用于尿酸（UA）直接电化学检测，并进行了传感器的抗干扰性能及实际血样中尿酸的检测实验。结果表明，此传感器检测尿酸的线性范围为0.002～4.5 mmol/L，相关系数为0.995，检出限为0.85 μmol/L，响应时间为10 s。此传感器制备简便，稳定性好，抗干扰能力强，可用于实际血清中尿酸的检测，为尿酸的测定提供了新方法。
关键词 石墨烯；室温离子液体；尿酸；电化学传感器
1 引 言
2004年，英国Manchester大学Geim等发现了石墨烯（Graphene），它具有完美的两维周期平面结构， 兼有石墨和碳纳米管等材料的一些优良性质， 例如高热导性和高机械强度， 更为奇特之处是它具有独特的电子结构和电学性质[1-3]。未修饰的石墨烯在水和其它常见有机溶液中的溶解能力非常差。大量的探索性的工作发现，经过功能化的石墨烯，不仅其溶解性显著改善，而且通过继承被修饰物的特性，还赋予了石墨烯新的物理化学性质[4，5]。近年来，很多文章报道了将生物活性分子共价键合到石墨烯表面，用于生物分析的研究，这些研究结果表明，石墨烯 生物分子复合纳米结构在生物化学领域有望成为具有重要应用潜能的分析材料[6，7]。
室温离子液体（IL）具有保持和促进蛋白质活性的能力，近年来已在生物和生物电化学领域中引起越来赿多的关注[8，9]。IL 是一种环境友好试剂，在室温时完全由离子组成，具有一定的粘度和独特的物理和化学性质，例如高的热稳定性、较小的蒸汽压和相对较高的离子导电性。尤为重要的是，其具有较好的电化学稳定性和保持甚至提高酶的生物活性的能力，使IL 在生物及生物电化学领域有着广阔的应用前景。本研究采用石墨烯与离子液体，通过简单的研磨可非常容易地将石墨烯分散均匀。IL GNs复合物可作为一种具有良好生物相容性的电子媒介体和固定酶的新型生物平台，尿酸酶 室温离子液体/石墨烯对尿酸表现出良好的安培响应，为临床尿酸检测提供了一种具有良好应用前景的检测方法。
2 实验部分
2.1 仪器和试剂
尿酸氧化酶 （Uox， Sigma 公司）。石墨粉、肼、KMnO4、H2SO4、氨水、尿酸（北京化学试剂公司）。 其它试剂均为分析纯。0.1 mol/L磷酸盐缓冲溶液（PBS，pH 7.4）作为支持电解液。实验用水均为Millipore Milli Q纯化过的超纯水。
2.2 修饰电极的制备
以石墨粉为原材料.通过Hummers法液相氧化合成氧化石墨[10]。将23 mL H2SO4冷却到0 ℃后加入1 g石墨粉，搅拌均匀得到溶液A。将适量KMnO4在搅拌下缓慢加入A溶液中。在35 ℃下水浴中反应2 h。然后缓慢加入适量去离子水稀释，过程中保持溶液不沸腾。再用30% H2O2处理， 然后趁热过滤。将得到的滤饼烘箱中100 ℃干燥，备用。将5 mL氧化石墨（1 g/L） 加入3.5 μL 肼和40.0 μL氨水，搅拌数分钟后在95 ℃油浴中1 h。冷却到室温后， 过滤后得到石墨烯。将20 mg 石墨烯和0.2 mL IL 的混合物在研钵中研磨约20 min， 得到黑色粘性的IL GNs 复合物。在光学显微镜下小心地将适量的IL GNs复合物刮涂于工作电极表面， 得到IL GNs/GC电极。Uox/IL GNs/GC电极的制备基本相同， 只是将Uox溶于IL中之后再与石墨烯混合。
2.3 实验方法
原子力显微镜（AFM）测试在SPA 400 仪器上进行，控制软件为SPI 3800（Seiko Instruments Industry Co.， Tokyo， Japan）。循环伏安实验和计时安培测量用CHI660B型电化学工作站（美国）测定，采用常规的三电极体系，未修饰的和修饰的玻碳电极（GC）为工作电极，旋状铂丝为对电极，Ag/AgCl 电极（饱和KCl 溶液）为参比电极。在实验前，通入高纯氮气至少30 min， 得到氮气饱和的溶液。所有实验均在室温下进行。
3 结果与讨论
3.1 离子液体 石墨烯复合膜的表征
采用原子力显微镜表征了离子液体 石墨烯复合膜的表面形貌（图1）。从图1可见，单层离子液体 石墨烯复合膜高度为1.8 nm，比未功能化的石墨烯厚度（0.5 nm）明显增大，说明IL成功修饰到了石墨烯表面。
3.2 IL GNs/GC修饰电极对H2O2的电化学还原性能
