以环糊精准聚轮烷为“假载体”印迹识别蛋白质的研究
张芸 郭敏杰等
摘要 实验以聚乙烯醇分子为客体分子，与γ环糊精（γCD）分子组装制备环糊精准聚轮烷（CDPPRs）；在金属离子存在下，以丙烯酰胺（AM）为单体，N，N亚甲基双丙烯酰胺为交联剂，以CDPPRs为“假载体”，制备了以牛血清白蛋白（BSA）为模板的分子印迹聚合物（cpMIP）。结果表明，随着功能基化CDPPRs（CDPPRsAc）用量增加，印迹聚合物吸附量先增加后减小，当CDPPRsAc与AM的质量比为0.55时，印迹聚合物的吸附量最大；在Cu2+共存时，吸附量最高可达5.16 mg/g；将cpMIP用于4种混合蛋白溶液吸附，结果表明， 引入CDPPRs使印迹聚合物的特异性吸附能力明显提高，特异性吸附量可提高约6倍。
关键词 分子印迹聚合物； 聚乙烯醇； 环糊精准聚轮烷； 假载体； 蛋白质吸附
1引言
蛋白质分子印迹聚合物（MIPs）是在模板蛋白存在下通过功能单体交联聚合而成[1，2]，MIPs可以选择性地从混合物中吸附分离模板蛋白，其制备方法主要有包埋法[3]、表面印迹法[4]，抗原决定基法[5]、辅助识别链辅助法[6，7]、碳纳米管为载体法[8]及借助某些物质或载体在二维或三维空间上进行蛋白质印迹[9]方法等。环糊精（CD）与链状大分子通过非共价键相互作用组装超分子聚集体，可形成准聚轮烷或者聚轮烷（CDPPRs）[10]。目前，CD用于印迹氨基酸、多肽的研究较多[11]，用于蛋白质分子印迹的研究很少[12]。 Zhang等[13]以硅胶为载体，将βCD与丙烯酰胺进行键合制备MIPs。Nagaoka等[14]将环糊精引入印迹体系，以三肽为模板分子，分别在硅胶、氧化铝薄膜及聚羟乙基丙烯酸甲酯表面制备了印迹聚合物。
本实验将环糊精准聚轮烷充当“假载体”，参与交联聚合过程而被固定在聚合物网络中，以实现功能单体与目标分子良好的空间匹配，从而达到对模板蛋白的专一性识别[15]。印迹吸附过程见图1。本实验提出的环糊精准聚轮烷这种“假载体”有别于小分子单体，由于CD是低聚环状物，结构类似一截顶圆锥，它能够在体系聚合过程中在横向和纵向空间上较好的维持与蛋白质匹配的空间结构而区别于普通的包埋法印迹。CD的空腔直径约为1 nm，其纵向尺寸也不超过10 nm， 因此对多数三维线长在10 nm这个数量级上的蛋白质而言， CDPPRs并不提供一个真正的载体作用，因而称之为“假载体”。
2实验部分
2.1仪器与试剂
DYCZ24DN型电泳仪（北京市六一仪器厂）； TU1800PC紫外可见分光光度计（北京普析通用仪器有限责任公司）； MIPAⅡXMU/H扫描电镜（美国SIRION公司）。
聚乙烯醇（PVA，醇解度80%，MW=9000～10000，日本Kuraray公司）； γ环糊精（γCD， 药品级， 德国Wacker公司）； 牛血清白蛋白第V组分（BSA）、大豆蛋白酶抑制剂（SBTL）、卵清蛋白（OVA）、溶菌酶（LYS），天津博迪化工有限公司；其余试剂均为国产分析纯。
2.2实验方法
2.2.1CDPPRs的制备称1.00 g PVA于100 mL圆底烧瓶中，用20.0 mL水溶解；加入3.00 g γCD， 80 ℃下回流12 h，在室温下静置12 h，循环5次。将反应物用乙醇沉淀，经水洗、分离、真空干燥，制得CDPPRs。称2.00 g CDPPRs，溶于40.0 mL二甲基亚砜中，逐滴加入2.00 mL 丙烯酰氯（AC）。4 h后，用乙醇沉淀，用乙醚洗涤，真空干燥后得到CDPPRsAc。
2.2.2印迹聚合物MIPs的制备依次将丙烯酰胺AM、N，N′亚甲基双丙烯酰胺MBA、CDPPRsAc、模板蛋白BSA加入到装有20.0 mL去离子水的三口烧瓶中，冰水浴中搅拌1 h，通氮气，加入过硫酸铵（APS），继续搅拌0.5 h后加入Na2SO3溶液，40℃反应4 h，得到cpMIPs。空白印迹聚合物NMIP的合成，除不加入模板分子外，其它与制备cpMIPs印迹聚合物的方法相同；对比组印迹聚合物aMIP的合成，除不加CDPPRsAc外，其它与制备cpMIPs印迹聚合物的方法相同。
2.2.3 印迹聚合物吸附性能测试（1）吸附动力学实验将各组MIPs加入到0.50 g/L BSA溶液中，于4 ℃吸附，分别于0.5，1.0，1.5，2.0，2.5，3.0，6.0，12.0和24.0 h取上层清液1.0 mL，检测MIPs对模板蛋白BSA的吸附量Q。（2）竞争吸附实验称取1.00 g 各组MIPs，加入到10 mL蛋白质混合溶液（BSA，LYS，OVA和SBTL浓度均为0.50 g/L）中，4 ℃吸附12 h。取聚合物各0.10 g，依次用1.0 mL的0.15， 0.50和2.0 mol/L的KCl溶液洗涤。取洗脱蛋白液各10 μL上样，恒流条件下进行十二烷基磺酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDSPAGE），用考马斯蓝染色进行分析。
3结果与讨论
3.1CDPPRs结构分析
