苦胆草片含量测定的方法学验证
王玲芬 郑梅
摘要：目的 对苦胆草片中龙胆苦苷的含量测定方法进行验证。方法 反相高效液相色谱法。色谱柱为Agilent TC-C18（150 mm×4.6 mm，5 um）柱，流动相为甲醇-水（25：75）;柱温为30℃;检测波长为270 nm，流速为0.8 mL/min。结果 龙胆苦苷在0.0508 mg/mL～0.3556mg/mL范围内有良好的线性关系，r=0.999909，平均加样回收率为101.2%，RSD=1.2%（n=9）。结论 该法分离效果好，结果准确、可靠，苦胆草片含量测定的方法可行。
关键词：苦胆草片;龙胆苦苷;含量测定;高效液相色谱法
中图分类号：R927.2 文献标志码：A 文章编号：1007-2349（2018）07-0074-03
苦胆草片在原标准糖衣片（《中华人民共和国卫生部药品标准》中药成方制剂第八册（WS3-B-1555-93）[1]的基础上增加薄膜衣片，薄膜衣片具有生产周期短（3～4 h）、用料少、衣片增重小（小于3%）、衣层机械强度及抗湿、热性好，对药物的崩解影响小以及制剂色泽稳定、美观等优点。现上市的剂型苦胆草片（糖衣片）（WS3-B-1555-93），无含量测定项，笔者认为不足以控制本品的质量，由于本品中仅由坚龙胆一味药材制成，通过参照《中国药典》2010年版一部[2]龙胆药材项中坚龙胆的[含量测定]项和《中国药典》2010版第一部（附录ⅩⅧA）中药质量标准分析方法验证指导原则，对苦胆草片的含量测定方法进行验证。
1 仪器、试药和试剂
1.1 仪器 高效液相色谱仪：型号：岛津LC-2010AHT SHIMADZU（包括输液泵、自动进样器、UV-Vis检测器、CLASS-VP色谱工作站）;电子天平：型号：BP211D Sartorius。
1.2 试药和试剂 样品预处理：所用试剂均为分析纯，高效液相分析所用甲醇为色谱纯，水为娃哈哈纯净水;对照品：龙胆苦苷 中国药品生物制品检定所 编号：110770-200712;样品：云南滇中药业有限公司生产的苦胆草片批号：20100101、20100102、20100103。
2 实验方法
2.1 色谱条件 色谱柱：Agilent TC-C18 5um色谱柱（4.6×150 mm）;流动相：甲醇-水（25：75）;柱温：30℃;检测波长：270 nm;流速：0.8 mL/min;进样量：10 uL;理论塔板数按龙胆苦苷峰计算应不低于3000。
2.2 对照品贮备溶液的制备 精密称取在五氧化二磷干燥器中干燥12 h龙胆苦苷对照品适量，加甲醇制成每1 mL含0.2 mg的溶液，即得。
2.3 供试品溶液的制备 取本品20片，除去薄膜衣，精密称定，研细，取0.3 g，精密称定，精密加入甲醇20 mL，称定重量，加热回流15 min，放冷，再称定重量，用甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，滤液备用，精密量取续滤液2 mL，置10 mL量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀，即得。
3 方法学考察
3.1 线性关系考察 精密吸取对照品贮备溶液1 mL，2 mL，3 mL，4 mL，5 mL、6 mL、7 mL置10 mL容量瓶中，分别加甲醇稀释至刻度，配制成系列浓度的对照品溶液：A：龍胆苦苷0.0508 mg/mL;B：龙胆苦苷0.1016 mg/mL;C：龙胆苦苷0.1524 mg/mL;D：龙胆苦苷0.2032 mg/mL;E：龙胆苦苷0.2540 mg/mL;F：龙胆苦苷0.3048 mg/mL;G：龙胆苦苷0.3556 mg/mL;
在上述“色谱条件”下，测定峰面积，以对照品浓度作横坐标（X），峰面积作为纵坐标（Y）：线性回归方程Y= 4.9906e-008X-0.00094586，r=0.999909（n=7）;表明龙胆苦苷在0.0508mg/mL～0.3556mg/mL范围内具有良好的线性关系。（见表1）