为考察室温IL GN/GC电极对H2O2的电化学还原性能， 明确实验是单一组分起作用， 还是室温离子液体和石墨烯的协同作用，将室温离子液体修饰的电极IL/GC、石墨烯修饰的电极GN/GC 和室温离子液体与石墨烯复合胶修饰的电极IL GN/GC 置于0.1 mol/L氮气饱和的PBS缓冲溶液（pH 7.4）中，分别在加入H2O2和不加入H2O2的情况下，以50 mV/s 的扫速进行循环伏安扫描。从图2可知，电极IL/GC（A），GN/GC（B），IL GN/GC（C）均出现明显的还原峰，峰电位分别起始于
， 0.08 V。说明3种电极都能催化H2O2的还原。同时测定了IL GNs膜自身的抗干扰性能。相比IL/GC，GN/GC的还原峰电位有了轻微的正移，但是还原电流比IL/GC大很多，这主要是因为石墨烯较大的比表面积。与此同时，复合溶胶修饰的电极IL GN/GC表现出更好的电催化活性，还原电位起始于
0.08 V，比IL/GC电极正移了40 mV，且峰型最好， 峰电流最大。图2表明，复合胶修饰的电极IL GN/GC表现出了对H2O2最好的电化学还原性能。复合溶胶电极中还原峰电流的改变不是因为室温离子液体或石墨烯单一组分作用，而是因为二者的协同作用，iIL GN >iGN+iIL。最近已有关于碳纳米管和氧化还原媒介体直接的综合体系的协同作用的报道[11，12]， 认为氧化还原媒介体的引入能够提高碳纳米管的电子和离子传输能力，同时增加了复合膜之间的电子交换。在这里，可以借用这种机理解释IL GN纳米复合胶的协同作用。另外， 通过不断加入干扰物质AA，DA，NE等，证明IL/GNs具有很好的抗干扰性能。同时，从图3可见，随着H2O2浓度增加，催化电流也逐渐增大。这些结果都表明IL GN复合溶胶能够作为一种媒介质应用于电化学生物传感器中，具有导电性和生物相容性好、成本低和毒性低等优点。
3.3 基于Uox IL GNs/GC修饰电极的电化学传感器对尿酸的检测在IL GN复合物中混合尿酸酶Uox，用于尿酸的催化，从而制备出检测尿酸的酶生物传感器。尿酸酶在氧气的存在下，尿酸氧化成尿囊素，同时产生H2O2。 通过检测产生的H2O2电化学还原电流就可以测定尿酸的浓度。电位在0～
0.3 mV，电流响应值持续增加，而这之后增加速度减慢，而且更加低的电位会导致噪声的增强，所以在实验中操作电压选择
mV。在电位
0.30 V的条件下，在电解质中不断加入不同浓度的尿酸，产生的稳定的电流 时间曲线见图4。实验中，传感器对尿酸的加入响应相当迅速，响应时间10 s以内。反应迅速的原因主要是在不断搅拌的电解质中，电极上Uox IL GN复合物对H2O2还原的协同作用。从i t曲线得出本方法检测尿酸的线性范围为0.002～4.5 mmol/L，检出限为0.85 μmol/L。 正常人体血清中尿酸浓度为0.3～0.5 mmol/L， 尿液中尿酸浓度为1.4～4.4 mmol/L，因此本传感器可用于实际血液和尿液样品中尿酸的检查。上述结果表明，石墨烯 室温离子液体复合胶能为基于尿酸酶的尿酸传感器提供一个生物相容性良好的平台。
3.4 基于IL GN/GC修饰电极的尿酸电化学传感器的抗干扰性能
在实际样品中，有一些与尿酸共存的电活性物质，如葡萄糖、AA、NE、DA等， 可能影响生物传感器的响应。图5显示了此传感器的抗干扰性能。在图5中， Glucose （5 mmol/L）， AA （0.1 mmol/L）， NE （0.1 mmol/L）， DA （0.1 mmol/L）几乎不引起电信号，而尿酸产生了非常明显的响应。结果表明，生理浓度范围内，葡萄糖、AA、NE、DA等不影响尿酸的测定。这种理想的选择性归功于检测过程中采用了比较低的操作电压，因此，本方法未使用选择性渗透膜或酶的预处理，对尿酸具有特异性的的响应。这一点相较于以前报道的传感器有
明显的优势[13]，同时这一结果也预示了这种传感器在实际样品的检测中的适用性。
3.5 实际样品中尿酸浓度的测定
采用本传感器对5份血清和尿样进行分析， 并与湖南省长沙市第四医院分光光度法的结果相符合（见表1），表明此传感器可用于实际样品的分析。
3.6 传感器的重现性和稳定性
考察了Uox GN IL修饰电极的重现性，相同条件下制备的6 支电极， 对20 mmol/L UA进行检测，电化学信号的相对标准偏差为4.1%；同一只电极对同一样品重复3次测定的RSD为2.6%，还考察了该多层膜修饰电极的长期稳定性。将修饰电极贮存于4 ℃冰箱内，每天取出进行测量，结果表明，在2 个月后，电化学信号降低5.2%。