CD为高旋光性物质，PVA旋光度为零，当两者形成组装体后，分子的空间形象及分子对称性发生了较大的改变。两者混合物的比旋光度与γCD的比旋光度相同，均为+175°；而组装体的比旋光度为+85°，初步证明聚乙烯醇与γ环糊精进行了包结。
CDPPRs的核磁谱图（图2c）进一步证明主客体间的各种弱作用相互叠加形成了较强的超分子作用。3.7～3.9 ppm的峰是γCD的3，5位的质子和PVA分子链上与羟基相连碳上的质子的共同贡献，对比图2b与2c可见，该部分贡献并不是γCD与聚乙烯醇两种物质质子的简单物理加和，峰形已经发生变化。
3.2蛋白质印迹聚合物的制备
3.2.1CDPPRsAc的含量对MIPs吸附量的影响在实验范围内，随着CDPPRsAc用量的增加，印迹聚合物的吸附量增大（图4），这应归因于环糊精准聚轮烷的引入使识别位点增多。当CDPPRsAc用量继续增加时，印迹聚合物的吸附量下降，这可能是因为过多的环糊精准聚轮烷使得印迹聚合物的交联过于密集，不利于印迹聚合物的识别。在实验范围内，当CDPPRsAc与AM的质量比为1.1时，此时的印迹聚合物的吸附量最大，为3.54 mg/g。
3.2.2金属离子用量对MIPs吸附量的影响金属离子可以特异性地键合蛋白质的某些官能团。分别使用Ni2+和Cu2+辅助蛋白质印迹识别过程，金属离子与模板所形成的空间取向，在环糊精准聚轮烷所在的聚合网络结构中能够被较好地保留下来，因此可提高对模板分子的选择性识别（表1）。加入金属离子的MIPs比未加入金属离子的MIPs吸附量高，这可能是因为加入金属离子后，CDPPRAc、功能单体与模板蛋白之间可以通过金属离子形成稳定的配位作用，从而产生了更多的有效识别位点，提高对模板蛋白的识别能力。实验范围内，引入Cu2+的MIPs对模板蛋白的吸附量比引入Ni2+的MIPs要高一些。
摘要 实验以聚乙烯醇分子为客体分子，与γ环糊精（γCD）分子组装制备环糊精准聚轮烷（CDPPRs）；在金属离子存在下，以丙烯酰胺（AM）为单体，N，N亚甲基双丙烯酰胺为交联剂，以CDPPRs为“假载体”，制备了以牛血清白蛋白（BSA）为模板的分子印迹聚合物（cpMIP）。结果表明，随着功能基化CDPPRs（CDPPRsAc）用量增加，印迹聚合物吸附量先增加后减小，当CDPPRsAc与AM的质量比为0.55时，印迹聚合物的吸附量最大；在Cu2+共存时，吸附量最高可达5.16 mg/g；将cpMIP用于4种混合蛋白溶液吸附，结果表明， 引入CDPPRs使印迹聚合物的特异性吸附能力明显提高，特异性吸附量可提高约6倍。
关键词 分子印迹聚合物； 聚乙烯醇； 环糊精准聚轮烷； 假载体； 蛋白质吸附
1引言
蛋白质分子印迹聚合物（MIPs）是在模板蛋白存在下通过功能单体交联聚合而成[1，2]，MIPs可以选择性地从混合物中吸附分离模板蛋白，其制备方法主要有包埋法[3]、表面印迹法[4]，抗原决定基法[5]、辅助识别链辅助法[6，7]、碳纳米管为载体法[8]及借助某些物质或载体在二维或三维空间上进行蛋白质印迹[9]方法等。环糊精（CD）与链状大分子通过非共价键相互作用组装超分子聚集体，可形成准聚轮烷或者聚轮烷（CDPPRs）[10]。目前，CD用于印迹氨基酸、多肽的研究较多[11]，用于蛋白质分子印迹的研究很少[12]。 Zhang等[13]以硅胶为载体，将βCD与丙烯酰胺进行键合制备MIPs。Nagaoka等[14]将环糊精引入印迹体系，以三肽为模板分子，分别在硅胶、氧化铝薄膜及聚羟乙基丙烯酸甲酯表面制备了印迹聚合物。
本实验将环糊精准聚轮烷充当“假载体”，参与交联聚合过程而被固定在聚合物网络中，以实现功能单体与目标分子良好的空间匹配，从而达到对模板蛋白的专一性识别[15]。印迹吸附过程见图1。本实验提出的环糊精准聚轮烷这种“假载体”有别于小分子单体，由于CD是低聚环状物，结构类似一截顶圆锥，它能够在体系聚合过程中在横向和纵向空间上较好的维持与蛋白质匹配的空间结构而区别于普通的包埋法印迹。CD的空腔直径约为1 nm，其纵向尺寸也不超过10 nm， 因此对多数三维线长在10 nm这个数量级上的蛋白质而言， CDPPRs并不提供一个真正的载体作用，因而称之为“假载体”。
2实验部分
2.1仪器与试剂
DYCZ24DN型电泳仪（北京市六一仪器厂）； TU1800PC紫外可见分光光度计（北京普析通用仪器有限责任公司）； MIPAⅡXMU/H扫描电镜（美国SIRION公司）。
聚乙烯醇（PVA，醇解度80%，MW=9000～10000，日本Kuraray公司）； γ环糊精（γCD， 药品级， 德国Wacker公司）； 牛血清白蛋白第V组分（BSA）、大豆蛋白酶抑制剂（SBTL）、卵清蛋白（OVA）、溶菌酶（LYS），天津博迪化工有限公司；其余试剂均为国产分析纯。
2.2实验方法
2.2.1CDPPRs的制备称1.00 g PVA于100 mL圆底烧瓶中，用20.0 mL水溶解；加入3.00 g γCD， 80 ℃下回流12 h，在室温下静置12 h，循环5次。将反应物用乙醇沉淀，经水洗、分离、真空干燥，制得CDPPRs。称2.00 g CDPPRs，溶于40.0 mL二甲基亚砜中，逐滴加入2.00 mL 丙烯酰氯（AC）。4 h后，用乙醇沉淀，用乙醚洗涤，真空干燥后得到CDPPRsAc。
