中药材干辣椒中辣椒素和二氢辣椒素含量测定方法研究
韦继雯 闫倩玲 周云波 王红
摘要：目的 对中药材干辣椒中辣椒素和二氢辣椒素的反相高效液相色谱色谱法定量检测方法的优化。方法 采用ThermoC18色谱柱（250mm×4.6mm，5um），流动相为甲醇-水（65：35），流速为1.0mL/min检测波长280nm，柱温40℃。结果 辣椒素及二氢辣椒素在20min内就得到更好的分离和准确的结果，线性范围r=0.9999平均回收率为95.64%。结论 通过对流动相比例改变的检测得到该方法准确，简单，快速、分离效果优。规避了《中国药典》中流动相甲醇-水（50：50）流动相黏度大，压力高189PA，耗时长（60min）后出峰，具拖尾因子较大，峰型较差，伤柱子。可作为中药材中辣椒素及二氢辣椒素的含量测定方法。
关键词：干辣椒;辣椒素;二氢辣椒素
中图分类号：R927.2 文献标志码：A 文章编号：1007-2349（2018）07-0076-03
辣椒（Capsicum frutescens L.）属茄科辣椒属，又名海椒、辣子、番椒、辣茄等，为植物辣椒的干燥成熟果实。收载于《中国药典》2015年版一部中，呈圆锥形、类圆锥形、略弯曲。表面橙红色、红色或深红色，光滑或较皱缩，显油性。基部微圆，常有绿棕色、具有5裂齿的宿萼及果柄。辣椒素及二氢辣椒素属香草胺类生物碱，是辣椒果实中的主要呈辣物质，辛、热，归心、脾经。温中散寒，开胃消食，用于寒滞腹痛，呕吐，泻痢，冻疮。为了高效提取辣椒中辣椒素及二氢辣椒素，本研究通过对《中国药典》辣椒中的辣椒素、二氢辣椒素的提取方法和增加甲醇流动相比列进行选择和优化，报道如下。
1 仪器与材料
1.1 仪器 安捷伦1260高效液相色谱仪（带紫外检测器）、ThermoC18色谱柱（250mm×4.6mm，5um）、BP211D电子分析天平（北京赛多利斯）、电热恒温水浴锅、超声波清洗器，DHG-9101-2A电热恒温干燥箱
1.2 材料 药材为本地干燥尖辣椒（云南文山州砚山县嫁依镇）对照品 辣椒素（批号 110839-201205 97.5%中国食品药品检定研究院）二氢辣椒素（批号 11166-201303 98.5%中国食品药品检定研究院）试剂甲醇为色谱纯，四氢呋喃为分析纯，水为UP水。
2 方法与结果
2.1 对照品溶液的制备 精密称取辣椒素5.23 mg、二氢辣椒素2.08 mg置100 mL容量瓶中，加甲醇溶解并稀释至刻度，即得。
2.2 《中国药典》一部标准 取本品粗粉约0.5 g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入甲醇-四氢呋喃（1：1）混合液25 mL，密塞，称定重量，超声处理30 min，放冷，再称定重量，用甲醇-四氢呋喃（1：1）混合溶液补足减失的重量，摇匀、滤过，取续滤液，经0.45um滤膜滤过，即得。
优化方法：取本品粗粉约0.5g，精密称定，置具塞锥形瓶中，加入甲醇-四氢呋喃（1：1）混合液25mL，密塞，超声处理30min，放冷，滤过，滤液挥干，加甲醇溶解，置10mL容量瓶中并稀释至刻度，经0.45um滤膜滤过即得此方法通过提取过滤蒸干后，再经过甲醇溶解有效避免了一些油脂性成分及四氢呋喃峰的干扰。
2.3 色谱条件及系统适用性考察 ThermoC18色谱柱（250mm×4.6mm，5um），流动相为甲醇-水 分别為（50：50）（55：45）（60：40）（65：35）（70：30），流速为1.0mL/min 检测波长280nm，柱温40℃。见图1～5。
图1 流动相为甲醇-水（50：50）的色谱图
图2 流动相为甲醇-水（55：45）的色谱图
图3 流动相为甲醇-水（60：40）的色谱图
图4 流动相为甲醇-水（65：35）的色谱图
图5 流动相为甲醇-水（70：30）的色谱图