上述实验结果表明， 将离子液体和石墨烯复合物溶胶（IL GNs）修饰在玻碳电极表面， 由于石墨烯和离子液体的协同作用， 可大大改善电极的导电性和生物相容性，成为良好的生物电化学平台。 IL GNs复合物具有良好的催化能力和容易制备等特点， 有望在生物传感器和其它生物电化学相关领域得到更广泛的应用。
References
1 Geim A K， Novoselov K S.Nat. Mater，2007， 6（3）： 183-191
2 Neto A C， Guinea F， Peres N M R， Novoselov K S， Geim A K.Rev. Mod. Phys.， 2009， 81（1）： 109-162
3 Stankovich S， Dikin D A， Dommett G H， Kohlhaas K M， Zimney E J， Stach E A， Ruoff R S.Nature， 2006， 442（7100）： 282-286
4 Schniepp H C， Li J L， McAllister M J， Sai H， Herrera Alonso， Adamson D H， Aksay I A.J.Phys.Chem.B， 2006， 110（17）： 8535-8539
5 Park S， An J， Piner R D， Jung I， Yang D， Velamakanni A， Ruoff R S.Chem. Mat.， 2008， 20（21）： 6592-6594
6 Liu Y， Dong X， Chen P.Chem. Soc. Rev.， 2012， 41（6）： 2283-2307
7 Stankovich S， Dikin D A， Dommett G H， Kohlhaas K M， Zimney E J， Stach E A， Ruoff R S.Nature， 2006， 442（7100）： 282-286
8 GU Yan Long， SHI Feng， DENG You Quan.J. Chin. Sci. Bull.， 2004， 49（6）： 515-521
顾彦龙， 石 峰， 邓有权. 科学通报， 2004， 49（6）： 515-521
9 SUN Wei， GAO Rui Fang， BI Rui Feng， JIAO Kui.Chinese J. Anal. Chem.， 2007， 35（4）： 567-570
孙 伟， 高瑞芳， 毕瑞峰， 焦 奎. 分析化学， 2007， 35（4）： 567-570
10 Hummers Jr W S， Offeman R E.J. Am. Chem. Soc.， 1958， 80 （6）： 1339-1339
11 Zhang M， Gorski W.J. Am. Chem. Soc.， 2005， 127（7）： 2058-2059
12 Deng L， Liu Y， Yang G， Shang L， Wen D， Wang F， Xu Z， Dong S.Biomacromolecules， 2007， 8（7）： 2063-2071
13 Zhao H T， Ju H X.Anal. Biochem.， 2006， 350（1）： 138-144
0.08 V，比IL/GC电极正移了40 mV，且峰型最好， 峰电流最大。图2表明，复合胶修饰的电极IL GN/GC表现出了对H2O2最好的电化学还原性能。复合溶胶电极中还原峰电流的改变不是因为室温离子液体或石墨烯单一组分作用，而是因为二者的协同作用，iIL GN >iGN+iIL。最近已有关于碳纳米管和氧化还原媒介体直接的综合体系的协同作用的报道[11，12]， 认为氧化还原媒介体的引入能够提高碳纳米管的电子和离子传输能力，同时增加了复合膜之间的电子交换。在这里，可以借用这种机理解释IL GN纳米复合胶的协同作用。另外， 通过不断加入干扰物质AA，DA，NE等，证明IL/GNs具有很好的抗干扰性能。同时，从图3可见，随着H2O2浓度增加，催化电流也逐渐增大。这些结果都表明IL GN复合溶胶能够作为一种媒介质应用于电化学生物传感器中，具有导电性和生物相容性好、成本低和毒性低等优点。