2.2.2印迹聚合物MIPs的制备依次将丙烯酰胺AM、N，N′亚甲基双丙烯酰胺MBA、CDPPRsAc、模板蛋白BSA加入到装有20.0 mL去离子水的三口烧瓶中，冰水浴中搅拌1 h，通氮气，加入过硫酸铵（APS），继续搅拌0.5 h后加入Na2SO3溶液，40℃反应4 h，得到cpMIPs。空白印迹聚合物NMIP的合成，除不加入模板分子外，其它与制备cpMIPs印迹聚合物的方法相同；对比组印迹聚合物aMIP的合成，除不加CDPPRsAc外，其它与制备cpMIPs印迹聚合物的方法相同。
2.2.3 印迹聚合物吸附性能测试（1）吸附动力学实验将各组MIPs加入到0.50 g/L BSA溶液中，于4 ℃吸附，分别于0.5，1.0，1.5，2.0，2.5，3.0，6.0，12.0和24.0 h取上层清液1.0 mL，检测MIPs对模板蛋白BSA的吸附量Q。（2）竞争吸附实验称取1.00 g 各组MIPs，加入到10 mL蛋白质混合溶液（BSA，LYS，OVA和SBTL浓度均为0.50 g/L）中，4 ℃吸附12 h。取聚合物各0.10 g，依次用1.0 mL的0.15， 0.50和2.0 mol/L的KCl溶液洗涤。取洗脱蛋白液各10 μL上样，恒流条件下进行十二烷基磺酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDSPAGE），用考马斯蓝染色进行分析。
3结果与讨论
3.1CDPPRs结构分析
CD为高旋光性物质，PVA旋光度为零，当两者形成组装体后，分子的空间形象及分子对称性发生了较大的改变。两者混合物的比旋光度与γCD的比旋光度相同，均为+175°；而组装体的比旋光度为+85°，初步证明聚乙烯醇与γ环糊精进行了包结。
CDPPRs的核磁谱图（图2c）进一步证明主客体间的各种弱作用相互叠加形成了较强的超分子作用。3.7～3.9 ppm的峰是γCD的3，5位的质子和PVA分子链上与羟基相连碳上的质子的共同贡献，对比图2b与2c可见，该部分贡献并不是γCD与聚乙烯醇两种物质质子的简单物理加和，峰形已经发生变化。
3.2蛋白质印迹聚合物的制备
3.2.1CDPPRsAc的含量对MIPs吸附量的影响在实验范围内，随着CDPPRsAc用量的增加，印迹聚合物的吸附量增大（图4），这应归因于环糊精准聚轮烷的引入使识别位点增多。当CDPPRsAc用量继续增加时，印迹聚合物的吸附量下降，这可能是因为过多的环糊精准聚轮烷使得印迹聚合物的交联过于密集，不利于印迹聚合物的识别。在实验范围内，当CDPPRsAc与AM的质量比为1.1时，此时的印迹聚合物的吸附量最大，为3.54 mg/g。
3.2.2金属离子用量对MIPs吸附量的影响金属离子可以特异性地键合蛋白质的某些官能团。分别使用Ni2+和Cu2+辅助蛋白质印迹识别过程，金属离子与模板所形成的空间取向，在环糊精准聚轮烷所在的聚合网络结构中能够被较好地保留下来，因此可提高对模板分子的选择性识别（表1）。加入金属离子的MIPs比未加入金属离子的MIPs吸附量高，这可能是因为加入金属离子后，CDPPRAc、功能单体与模板蛋白之间可以通过金属离子形成稳定的配位作用，从而产生了更多的有效识别位点，提高对模板蛋白的识别能力。实验范围内，引入Cu2+的MIPs对模板蛋白的吸附量比引入Ni2+的MIPs要高一些。
摘要 实验以聚乙烯醇分子为客体分子，与γ环糊精（γCD）分子组装制备环糊精准聚轮烷（CDPPRs）；在金属离子存在下，以丙烯酰胺（AM）为单体，N，N亚甲基双丙烯酰胺为交联剂，以CDPPRs为“假载体”，制备了以牛血清白蛋白（BSA）为模板的分子印迹聚合物（cpMIP）。结果表明，随着功能基化CDPPRs（CDPPRsAc）用量增加，印迹聚合物吸附量先增加后减小，当CDPPRsAc与AM的质量比为0.55时，印迹聚合物的吸附量最大；在Cu2+共存时，吸附量最高可达5.16 mg/g；将cpMIP用于4种混合蛋白溶液吸附，结果表明， 引入CDPPRs使印迹聚合物的特异性吸附能力明显提高，特异性吸附量可提高约6倍。
关键词 分子印迹聚合物； 聚乙烯醇； 环糊精准聚轮烷； 假载体； 蛋白质吸附
1引言
蛋白质分子印迹聚合物（MIPs）是在模板蛋白存在下通过功能单体交联聚合而成[1，2]，MIPs可以选择性地从混合物中吸附分离模板蛋白，其制备方法主要有包埋法[3]、表面印迹法[4]，抗原决定基法[5]、辅助识别链辅助法[6，7]、碳纳米管为载体法[8]及借助某些物质或载体在二维或三维空间上进行蛋白质印迹[9]方法等。环糊精（CD）与链状大分子通过非共价键相互作用组装超分子聚集体，可形成准聚轮烷或者聚轮烷（CDPPRs）[10]。目前，CD用于印迹氨基酸、多肽的研究较多[11]，用于蛋白质分子印迹的研究很少[12]。 Zhang等[13]以硅胶为载体，将βCD与丙烯酰胺进行键合制备MIPs。Nagaoka等[14]将环糊精引入印迹体系，以三肽为模板分子，分别在硅胶、氧化铝薄膜及聚羟乙基丙烯酸甲酯表面制备了印迹聚合物。