通过对流动相比列的改变，可知在甲醇-水为（60：40）（65：35），图形较好，方法简、快速，峰形尖锐，拖尾因子小，分离效果好，结果准确、可靠等特点。见图6～7。
图6 流动相为甲醇-水（65：35）辣椒素、二氢辣椒素对照品的色谱图
图7 流动相为甲醇-水（65：35）辣椒素样品的色谱图
由于辣椒成分较复杂，故对提取方法、色谱条件进行了优化，本次研究对优化后的方法进行了色谱条件及系统适应性、线性关系、精密度、重复性、回收率进行了考察。
2.4 方法学考察
2.4.1 分离效果 流动相为甲醇-水（65：35）时，分离度为9.57，理论塔板数为10000以上，见色谱图7。
2.4.2 线性关系 分别吸取对照品溶液5、10、15、20、25ul注入液相色谱仪，记录色谱峰以进样量X（ug/mL）为横坐标，峰面积Y（mAU）为纵坐标，绘制标准曲线并进行回归方程计算，辣椒素为Y=29.314X-0.9439，r=0.9999 ;二氢辣椒素为Y=12.513X+1.9029，r=0.9995 根据回归方程表明进样量与峰面积呈良好的线性关系见图8。
图8 辣椒素、二氢辣椒素标准曲线图
2.4.3 精密度 精密吸取上述对照品溶液10ul，注入液相色谱仪，进行6次平行测定，结果表明该仪器的精密度良好，测定结果比较满意。见表1。
表1 辣椒素和二氢辣椒素精密度试验结果
2.4.4 重现性 取同一批样品6份，按照2.3方法处理，取10ul注入液相色谱仪，依法测定，结果表明此方法的重复性好，结果比较满意。见表2。
表2 辣椒素和二氢辣椒素重现性试验结果
2.4.5 加标回收试验结果 称取本品粗粉约0.25g6份，精密称定，分别置具塞锥形瓶中，两个一组为平行样，分别加入2.5mL、5mL、10mL上述对照品溶液，加入甲醇-四氢呋喃（1：1）混合液25mL，混匀，密塞，超声处理30min，放冷，滤过，滤液挥干，加甲醇溶解，置10mL容量瓶中并稀释至刻度，经0.45um滤膜滤过，即得。取10ul注入液相色谱仪，依法测定，色谱条件：ThermoC18色谱柱（250mm×4.6mm，5um），流动相为甲醇-水（65：35），流速为1.0mL/min 检测波长280nm，柱温40℃。见表3。
表3 辣椒素和二氢辣椒素回收率试验结果
由回收率试验结果得出准确度较好，以辣椒素、二氢辣椒素为对照品，利用加入甲醇-四氢呋喃（1：1）混合液提取，蒸干加甲醇定容，流动相甲醇：水（65：35）方法有效可行。
3 讨论
本研究利用甲醇-四氢呋喃（1：1）混合液提取，通过蒸干再以甲醇为溶剂定容可以有效扣除背景值。通过对流动相比例改变的检测得到在甲醇-水为（60：40）（65：35），辣椒素及二氢辣椒素在20min内就得到更好的分离和准确的结果，图形较好，峰型变得尖锐，拖尾因子小。该方法准确，简单，快速、分离效果优。同时操作简便，重复性好，灵敏度高，使检测人员无需再对检测流动相进行摸索、调整并缩短检测时间。可以用于中药材干辣椒中辣椒素及二氢辣椒素的含量测定方法。《中国药典》中使用的流动相为甲醇-水（50：50），流动相黏度大，压力高189bar，耗时长（60min）后出峰，峰型较差、拖尾严重，又伤柱子。而流动相优化后改变了流动相浓度，压力为93bar，出峰时间保留在20min内有效出峰时间。
随着科学技术的不断发展，中药化学成分含量测定、提取分离的方法在不断地改进更新，更多技术含量高的方法被广泛应用，相信这些新技术的推广应用，将会使生产成本降低、产品质量得到提高。
参考文献：
[1]中国药典委员会.中华人民共和国药典（一部）[S].北京：中国医药科技出版社，2015：370.
[2]曹莉，黄多临.HPLC法测定不同产地辣椒中辣椒素和二氢辣椒素的含量[J].中国民族民间医药，2016，25（12）：8-13.