3.3 基于Uox IL GNs/GC修饰电极的电化学传感器对尿酸的检测在IL GN复合物中混合尿酸酶Uox，用于尿酸的催化，从而制备出检测尿酸的酶生物传感器。尿酸酶在氧气的存在下，尿酸氧化成尿囊素，同时产生H2O2。 通过检测产生的H2O2电化学还原电流就可以测定尿酸的浓度。电位在0～
0.3 mV，电流响应值持续增加，而这之后增加速度减慢，而且更加低的电位会导致噪声的增强，所以在实验中操作电压选择
mV。在电位
0.30 V的条件下，在电解质中不断加入不同浓度的尿酸，产生的稳定的电流 时间曲线见图4。实验中，传感器对尿酸的加入响应相当迅速，响应时间10 s以内。反应迅速的原因主要是在不断搅拌的电解质中，电极上Uox IL GN复合物对H2O2还原的协同作用。从i t曲线得出本方法检测尿酸的线性范围为0.002～4.5 mmol/L，检出限为0.85 μmol/L。 正常人体血清中尿酸浓度为0.3～0.5 mmol/L， 尿液中尿酸浓度为1.4～4.4 mmol/L，因此本传感器可用于实际血液和尿液样品中尿酸的检查。上述结果表明，石墨烯 室温离子液体复合胶能为基于尿酸酶的尿酸传感器提供一个生物相容性良好的平台。
3.4 基于IL GN/GC修饰电极的尿酸电化学传感器的抗干扰性能
在实际样品中，有一些与尿酸共存的电活性物质，如葡萄糖、AA、NE、DA等， 可能影响生物传感器的响应。图5显示了此传感器的抗干扰性能。在图5中， Glucose （5 mmol/L）， AA （0.1 mmol/L）， NE （0.1 mmol/L）， DA （0.1 mmol/L）几乎不引起电信号，而尿酸产生了非常明显的响应。结果表明，生理浓度范围内，葡萄糖、AA、NE、DA等不影响尿酸的测定。这种理想的选择性归功于检测过程中采用了比较低的操作电压，因此，本方法未使用选择性渗透膜或酶的预处理，对尿酸具有特异性的的响应。这一点相较于以前报道的传感器有
明显的优势[13]，同时这一结果也预示了这种传感器在实际样品的检测中的适用性。
3.5 实际样品中尿酸浓度的测定
采用本传感器对5份血清和尿样进行分析， 并与湖南省长沙市第四医院分光光度法的结果相符合（见表1），表明此传感器可用于实际样品的分析。
3.6 传感器的重现性和稳定性
考察了Uox GN IL修饰电极的重现性，相同条件下制备的6 支电极， 对20 mmol/L UA进行检测，电化学信号的相对标准偏差为4.1%；同一只电极对同一样品重复3次测定的RSD为2.6%，还考察了该多层膜修饰电极的长期稳定性。将修饰电极贮存于4 ℃冰箱内，每天取出进行测量，结果表明，在2 个月后，电化学信号降低5.2%。
上述实验结果表明， 将离子液体和石墨烯复合物溶胶（IL GNs）修饰在玻碳电极表面， 由于石墨烯和离子液体的协同作用， 可大大改善电极的导电性和生物相容性，成为良好的生物电化学平台。 IL GNs复合物具有良好的催化能力和容易制备等特点， 有望在生物传感器和其它生物电化学相关领域得到更广泛的应用。
References
1 Geim A K， Novoselov K S.Nat. Mater，2007， 6（3）： 183-191
2 Neto A C， Guinea F， Peres N M R， Novoselov K S， Geim A K.Rev. Mod. Phys.， 2009， 81（1）： 109-162
3 Stankovich S， Dikin D A， Dommett G H， Kohlhaas K M， Zimney E J， Stach E A， Ruoff R S.Nature， 2006， 442（7100）： 282-286
4 Schniepp H C， Li J L， McAllister M J， Sai H， Herrera Alonso， Adamson D H， Aksay I A.J.Phys.Chem.B， 2006， 110（17）： 8535-8539
5 Park S， An J， Piner R D， Jung I， Yang D， Velamakanni A， Ruoff R S.Chem. Mat.， 2008， 20（21）： 6592-6594