本实验将环糊精准聚轮烷充当“假载体”，参与交联聚合过程而被固定在聚合物网络中，以实现功能单体与目标分子良好的空间匹配，从而达到对模板蛋白的专一性识别[15]。印迹吸附过程见图1。本实验提出的环糊精准聚轮烷这种“假载体”有别于小分子单体，由于CD是低聚环状物，结构类似一截顶圆锥，它能够在体系聚合过程中在横向和纵向空间上较好的维持与蛋白质匹配的空间结构而区别于普通的包埋法印迹。CD的空腔直径约为1 nm，其纵向尺寸也不超过10 nm， 因此对多数三维线长在10 nm这个数量级上的蛋白质而言， CDPPRs并不提供一个真正的载体作用，因而称之为“假载体”。
2实验部分
2.1仪器与试剂
DYCZ24DN型电泳仪（北京市六一仪器厂）； TU1800PC紫外可见分光光度计（北京普析通用仪器有限责任公司）； MIPAⅡXMU/H扫描电镜（美国SIRION公司）。
聚乙烯醇（PVA，醇解度80%，MW=9000～10000，日本Kuraray公司）； γ环糊精（γCD， 药品级， 德国Wacker公司）； 牛血清白蛋白第V组分（BSA）、大豆蛋白酶抑制剂（SBTL）、卵清蛋白（OVA）、溶菌酶（LYS），天津博迪化工有限公司；其余试剂均为国产分析纯。
2.2实验方法
2.2.1CDPPRs的制备称1.00 g PVA于100 mL圆底烧瓶中，用20.0 mL水溶解；加入3.00 g γCD， 80 ℃下回流12 h，在室温下静置12 h，循环5次。将反应物用乙醇沉淀，经水洗、分离、真空干燥，制得CDPPRs。称2.00 g CDPPRs，溶于40.0 mL二甲基亚砜中，逐滴加入2.00 mL 丙烯酰氯（AC）。4 h后，用乙醇沉淀，用乙醚洗涤，真空干燥后得到CDPPRsAc。
2.2.2印迹聚合物MIPs的制备依次将丙烯酰胺AM、N，N′亚甲基双丙烯酰胺MBA、CDPPRsAc、模板蛋白BSA加入到装有20.0 mL去离子水的三口烧瓶中，冰水浴中搅拌1 h，通氮气，加入过硫酸铵（APS），继续搅拌0.5 h后加入Na2SO3溶液，40℃反应4 h，得到cpMIPs。空白印迹聚合物NMIP的合成，除不加入模板分子外，其它与制备cpMIPs印迹聚合物的方法相同；对比组印迹聚合物aMIP的合成，除不加CDPPRsAc外，其它与制备cpMIPs印迹聚合物的方法相同。
2.2.3 印迹聚合物吸附性能测试（1）吸附动力学实验将各组MIPs加入到0.50 g/L BSA溶液中，于4 ℃吸附，分别于0.5，1.0，1.5，2.0，2.5，3.0，6.0，12.0和24.0 h取上层清液1.0 mL，检测MIPs对模板蛋白BSA的吸附量Q。（2）竞争吸附实验称取1.00 g 各组MIPs，加入到10 mL蛋白质混合溶液（BSA，LYS，OVA和SBTL浓度均为0.50 g/L）中，4 ℃吸附12 h。取聚合物各0.10 g，依次用1.0 mL的0.15， 0.50和2.0 mol/L的KCl溶液洗涤。取洗脱蛋白液各10 μL上样，恒流条件下进行十二烷基磺酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDSPAGE），用考马斯蓝染色进行分析。
3结果与讨论
3.1CDPPRs结构分析
CD为高旋光性物质，PVA旋光度为零，当两者形成组装体后，分子的空间形象及分子对称性发生了较大的改变。两者混合物的比旋光度与γCD的比旋光度相同，均为+175°；而组装体的比旋光度为+85°，初步证明聚乙烯醇与γ环糊精进行了包结。
CDPPRs的核磁谱图（图2c）进一步证明主客体间的各种弱作用相互叠加形成了较强的超分子作用。3.7～3.9 ppm的峰是γCD的3，5位的质子和PVA分子链上与羟基相连碳上的质子的共同贡献，对比图2b与2c可见，该部分贡献并不是γCD与聚乙烯醇两种物质质子的简单物理加和，峰形已经发生变化。
3.2蛋白质印迹聚合物的制备
3.2.1CDPPRsAc的含量对MIPs吸附量的影响在实验范围内，随着CDPPRsAc用量的增加，印迹聚合物的吸附量增大（图4），这应归因于环糊精准聚轮烷的引入使识别位点增多。当CDPPRsAc用量继续增加时，印迹聚合物的吸附量下降，这可能是因为过多的环糊精准聚轮烷使得印迹聚合物的交联过于密集，不利于印迹聚合物的识别。在实验范围内，当CDPPRsAc与AM的质量比为1.1时，此时的印迹聚合物的吸附量最大，为3.54 mg/g。
3.2.2金属离子用量对MIPs吸附量的影响金属离子可以特异性地键合蛋白质的某些官能团。分别使用Ni2+和Cu2+辅助蛋白质印迹识别过程，金属离子与模板所形成的空间取向，在环糊精准聚轮烷所在的聚合网络结构中能够被较好地保留下来，因此可提高对模板分子的选择性识别（表1）。加入金属离子的MIPs比未加入金属离子的MIPs吸附量高，这可能是因为加入金属离子后，CDPPRAc、功能单体与模板蛋白之间可以通过金属离子形成稳定的配位作用，从而产生了更多的有效识别位点，提高对模板蛋白的识别能力。实验范围内，引入Cu2+的MIPs对模板蛋白的吸附量比引入Ni2+的MIPs要高一些。