（收稿日期：2018-06-12）
摘要：目的 对中药材干辣椒中辣椒素和二氢辣椒素的反相高效液相色谱色谱法定量检测方法的优化。方法 采用ThermoC18色谱柱（250mm×4.6mm，5um），流动相为甲醇-水（65：35），流速为1.0mL/min检测波长280nm，柱温40℃。结果 辣椒素及二氢辣椒素在20min内就得到更好的分离和准确的结果，线性范围r=0.9999平均回收率为95.64%。结论 通过对流动相比例改变的检测得到该方法准确，简单，快速、分离效果优。规避了《中国药典》中流动相甲醇-水（50：50）流动相黏度大，压力高189PA，耗时长（60min）后出峰，具拖尾因子较大，峰型较差，伤柱子。可作为中药材中辣椒素及二氢辣椒素的含量测定方法。
关键词：干辣椒;辣椒素;二氢辣椒素
中图分类号：R927.2 文献标志码：A 文章编号：1007-2349（2018）07-0076-03
辣椒（Capsicum frutescens L.）属茄科辣椒属，又名海椒、辣子、番椒、辣茄等，为植物辣椒的干燥成熟果实。收载于《中国药典》2015年版一部中，呈圆锥形、类圆锥形、略弯曲。表面橙红色、红色或深红色，光滑或较皱缩，显油性。基部微圆，常有绿棕色、具有5裂齿的宿萼及果柄。辣椒素及二氢辣椒素属香草胺类生物碱，是辣椒果实中的主要呈辣物质，辛、热，归心、脾经。温中散寒，开胃消食，用于寒滞腹痛，呕吐，泻痢，冻疮。为了高效提取辣椒中辣椒素及二氢辣椒素，本研究通过对《中国药典》辣椒中的辣椒素、二氢辣椒素的提取方法和增加甲醇流动相比列进行选择和优化，报道如下。
1 仪器与材料
1.1 仪器 安捷伦1260高效液相色谱仪（带紫外检测器）、ThermoC18色谱柱（250mm×4.6mm，5um）、BP211D电子分析天平（北京赛多利斯）、电热恒温水浴锅、超声波清洗器，DHG-9101-2A电热恒温干燥箱
1.2 材料 药材为本地干燥尖辣椒（云南文山州砚山县嫁依镇）对照品 辣椒素（批号 110839-201205 97.5%中国食品药品检定研究院）二氢辣椒素（批号 11166-201303 98.5%中国食品药品检定研究院）试剂甲醇为色谱纯，四氢呋喃为分析纯，水为UP水。
2 方法与结果
2.1 对照品溶液的制备 精密称取辣椒素5.23 mg、二氢辣椒素2.08 mg置100 mL容量瓶中，加甲醇溶解并稀释至刻度，即得。
2.2 《中国药典》一部标准 取本品粗粉约0.5 g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入甲醇-四氢呋喃（1：1）混合液25 mL，密塞，称定重量，超声处理30 min，放冷，再称定重量，用甲醇-四氢呋喃（1：1）混合溶液补足减失的重量，摇匀、滤过，取续滤液，经0.45um滤膜滤过，即得。
优化方法：取本品粗粉约0.5g，精密称定，置具塞锥形瓶中，加入甲醇-四氢呋喃（1：1）混合液25mL，密塞，超声处理30min，放冷，滤过，滤液挥干，加甲醇溶解，置10mL容量瓶中并稀释至刻度，经0.45um滤膜滤过即得此方法通过提取过滤蒸干后，再经过甲醇溶解有效避免了一些油脂性成分及四氢呋喃峰的干扰。
2.3 色谱条件及系统适用性考察 ThermoC18色谱柱（250mm×4.6mm，5um），流动相为甲醇-水 分别為（50：50）（55：45）（60：40）（65：35）（70：30），流速为1.0mL/min 检测波长280nm，柱温40℃。见图1～5。
图1 流动相为甲醇-水（50：50）的色谱图
图2 流动相为甲醇-水（55：45）的色谱图
图3 流动相为甲醇-水（60：40）的色谱图
图4 流动相为甲醇-水（65：35）的色谱图
图5 流动相为甲醇-水（70：30）的色谱图