6 Liu Y， Dong X， Chen P.Chem. Soc. Rev.， 2012， 41（6）： 2283-2307
7 Stankovich S， Dikin D A， Dommett G H， Kohlhaas K M， Zimney E J， Stach E A， Ruoff R S.Nature， 2006， 442（7100）： 282-286
8 GU Yan Long， SHI Feng， DENG You Quan.J. Chin. Sci. Bull.， 2004， 49（6）： 515-521
顾彦龙， 石 峰， 邓有权. 科学通报， 2004， 49（6）： 515-521
9 SUN Wei， GAO Rui Fang， BI Rui Feng， JIAO Kui.Chinese J. Anal. Chem.， 2007， 35（4）： 567-570
孙 伟， 高瑞芳， 毕瑞峰， 焦 奎. 分析化学， 2007， 35（4）： 567-570
10 Hummers Jr W S， Offeman R E.J. Am. Chem. Soc.， 1958， 80 （6）： 1339-1339
11 Zhang M， Gorski W.J. Am. Chem. Soc.， 2005， 127（7）： 2058-2059
12 Deng L， Liu Y， Yang G， Shang L， Wen D， Wang F， Xu Z， Dong S.Biomacromolecules， 2007， 8（7）： 2063-2071
13 Zhao H T， Ju H X.Anal. Biochem.， 2006， 350（1）： 138-144
0.08 V，比IL/GC电极正移了40 mV，且峰型最好， 峰电流最大。图2表明，复合胶修饰的电极IL GN/GC表现出了对H2O2最好的电化学还原性能。复合溶胶电极中还原峰电流的改变不是因为室温离子液体或石墨烯单一组分作用，而是因为二者的协同作用，iIL GN >iGN+iIL。最近已有关于碳纳米管和氧化还原媒介体直接的综合体系的协同作用的报道[11，12]， 认为氧化还原媒介体的引入能够提高碳纳米管的电子和离子传输能力，同时增加了复合膜之间的电子交换。在这里，可以借用这种机理解释IL GN纳米复合胶的协同作用。另外， 通过不断加入干扰物质AA，DA，NE等，证明IL/GNs具有很好的抗干扰性能。同时，从图3可见，随着H2O2浓度增加，催化电流也逐渐增大。这些结果都表明IL GN复合溶胶能够作为一种媒介质应用于电化学生物传感器中，具有导电性和生物相容性好、成本低和毒性低等优点。
3.3 基于Uox IL GNs/GC修饰电极的电化学传感器对尿酸的检测在IL GN复合物中混合尿酸酶Uox，用于尿酸的催化，从而制备出检测尿酸的酶生物传感器。尿酸酶在氧气的存在下，尿酸氧化成尿囊素，同时产生H2O2。 通过检测产生的H2O2电化学还原电流就可以测定尿酸的浓度。电位在0～
0.3 mV，电流响应值持续增加，而这之后增加速度减慢，而且更加低的电位会导致噪声的增强，所以在实验中操作电压选择
mV。在电位
0.30 V的条件下，在电解质中不断加入不同浓度的尿酸，产生的稳定的电流 时间曲线见图4。实验中，传感器对尿酸的加入响应相当迅速，响应时间10 s以内。反应迅速的原因主要是在不断搅拌的电解质中，电极上Uox IL GN复合物对H2O2还原的协同作用。从i t曲线得出本方法检测尿酸的线性范围为0.002～4.5 mmol/L，检出限为0.85 μmol/L。 正常人体血清中尿酸浓度为0.3～0.5 mmol/L， 尿液中尿酸浓度为1.4～4.4 mmol/L，因此本传感器可用于实际血液和尿液样品中尿酸的检查。上述结果表明，石墨烯 室温离子液体复合胶能为基于尿酸酶的尿酸传感器提供一个生物相容性良好的平台。
3.4 基于IL GN/GC修饰电极的尿酸电化学传感器的抗干扰性能
在实际样品中，有一些与尿酸共存的电活性物质，如葡萄糖、AA、NE、DA等， 可能影响生物传感器的响应。图5显示了此传感器的抗干扰性能。在图5中， Glucose （5 mmol/L）， AA （0.1 mmol/L）， NE （0.1 mmol/L）， DA （0.1 mmol/L）几乎不引起电信号，而尿酸产生了非常明显的响应。结果表明，生理浓度范围内，葡萄糖、AA、NE、DA等不影响尿酸的测定。这种理想的选择性归功于检测过程中采用了比较低的操作电压，因此，本方法未使用选择性渗透膜或酶的预处理，对尿酸具有特异性的的响应。这一点相较于以前报道的传感器有