摘要 实验以聚乙烯醇分子为客体分子，与γ环糊精（γCD）分子组装制备环糊精准聚轮烷（CDPPRs）；在金属离子存在下，以丙烯酰胺（AM）为单体，N，N亚甲基双丙烯酰胺为交联剂，以CDPPRs为“假载体”，制备了以牛血清白蛋白（BSA）为模板的分子印迹聚合物（cpMIP）。结果表明，随着功能基化CDPPRs（CDPPRsAc）用量增加，印迹聚合物吸附量先增加后减小，当CDPPRsAc与AM的质量比为0.55时，印迹聚合物的吸附量最大；在Cu2+共存时，吸附量最高可达5.16 mg/g；将cpMIP用于4种混合蛋白溶液吸附，结果表明， 引入CDPPRs使印迹聚合物的特异性吸附能力明显提高，特异性吸附量可提高约6倍。
关键词 分子印迹聚合物； 聚乙烯醇； 环糊精准聚轮烷； 假载体； 蛋白质吸附
1引言
蛋白质分子印迹聚合物（MIPs）是在模板蛋白存在下通过功能单体交联聚合而成[1，2]，MIPs可以选择性地从混合物中吸附分离模板蛋白，其制备方法主要有包埋法[3]、表面印迹法[4]，抗原决定基法[5]、辅助识别链辅助法[6，7]、碳纳米管为载体法[8]及借助某些物质或载体在二维或三维空间上进行蛋白质印迹[9]方法等。环糊精（CD）与链状大分子通过非共价键相互作用组装超分子聚集体，可形成准聚轮烷或者聚轮烷（CDPPRs）[10]。目前，CD用于印迹氨基酸、多肽的研究较多[11]，用于蛋白质分子印迹的研究很少[12]。 Zhang等[13]以硅胶为载体，将βCD与丙烯酰胺进行键合制备MIPs。Nagaoka等[14]将环糊精引入印迹体系，以三肽为模板分子，分别在硅胶、氧化铝薄膜及聚羟乙基丙烯酸甲酯表面制备了印迹聚合物。
本实验将环糊精准聚轮烷充当“假载体”，参与交联聚合过程而被固定在聚合物网络中，以实现功能单体与目标分子良好的空间匹配，从而达到对模板蛋白的专一性识别[15]。印迹吸附过程见图1。本实验提出的环糊精准聚轮烷这种“假载体”有别于小分子单体，由于CD是低聚环状物，结构类似一截顶圆锥，它能够在体系聚合过程中在横向和纵向空间上较好的维持与蛋白质匹配的空间结构而区别于普通的包埋法印迹。CD的空腔直径约为1 nm，其纵向尺寸也不超过10 nm， 因此对多数三维线长在10 nm这个数量级上的蛋白质而言， CDPPRs并不提供一个真正的载体作用，因而称之为“假载体”。
2实验部分
2.1仪器与试剂
DYCZ24DN型电泳仪（北京市六一仪器厂）； TU1800PC紫外可见分光光度计（北京普析通用仪器有限责任公司）； MIPAⅡXMU/H扫描电镜（美国SIRION公司）。
聚乙烯醇（PVA，醇解度80%，MW=9000～10000，日本Kuraray公司）； γ环糊精（γCD， 药品级， 德国Wacker公司）； 牛血清白蛋白第V组分（BSA）、大豆蛋白酶抑制剂（SBTL）、卵清蛋白（OVA）、溶菌酶（LYS），天津博迪化工有限公司；其余试剂均为国产分析纯。
2.2实验方法
2.2.1CDPPRs的制备称1.00 g PVA于100 mL圆底烧瓶中，用20.0 mL水溶解；加入3.00 g γCD， 80 ℃下回流12 h，在室温下静置12 h，循环5次。将反应物用乙醇沉淀，经水洗、分离、真空干燥，制得CDPPRs。称2.00 g CDPPRs，溶于40.0 mL二甲基亚砜中，逐滴加入2.00 mL 丙烯酰氯（AC）。4 h后，用乙醇沉淀，用乙醚洗涤，真空干燥后得到CDPPRsAc。
2.2.2印迹聚合物MIPs的制备依次将丙烯酰胺AM、N，N′亚甲基双丙烯酰胺MBA、CDPPRsAc、模板蛋白BSA加入到装有20.0 mL去离子水的三口烧瓶中，冰水浴中搅拌1 h，通氮气，加入过硫酸铵（APS），继续搅拌0.5 h后加入Na2SO3溶液，40℃反应4 h，得到cpMIPs。空白印迹聚合物NMIP的合成，除不加入模板分子外，其它与制备cpMIPs印迹聚合物的方法相同；对比组印迹聚合物aMIP的合成，除不加CDPPRsAc外，其它与制备cpMIPs印迹聚合物的方法相同。
2.2.3 印迹聚合物吸附性能测试（1）吸附动力学实验将各组MIPs加入到0.50 g/L BSA溶液中，于4 ℃吸附，分别于0.5，1.0，1.5，2.0，2.5，3.0，6.0，12.0和24.0 h取上层清液1.0 mL，检测MIPs对模板蛋白BSA的吸附量Q。（2）竞争吸附实验称取1.00 g 各组MIPs，加入到10 mL蛋白质混合溶液（BSA，LYS，OVA和SBTL浓度均为0.50 g/L）中，4 ℃吸附12 h。取聚合物各0.10 g，依次用1.0 mL的0.15， 0.50和2.0 mol/L的KCl溶液洗涤。取洗脱蛋白液各10 μL上样，恒流条件下进行十二烷基磺酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDSPAGE），用考马斯蓝染色进行分析。
3结果与讨论
3.1CDPPRs结构分析