通过对流动相比列的改变，可知在甲醇-水为（60：40）（65：35），图形较好，方法简、快速，峰形尖锐，拖尾因子小，分离效果好，结果准确、可靠等特点。见图6～7。
图6 流动相为甲醇-水（65：35）辣椒素、二氢辣椒素对照品的色谱图
图7 流动相为甲醇-水（65：35）辣椒素样品的色谱图
由于辣椒成分较复杂，故对提取方法、色谱条件进行了优化，本次研究对优化后的方法进行了色谱条件及系统适应性、线性关系、精密度、重复性、回收率进行了考察。
2.4 方法学考察
2.4.1 分离效果 流动相为甲醇-水（65：35）时，分离度为9.57，理论塔板数为10000以上，见色谱图7。
2.4.2 线性关系 分别吸取对照品溶液5、10、15、20、25ul注入液相色谱仪，记录色谱峰以进样量X（ug/mL）为横坐标，峰面积Y（mAU）为纵坐标，绘制标准曲线并进行回归方程计算，辣椒素为Y=29.314X-0.9439，r=0.9999 ;二氢辣椒素为Y=12.513X+1.9029，r=0.9995 根据回归方程表明进样量与峰面积呈良好的线性关系见图8。
图8 辣椒素、二氢辣椒素标准曲线图
2.4.3 精密度 精密吸取上述对照品溶液10ul，注入液相色谱仪，进行6次平行测定，结果表明该仪器的精密度良好，测定结果比较满意。见表1。
表1 辣椒素和二氢辣椒素精密度试验结果
2.4.4 重现性 取同一批样品6份，按照2.3方法处理，取10ul注入液相色谱仪，依法测定，结果表明此方法的重复性好，结果比较满意。见表2。
表2 辣椒素和二氢辣椒素重现性试验结果
2.4.5 加标回收试验结果 称取本品粗粉约0.25g6份，精密称定，分别置具塞锥形瓶中，两个一组为平行样，分别加入2.5mL、5mL、10mL上述对照品溶液，加入甲醇-四氢呋喃（1：1）混合液25mL，混匀，密塞，超声处理30min，放冷，滤过，滤液挥干，加甲醇溶解，置10mL容量瓶中并稀释至刻度，经0.45um滤膜滤过，即得。取10ul注入液相色谱仪，依法测定，色谱条件：ThermoC18色谱柱（250mm×4.6mm，5um），流动相为甲醇-水（65：35），流速为1.0mL/min 检测波长280nm，柱温40℃。见表3。
表3 辣椒素和二氢辣椒素回收率试验结果
由回收率试验结果得出准确度较好，以辣椒素、二氢辣椒素为对照品，利用加入甲醇-四氢呋喃（1：1）混合液提取，蒸干加甲醇定容，流动相甲醇：水（65：35）方法有效可行。
3 讨论
本研究利用甲醇-四氢呋喃（1：1）混合液提取，通过蒸干再以甲醇为溶剂定容可以有效扣除背景值。通过对流动相比例改变的检测得到在甲醇-水为（60：40）（65：35），辣椒素及二氢辣椒素在20min内就得到更好的分离和准确的结果，图形较好，峰型变得尖锐，拖尾因子小。该方法准确，简单，快速、分离效果优。同时操作简便，重复性好，灵敏度高，使检测人员无需再对检测流动相进行摸索、调整并缩短检测时间。可以用于中药材干辣椒中辣椒素及二氢辣椒素的含量测定方法。《中国药典》中使用的流动相为甲醇-水（50：50），流动相黏度大，压力高189bar，耗时长（60min）后出峰，峰型较差、拖尾严重，又伤柱子。而流动相优化后改变了流动相浓度，压力为93bar，出峰时间保留在20min内有效出峰时间。
随着科学技术的不断发展，中药化学成分含量测定、提取分离的方法在不断地改进更新，更多技术含量高的方法被广泛应用，相信这些新技术的推广应用，将会使生产成本降低、产品质量得到提高。
参考文献：
[1]中国药典委员会.中华人民共和国药典（一部）[S].北京：中国医药科技出版社，2015：370.
[2]曹莉，黄多临.HPLC法测定不同产地辣椒中辣椒素和二氢辣椒素的含量[J].中国民族民间医药，2016，25（12）：8-13.
（收稿日期：2018-06-12）