表1 线性关系考察表
3.2 专属性试验 按处方比例，取去除坚龙胆药材，按生产工艺制备得阴性样品，并依“供试品溶液的制备”项下，同法处理后，制得阴性空白对照液，按前述色谱条件，分别对空白对照液，供试品溶液，对照品溶液各进样10 uL，测定。结果在空白对照色谱中，龙胆苦苷峰处无其它药物干扰。
3.3 重复性试验 称取批号为20100101的样品6份，照“供试品溶液的制备”项下方法进行处理。分别测定，龙胆苦苷的含量。结果龙胆苦苷平均含量为4.90 mg/片，RSD=1.7%（n=6），重复性良好。见表2。
表2 重复性试验结果
3.4 中间精密度 取批号为20100101的样品，分别由不同检验人员处理样品测定含量，结果见表3。
表3 中间精密度的考察结果
3.5 准确度试验 取重复性项下批号为20100101的样品6份各约0.15 g，分别精密加入龙胆苦苷对照品贮备溶液（含龙胆苦苷1.986mg/mL），照“供试品溶液的制备”项下的方法进行处理，按上述“色谱条件”进样，进行测定，测得平均回收率为 101.2%，RSD=1.2%（n=9）。见表4。
表4 加样回收率试验结果
3.6 稳定性试验 取本品20片，除去薄膜衣，精密称定，研细，取0.4 g，精密称定，精密加入甲醇20 mL，称定重量，加热回流15 min，放冷，再称定重量，用甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，滤液备用，精密量取续滤液2 mL，置10 mL量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀，即得。按含量测定方法测定8次，间隔时间为0、2、4、6、8、10、12、24 h，平均含量为4.89 mg/片，RSD=0.8 %（n=8），表明供试品溶液在24 h内稳定。见表5。
表5 稳定性试验结果
3.7 含量限度 取本品约0.1 g，0.2 g，0.3 g，0.4 g，0.5 g各2份，精密称定，置50 mL量瓶中，加甲醇适量，超声处理（功率120 W，频率40 KHz）40 min，取出，放冷，加甲醇至刻度，摇匀，滤过，弃去初滤液，取续滤液，即得，按含量测定方法分别测定，结果见表6。
表6 样品含量测定的结果
《中国药典》2010年版一部坚龙胆项下[含量测定]规定：坚龙胆按干燥品计算，含龙胆苦苷不得少于1.5%，以苦胆草片处方中坚龙胆处方量以完全不损失计，制成的成品中每片含龙胆苦苷的量为6.0mg，考虑到龙胆苦苷具有一定的挥发性及在制法过程之中的损失，且药材的产地、采收、加工等因素。将苦胆草片中每片含龙胆苦苷的含量以70%计，总量确定为不得少于2.0mg（即每片含坚龙胆以龙胆苦苷计，不得少于2.0mg）。
4 结论
结果表明苦胆草片[含量测定]项的方法，分离效果好，结果准确可靠，此方法是可行的。
坚龙胆为苦胆草片中的主药，其主要成分为龙胆苦苷，本实验有机溶剂进行提取，使所要测定的龙胆苦苷很好的分离。
坚龙胆来源于龙胆科植物滇龙胆Gentiana rigescens Franch 的干燥根和根茎。
含量测定法有内标法、外标法。自身对照法，面积归一化法，实验选用的是外标法，测定出对照品和供试品的峰面积，再对供试品的含量进行计算。
苦胆草片中只有坚龙胆一味药，生产工艺采用一半药材粉碎和一半提制膏，在生产过程的每一步骤，龙胆苦苷下降，故将苦胆草片中每片含龙胆苦苷的含量以70%计，总量确定为不得少于2.0mg。
参考文献：
[1]中华人民共和国卫生部药典委员会. 《中华人民共和国卫生部药品标准》.中药成方制剂[S].1998.
[3]中华人民共和国药典委员会.中华人民共和国药典2010年版（一部）[M].北京：中国医药科技出版社，2010.