CD为高旋光性物质，PVA旋光度为零，当两者形成组装体后，分子的空间形象及分子对称性发生了较大的改变。两者混合物的比旋光度与γCD的比旋光度相同，均为+175°；而组装体的比旋光度为+85°，初步证明聚乙烯醇与γ环糊精进行了包结。
CDPPRs的核磁谱图（图2c）进一步证明主客体间的各种弱作用相互叠加形成了较强的超分子作用。3.7～3.9 ppm的峰是γCD的3，5位的质子和PVA分子链上与羟基相连碳上的质子的共同贡献，对比图2b与2c可见，该部分贡献并不是γCD与聚乙烯醇两种物质质子的简单物理加和，峰形已经发生变化。
3.2蛋白质印迹聚合物的制备
3.2.1CDPPRsAc的含量对MIPs吸附量的影响在实验范围内，随着CDPPRsAc用量的增加，印迹聚合物的吸附量增大（图4），这应归因于环糊精准聚轮烷的引入使识别位点增多。当CDPPRsAc用量继续增加时，印迹聚合物的吸附量下降，这可能是因为过多的环糊精准聚轮烷使得印迹聚合物的交联过于密集，不利于印迹聚合物的识别。在实验范围内，当CDPPRsAc与AM的质量比为1.1时，此时的印迹聚合物的吸附量最大，为3.54 mg/g。
3.2.2金属离子用量对MIPs吸附量的影响金属离子可以特异性地键合蛋白质的某些官能团。分别使用Ni2+和Cu2+辅助蛋白质印迹识别过程，金属离子与模板所形成的空间取向，在环糊精准聚轮烷所在的聚合网络结构中能够被较好地保留下来，因此可提高对模板分子的选择性识别（表1）。加入金属离子的MIPs比未加入金属离子的MIPs吸附量高，这可能是因为加入金属离子后，CDPPRAc、功能单体与模板蛋白之间可以通过金属离子形成稳定的配位作用，从而产生了更多的有效识别位点，提高对模板蛋白的识别能力。实验范围内，引入Cu2+的MIPs对模板蛋白的吸附量比引入Ni2+的MIPs要高一些。
摘要 实验以聚乙烯醇分子为客体分子，与γ环糊精（γCD）分子组装制备环糊精准聚轮烷（CDPPRs）；在金属离子存在下，以丙烯酰胺（AM）为单体，N，N亚甲基双丙烯酰胺为交联剂，以CDPPRs为“假载体”，制备了以牛血清白蛋白（BSA）为模板的分子印迹聚合物（cpMIP）。结果表明，随着功能基化CDPPRs（CDPPRsAc）用量增加，印迹聚合物吸附量先增加后减小，当CDPPRsAc与AM的质量比为0.55时，印迹聚合物的吸附量最大；在Cu2+共存时，吸附量最高可达5.16 mg/g；将cpMIP用于4种混合蛋白溶液吸附，结果表明， 引入CDPPRs使印迹聚合物的特异性吸附能力明显提高，特异性吸附量可提高约6倍。
关键词 分子印迹聚合物； 聚乙烯醇； 环糊精准聚轮烷； 假载体； 蛋白质吸附
1引言
蛋白质分子印迹聚合物（MIPs）是在模板蛋白存在下通过功能单体交联聚合而成[1，2]，MIPs可以选择性地从混合物中吸附分离模板蛋白，其制备方法主要有包埋法[3]、表面印迹法[4]，抗原决定基法[5]、辅助识别链辅助法[6，7]、碳纳米管为载体法[8]及借助某些物质或载体在二维或三维空间上进行蛋白质印迹[9]方法等。环糊精（CD）与链状大分子通过非共价键相互作用组装超分子聚集体，可形成准聚轮烷或者聚轮烷（CDPPRs）[10]。目前，CD用于印迹氨基酸、多肽的研究较多[11]，用于蛋白质分子印迹的研究很少[12]。 Zhang等[13]以硅胶为载体，将βCD与丙烯酰胺进行键合制备MIPs。Nagaoka等[14]将环糊精引入印迹体系，以三肽为模板分子，分别在硅胶、氧化铝薄膜及聚羟乙基丙烯酸甲酯表面制备了印迹聚合物。
本实验将环糊精准聚轮烷充当“假载体”，参与交联聚合过程而被固定在聚合物网络中，以实现功能单体与目标分子良好的空间匹配，从而达到对模板蛋白的专一性识别[15]。印迹吸附过程见图1。本实验提出的环糊精准聚轮烷这种“假载体”有别于小分子单体，由于CD是低聚环状物，结构类似一截顶圆锥，它能够在体系聚合过程中在横向和纵向空间上较好的维持与蛋白质匹配的空间结构而区别于普通的包埋法印迹。CD的空腔直径约为1 nm，其纵向尺寸也不超过10 nm， 因此对多数三维线长在10 nm这个数量级上的蛋白质而言， CDPPRs并不提供一个真正的载体作用，因而称之为“假载体”。
2实验部分
2.1仪器与试剂
DYCZ24DN型电泳仪（北京市六一仪器厂）； TU1800PC紫外可见分光光度计（北京普析通用仪器有限责任公司）； MIPAⅡXMU/H扫描电镜（美国SIRION公司）。
聚乙烯醇（PVA，醇解度80%，MW=9000～10000，日本Kuraray公司）； γ环糊精（γCD， 药品级， 德国Wacker公司）； 牛血清白蛋白第V组分（BSA）、大豆蛋白酶抑制剂（SBTL）、卵清蛋白（OVA）、溶菌酶（LYS），天津博迪化工有限公司；其余试剂均为国产分析纯。
2.2实验方法
2.2.1CDPPRs的制备称1.00 g PVA于100 mL圆底烧瓶中，用20.0 mL水溶解；加入3.00 g γCD， 80 ℃下回流12 h，在室温下静置12 h，循环5次。将反应物用乙醇沉淀，经水洗、分离、真空干燥，制得CDPPRs。称2.00 g CDPPRs，溶于40.0 mL二甲基亚砜中，逐滴加入2.00 mL 丙烯酰氯（AC）。4 h后，用乙醇沉淀，用乙醚洗涤，真空干燥后得到CDPPRsAc。