明显的优势[13]，同时这一结果也预示了这种传感器在实际样品的检测中的适用性。
3.5 实际样品中尿酸浓度的测定
采用本传感器对5份血清和尿样进行分析， 并与湖南省长沙市第四医院分光光度法的结果相符合（见表1），表明此传感器可用于实际样品的分析。
3.6 传感器的重现性和稳定性
考察了Uox GN IL修饰电极的重现性，相同条件下制备的6 支电极， 对20 mmol/L UA进行检测，电化学信号的相对标准偏差为4.1%；同一只电极对同一样品重复3次测定的RSD为2.6%，还考察了该多层膜修饰电极的长期稳定性。将修饰电极贮存于4 ℃冰箱内，每天取出进行测量，结果表明，在2 个月后，电化学信号降低5.2%。
上述实验结果表明， 将离子液体和石墨烯复合物溶胶（IL GNs）修饰在玻碳电极表面， 由于石墨烯和离子液体的协同作用， 可大大改善电极的导电性和生物相容性，成为良好的生物电化学平台。 IL GNs复合物具有良好的催化能力和容易制备等特点， 有望在生物传感器和其它生物电化学相关领域得到更广泛的应用。
References
1 Geim A K， Novoselov K S.Nat. Mater，2007， 6（3）： 183-191
2 Neto A C， Guinea F， Peres N M R， Novoselov K S， Geim A K.Rev. Mod. Phys.， 2009， 81（1）： 109-162
3 Stankovich S， Dikin D A， Dommett G H， Kohlhaas K M， Zimney E J， Stach E A， Ruoff R S.Nature， 2006， 442（7100）： 282-286
4 Schniepp H C， Li J L， McAllister M J， Sai H， Herrera Alonso， Adamson D H， Aksay I A.J.Phys.Chem.B， 2006， 110（17）： 8535-8539
5 Park S， An J， Piner R D， Jung I， Yang D， Velamakanni A， Ruoff R S.Chem. Mat.， 2008， 20（21）： 6592-6594
6 Liu Y， Dong X， Chen P.Chem. Soc. Rev.， 2012， 41（6）： 2283-2307
7 Stankovich S， Dikin D A， Dommett G H， Kohlhaas K M， Zimney E J， Stach E A， Ruoff R S.Nature， 2006， 442（7100）： 282-286
8 GU Yan Long， SHI Feng， DENG You Quan.J. Chin. Sci. Bull.， 2004， 49（6）： 515-521
顾彦龙， 石 峰， 邓有权. 科学通报， 2004， 49（6）： 515-521
9 SUN Wei， GAO Rui Fang， BI Rui Feng， JIAO Kui.Chinese J. Anal. Chem.， 2007， 35（4）： 567-570
孙 伟， 高瑞芳， 毕瑞峰， 焦 奎. 分析化学， 2007， 35（4）： 567-570
10 Hummers Jr W S， Offeman R E.J. Am. Chem. Soc.， 1958， 80 （6）： 1339-1339
11 Zhang M， Gorski W.J. Am. Chem. Soc.， 2005， 127（7）： 2058-2059
12 Deng L， Liu Y， Yang G， Shang L， Wen D， Wang F， Xu Z， Dong S.Biomacromolecules， 2007， 8（7）： 2063-2071
13 Zhao H T， Ju H X.Anal. Biochem.， 2006， 350（1）： 138-144