（收稿日期：2018-03-09）
摘要：目的 对苦胆草片中龙胆苦苷的含量测定方法进行验证。方法 反相高效液相色谱法。色谱柱为Agilent TC-C18（150 mm×4.6 mm，5 um）柱，流动相为甲醇-水（25：75）;柱温为30℃;检测波长为270 nm，流速为0.8 mL/min。结果 龙胆苦苷在0.0508 mg/mL～0.3556mg/mL范围内有良好的线性关系，r=0.999909，平均加样回收率为101.2%，RSD=1.2%（n=9）。结论 该法分离效果好，结果准确、可靠，苦胆草片含量测定的方法可行。
关键词：苦胆草片;龙胆苦苷;含量测定;高效液相色谱法
中图分类号：R927.2 文献标志码：A 文章编号：1007-2349（2018）07-0074-03
苦胆草片在原标准糖衣片（《中华人民共和国卫生部药品标准》中药成方制剂第八册（WS3-B-1555-93）[1]的基础上增加薄膜衣片，薄膜衣片具有生产周期短（3～4 h）、用料少、衣片增重小（小于3%）、衣层机械强度及抗湿、热性好，对药物的崩解影响小以及制剂色泽稳定、美观等优点。现上市的剂型苦胆草片（糖衣片）（WS3-B-1555-93），无含量测定项，笔者认为不足以控制本品的质量，由于本品中仅由坚龙胆一味药材制成，通过参照《中国药典》2010年版一部[2]龙胆药材项中坚龙胆的[含量测定]项和《中国药典》2010版第一部（附录ⅩⅧA）中药质量标准分析方法验证指导原则，对苦胆草片的含量测定方法进行验证。
1 仪器、试药和试剂
1.1 仪器 高效液相色谱仪：型号：岛津LC-2010AHT SHIMADZU（包括输液泵、自动进样器、UV-Vis检测器、CLASS-VP色谱工作站）;电子天平：型号：BP211D Sartorius。
1.2 试药和试剂 样品预处理：所用试剂均为分析纯，高效液相分析所用甲醇为色谱纯，水为娃哈哈纯净水;对照品：龙胆苦苷 中国药品生物制品检定所 编号：110770-200712;样品：云南滇中药业有限公司生产的苦胆草片批号：20100101、20100102、20100103。
2 实验方法
2.1 色谱条件 色谱柱：Agilent TC-C18 5um色谱柱（4.6×150 mm）;流动相：甲醇-水（25：75）;柱温：30℃;检测波长：270 nm;流速：0.8 mL/min;进样量：10 uL;理论塔板数按龙胆苦苷峰计算应不低于3000。
2.2 对照品贮备溶液的制备 精密称取在五氧化二磷干燥器中干燥12 h龙胆苦苷对照品适量，加甲醇制成每1 mL含0.2 mg的溶液，即得。
2.3 供试品溶液的制备 取本品20片，除去薄膜衣，精密称定，研细，取0.3 g，精密称定，精密加入甲醇20 mL，称定重量，加热回流15 min，放冷，再称定重量，用甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，滤液备用，精密量取续滤液2 mL，置10 mL量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀，即得。
3 方法学考察
3.1 线性关系考察 精密吸取对照品贮备溶液1 mL，2 mL，3 mL，4 mL，5 mL、6 mL、7 mL置10 mL容量瓶中，分别加甲醇稀释至刻度，配制成系列浓度的对照品溶液：A：龍胆苦苷0.0508 mg/mL;B：龙胆苦苷0.1016 mg/mL;C：龙胆苦苷0.1524 mg/mL;D：龙胆苦苷0.2032 mg/mL;E：龙胆苦苷0.2540 mg/mL;F：龙胆苦苷0.3048 mg/mL;G：龙胆苦苷0.3556 mg/mL;
在上述“色谱条件”下，测定峰面积，以对照品浓度作横坐标（X），峰面积作为纵坐标（Y）：线性回归方程Y= 4.9906e-008X-0.00094586，r=0.999909（n=7）;表明龙胆苦苷在0.0508mg/mL～0.3556mg/mL范围内具有良好的线性关系。（见表1）