2.2.2印迹聚合物MIPs的制备依次将丙烯酰胺AM、N，N′亚甲基双丙烯酰胺MBA、CDPPRsAc、模板蛋白BSA加入到装有20.0 mL去离子水的三口烧瓶中，冰水浴中搅拌1 h，通氮气，加入过硫酸铵（APS），继续搅拌0.5 h后加入Na2SO3溶液，40℃反应4 h，得到cpMIPs。空白印迹聚合物NMIP的合成，除不加入模板分子外，其它与制备cpMIPs印迹聚合物的方法相同；对比组印迹聚合物aMIP的合成，除不加CDPPRsAc外，其它与制备cpMIPs印迹聚合物的方法相同。
2.2.3 印迹聚合物吸附性能测试（1）吸附动力学实验将各组MIPs加入到0.50 g/L BSA溶液中，于4 ℃吸附，分别于0.5，1.0，1.5，2.0，2.5，3.0，6.0，12.0和24.0 h取上层清液1.0 mL，检测MIPs对模板蛋白BSA的吸附量Q。（2）竞争吸附实验称取1.00 g 各组MIPs，加入到10 mL蛋白质混合溶液（BSA，LYS，OVA和SBTL浓度均为0.50 g/L）中，4 ℃吸附12 h。取聚合物各0.10 g，依次用1.0 mL的0.15， 0.50和2.0 mol/L的KCl溶液洗涤。取洗脱蛋白液各10 μL上样，恒流条件下进行十二烷基磺酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDSPAGE），用考马斯蓝染色进行分析。
3结果与讨论
3.1CDPPRs结构分析
CD为高旋光性物质，PVA旋光度为零，当两者形成组装体后，分子的空间形象及分子对称性发生了较大的改变。两者混合物的比旋光度与γCD的比旋光度相同，均为+175°；而组装体的比旋光度为+85°，初步证明聚乙烯醇与γ环糊精进行了包结。
CDPPRs的核磁谱图（图2c）进一步证明主客体间的各种弱作用相互叠加形成了较强的超分子作用。3.7～3.9 ppm的峰是γCD的3，5位的质子和PVA分子链上与羟基相连碳上的质子的共同贡献，对比图2b与2c可见，该部分贡献并不是γCD与聚乙烯醇两种物质质子的简单物理加和，峰形已经发生变化。
3.2蛋白质印迹聚合物的制备
3.2.1CDPPRsAc的含量对MIPs吸附量的影响在实验范围内，随着CDPPRsAc用量的增加，印迹聚合物的吸附量增大（图4），这应归因于环糊精准聚轮烷的引入使识别位点增多。当CDPPRsAc用量继续增加时，印迹聚合物的吸附量下降，这可能是因为过多的环糊精准聚轮烷使得印迹聚合物的交联过于密集，不利于印迹聚合物的识别。在实验范围内，当CDPPRsAc与AM的质量比为1.1时，此时的印迹聚合物的吸附量最大，为3.54 mg/g。
3.2.2金属离子用量对MIPs吸附量的影响金属离子可以特异性地键合蛋白质的某些官能团。分别使用Ni2+和Cu2+辅助蛋白质印迹识别过程，金属离子与模板所形成的空间取向，在环糊精准聚轮烷所在的聚合网络结构中能够被较好地保留下来，因此可提高对模板分子的选择性识别（表1）。加入金属离子的MIPs比未加入金属离子的MIPs吸附量高，这可能是因为加入金属离子后，CDPPRAc、功能单体与模板蛋白之间可以通过金属离子形成稳定的配位作用，从而产生了更多的有效识别位点，提高对模板蛋白的识别能力。实验范围内，引入Cu2+的MIPs对模板蛋白的吸附量比引入Ni2+的MIPs要高一些。
摘要 实验以聚乙烯醇分子为客体分子，与γ环糊精（γCD）分子组装制备环糊精准聚轮烷（CDPPRs）；在金属离子存在下，以丙烯酰胺（AM）为单体，N，N亚甲基双丙烯酰胺为交联剂，以CDPPRs为“假载体”，制备了以牛血清白蛋白（BSA）为模板的分子印迹聚合物（cpMIP）。结果表明，随着功能基化CDPPRs（CDPPRsAc）用量增加，印迹聚合物吸附量先增加后减小，当CDPPRsAc与AM的质量比为0.55时，印迹聚合物的吸附量最大；在Cu2+共存时，吸附量最高可达5.16 mg/g；将cpMIP用于4种混合蛋白溶液吸附，结果表明， 引入CDPPRs使印迹聚合物的特异性吸附能力明显提高，特异性吸附量可提高约6倍。
关键词 分子印迹聚合物； 聚乙烯醇； 环糊精准聚轮烷； 假载体； 蛋白质吸附
1引言
蛋白质分子印迹聚合物（MIPs）是在模板蛋白存在下通过功能单体交联聚合而成[1，2]，MIPs可以选择性地从混合物中吸附分离模板蛋白，其制备方法主要有包埋法[3]、表面印迹法[4]，抗原决定基法[5]、辅助识别链辅助法[6，7]、碳纳米管为载体法[8]及借助某些物质或载体在二维或三维空间上进行蛋白质印迹[9]方法等。环糊精（CD）与链状大分子通过非共价键相互作用组装超分子聚集体，可形成准聚轮烷或者聚轮烷（CDPPRs）[10]。目前，CD用于印迹氨基酸、多肽的研究较多[11]，用于蛋白质分子印迹的研究很少[12]。 Zhang等[13]以硅胶为载体，将βCD与丙烯酰胺进行键合制备MIPs。Nagaoka等[14]将环糊精引入印迹体系，以三肽为模板分子，分别在硅胶、氧化铝薄膜及聚羟乙基丙烯酸甲酯表面制备了印迹聚合物。