表1 线性关系考察表
3.2 专属性试验 按处方比例，取去除坚龙胆药材，按生产工艺制备得阴性样品，并依“供试品溶液的制备”项下，同法处理后，制得阴性空白对照液，按前述色谱条件，分别对空白对照液，供试品溶液，对照品溶液各进样10 uL，测定。结果在空白对照色谱中，龙胆苦苷峰处无其它药物干扰。
3.3 重复性试验 称取批号为20100101的样品6份，照“供试品溶液的制备”项下方法进行处理。分别测定，龙胆苦苷的含量。结果龙胆苦苷平均含量为4.90 mg/片，RSD=1.7%（n=6），重复性良好。见表2。
表2 重复性试验结果
3.4 中间精密度 取批号为20100101的样品，分别由不同检验人员处理样品测定含量，结果见表3。
表3 中间精密度的考察结果
3.5 准确度试验 取重复性项下批号为20100101的样品6份各约0.15 g，分别精密加入龙胆苦苷对照品贮备溶液（含龙胆苦苷1.986mg/mL），照“供试品溶液的制备”项下的方法进行处理，按上述“色谱条件”进样，进行测定，测得平均回收率为 101.2%，RSD=1.2%（n=9）。见表4。
表4 加样回收率试验结果
3.6 稳定性试验 取本品20片，除去薄膜衣，精密称定，研细，取0.4 g，精密称定，精密加入甲醇20 mL，称定重量，加热回流15 min，放冷，再称定重量，用甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，滤液备用，精密量取续滤液2 mL，置10 mL量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀，即得。按含量测定方法测定8次，间隔时间为0、2、4、6、8、10、12、24 h，平均含量为4.89 mg/片，RSD=0.8 %（n=8），表明供试品溶液在24 h内稳定。见表5。
表5 稳定性试验结果
3.7 含量限度 取本品约0.1 g，0.2 g，0.3 g，0.4 g，0.5 g各2份，精密称定，置50 mL量瓶中，加甲醇适量，超声处理（功率120 W，频率40 KHz）40 min，取出，放冷，加甲醇至刻度，摇匀，滤过，弃去初滤液，取续滤液，即得，按含量测定方法分别测定，结果见表6。
表6 样品含量测定的结果
《中国药典》2010年版一部坚龙胆项下[含量测定]规定：坚龙胆按干燥品计算，含龙胆苦苷不得少于1.5%，以苦胆草片处方中坚龙胆处方量以完全不损失计，制成的成品中每片含龙胆苦苷的量为6.0mg，考虑到龙胆苦苷具有一定的挥发性及在制法过程之中的损失，且药材的产地、采收、加工等因素。将苦胆草片中每片含龙胆苦苷的含量以70%计，总量确定为不得少于2.0mg（即每片含坚龙胆以龙胆苦苷计，不得少于2.0mg）。
4 结论
结果表明苦胆草片[含量测定]项的方法，分离效果好，结果准确可靠，此方法是可行的。
坚龙胆为苦胆草片中的主药，其主要成分为龙胆苦苷，本实验有机溶剂进行提取，使所要测定的龙胆苦苷很好的分离。
坚龙胆来源于龙胆科植物滇龙胆Gentiana rigescens Franch 的干燥根和根茎。
含量测定法有内标法、外标法。自身对照法，面积归一化法，实验选用的是外标法，测定出对照品和供试品的峰面积，再对供试品的含量进行计算。
苦胆草片中只有坚龙胆一味药，生产工艺采用一半药材粉碎和一半提制膏，在生产过程的每一步骤，龙胆苦苷下降，故将苦胆草片中每片含龙胆苦苷的含量以70%计，总量确定为不得少于2.0mg。
参考文献：
[1]中华人民共和国卫生部药典委员会. 《中华人民共和国卫生部药品标准》.中药成方制剂[S].1998.
[3]中华人民共和国药典委员会.中华人民共和国药典2010年版（一部）[M].北京：中国医药科技出版社，2010.
（收稿日期：2018-03-09）