本实验将环糊精准聚轮烷充当“假载体”，参与交联聚合过程而被固定在聚合物网络中，以实现功能单体与目标分子良好的空间匹配，从而达到对模板蛋白的专一性识别[15]。印迹吸附过程见图1。本实验提出的环糊精准聚轮烷这种“假载体”有别于小分子单体，由于CD是低聚环状物，结构类似一截顶圆锥，它能够在体系聚合过程中在横向和纵向空间上较好的维持与蛋白质匹配的空间结构而区别于普通的包埋法印迹。CD的空腔直径约为1 nm，其纵向尺寸也不超过10 nm， 因此对多数三维线长在10 nm这个数量级上的蛋白质而言， CDPPRs并不提供一个真正的载体作用，因而称之为“假载体”。
2实验部分
2.1仪器与试剂
DYCZ24DN型电泳仪（北京市六一仪器厂）； TU1800PC紫外可见分光光度计（北京普析通用仪器有限责任公司）； MIPAⅡXMU/H扫描电镜（美国SIRION公司）。
聚乙烯醇（PVA，醇解度80%，MW=9000～10000，日本Kuraray公司）； γ环糊精（γCD， 药品级， 德国Wacker公司）； 牛血清白蛋白第V组分（BSA）、大豆蛋白酶抑制剂（SBTL）、卵清蛋白（OVA）、溶菌酶（LYS），天津博迪化工有限公司；其余试剂均为国产分析纯。
2.2实验方法
2.2.1CDPPRs的制备称1.00 g PVA于100 mL圆底烧瓶中，用20.0 mL水溶解；加入3.00 g γCD， 80 ℃下回流12 h，在室温下静置12 h，循环5次。将反应物用乙醇沉淀，经水洗、分离、真空干燥，制得CDPPRs。称2.00 g CDPPRs，溶于40.0 mL二甲基亚砜中，逐滴加入2.00 mL 丙烯酰氯（AC）。4 h后，用乙醇沉淀，用乙醚洗涤，真空干燥后得到CDPPRsAc。
2.2.2印迹聚合物MIPs的制备依次将丙烯酰胺AM、N，N′亚甲基双丙烯酰胺MBA、CDPPRsAc、模板蛋白BSA加入到装有20.0 mL去离子水的三口烧瓶中，冰水浴中搅拌1 h，通氮气，加入过硫酸铵（APS），继续搅拌0.5 h后加入Na2SO3溶液，40℃反应4 h，得到cpMIPs。空白印迹聚合物NMIP的合成，除不加入模板分子外，其它与制备cpMIPs印迹聚合物的方法相同；对比组印迹聚合物aMIP的合成，除不加CDPPRsAc外，其它与制备cpMIPs印迹聚合物的方法相同。
2.2.3 印迹聚合物吸附性能测试（1）吸附动力学实验将各组MIPs加入到0.50 g/L BSA溶液中，于4 ℃吸附，分别于0.5，1.0，1.5，2.0，2.5，3.0，6.0，12.0和24.0 h取上层清液1.0 mL，检测MIPs对模板蛋白BSA的吸附量Q。（2）竞争吸附实验称取1.00 g 各组MIPs，加入到10 mL蛋白质混合溶液（BSA，LYS，OVA和SBTL浓度均为0.50 g/L）中，4 ℃吸附12 h。取聚合物各0.10 g，依次用1.0 mL的0.15， 0.50和2.0 mol/L的KCl溶液洗涤。取洗脱蛋白液各10 μL上样，恒流条件下进行十二烷基磺酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDSPAGE），用考马斯蓝染色进行分析。
3结果与讨论
3.1CDPPRs结构分析
CD为高旋光性物质，PVA旋光度为零，当两者形成组装体后，分子的空间形象及分子对称性发生了较大的改变。两者混合物的比旋光度与γCD的比旋光度相同，均为+175°；而组装体的比旋光度为+85°，初步证明聚乙烯醇与γ环糊精进行了包结。
CDPPRs的核磁谱图（图2c）进一步证明主客体间的各种弱作用相互叠加形成了较强的超分子作用。3.7～3.9 ppm的峰是γCD的3，5位的质子和PVA分子链上与羟基相连碳上的质子的共同贡献，对比图2b与2c可见，该部分贡献并不是γCD与聚乙烯醇两种物质质子的简单物理加和，峰形已经发生变化。
3.2蛋白质印迹聚合物的制备
3.2.1CDPPRsAc的含量对MIPs吸附量的影响在实验范围内，随着CDPPRsAc用量的增加，印迹聚合物的吸附量增大（图4），这应归因于环糊精准聚轮烷的引入使识别位点增多。当CDPPRsAc用量继续增加时，印迹聚合物的吸附量下降，这可能是因为过多的环糊精准聚轮烷使得印迹聚合物的交联过于密集，不利于印迹聚合物的识别。在实验范围内，当CDPPRsAc与AM的质量比为1.1时，此时的印迹聚合物的吸附量最大，为3.54 mg/g。
3.2.2金属离子用量对MIPs吸附量的影响金属离子可以特异性地键合蛋白质的某些官能团。分别使用Ni2+和Cu2+辅助蛋白质印迹识别过程，金属离子与模板所形成的空间取向，在环糊精准聚轮烷所在的聚合网络结构中能够被较好地保留下来，因此可提高对模板分子的选择性识别（表1）。加入金属离子的MIPs比未加入金属离子的MIPs吸附量高，这可能是因为加入金属离子后，CDPPRAc、功能单体与模板蛋白之间可以通过金属离子形成稳定的配位作用，从而产生了更多的有效识别位点，提高对模板蛋白的识别能力。实验范围内，引入Cu2+的MIPs对模板蛋白的吸附量比引入Ni2+的MIPs要高一些。
