亲水相互作用色谱结合串联质谱多重碎裂模式在完整糖肽研究中的应用
江静 应万涛钱小红
摘要 蛋白质的糖基化修饰在生理及病理过程中发挥着重要作用。由于技术条件的限制，传统的糖蛋白分析方法中，通常分别鉴定蛋白质和糖链两者的结构，而忽略了蛋白质与糖链的连接关系。本研究旨在以完整糖肽作为检测对象，对糖肽中肽段序列和糖链结构的同步解析。采用亲水相互作用色谱对完整糖肽进行分离纯化，联合生物质谱中碰撞诱导解离（CID）、高能诱导解离（HCD）、电子转移解离（ETD）等裂解模式，对完整糖肽的糖基化位点、糖链结构、肽段序列等进行全方面的解析。结果表明，亲水相互作用色谱中样品与填料比1∶50可有效富集糖肽，采用30% CID能量，主要产生糖苷键断裂的碎片，为糖链的结构组成分析提供了线索；采用25% HCD能量，在低分子量区域提供了糖链的特征离子信息，并产生明确的糖肽Y1特征离子；ETD保留了完整的修饰基团而产生肽段骨架的断裂，可以提供有效的肽段序列信息。本研究结合亲水相互作用色谱与质谱仪中的多种碎裂方式，为完整糖肽的结构解析提供了一种快速、有效的研究方案。
关键词 亲水作用色谱； 串联质谱； 完整糖肽； 碰撞诱导解离； 高能诱导解离； 电子转移解离
1引言
蛋白质的糖基化修饰是生物体内普遍存在的一种重要翻译后修饰方式[1，2]，但其研究面临很多挑战。糖基化修饰具有多样性。糖基化修饰没有任何模板[3]，而是由200多种糖基转移酶调控，同一蛋白质的不同位点的修饰水平不一，同一位点所携带的糖链也存在多种结构，这给分析技术和软件工具带来了巨大挑战；目前完整糖肽的分析手段有限，主要以质谱分析为主，但由于糖肽修饰的微不均一性，及在质谱中离子化困难、碎裂情况复杂等特点，严重制约了完整糖肽的富集和质谱分析技术的发展。
2012年，Doerr等[4]总结了糖蛋白质结构解析的经典研究手段，并指出主要的研究方法是先将糖链从蛋白上释放，然后分别对两者进行解析，这导致了蛋白与糖链之间联系的缺失。聚糖结构解析[5]，可以解析大量糖链结构，却忽视了糖链的来源；蛋白部分研究[6]，可以得到明确的蛋白序列及大规模糖基化位点，却丢失了糖链信息。Nakano等[7]研究发现，特异位点的糖基化修饰影响生物学功能，这表明位点特异性水平的糖基化修饰研究对进一步阐释糖蛋白质的生理功能及其在病理过程中的变化具有重要意义。因此，开发完整糖肽水平的研究方法，保留蛋白质与聚糖之间的连接，已成为当前的研究热点。
完整糖肽的复杂结构对分析方法的制约，需要从富集和鉴定两方面解决。首先是由不均一性导致的糖肽低化学计量水平，及其在质谱中离子化效率不高而受非糖肽信号抑制的问题。可以通过完整糖肽的富集与分离，去除非糖肽的干扰而提高糖肽的相对丰度。目前应用于富集糖蛋白/糖肽的方法主要有凝集素[8]、二氧化钛[9]、酰肼[10]和亲水相互作用色谱（Hydrophilic interaction liquid chromatography， HILIC）[11]等。其中，HILIC是基于富含多羟基的糖链结构的强亲水特性，而使糖肽与非糖基化肽段得以分离。HILIC对不同类型的糖肽没有偏性，且能保持糖链结构的完整性，适合作为完整糖肽结构研究中的富集技术。其次，完整糖肽包含肽段和糖链两部分，其结构和连接方式的差异导致两者在串联质谱中的碎裂行为有较大的区别，仅采用经典的碰撞诱导解离（Collisioninduced dissociation， CID）碎裂不能有效得到糖肽的全面信息，Wiesner等[12]指出， 电子转移解离（Electron transfer dissociation， ETD）碎裂模式在蛋白质翻译后修饰研究中， 可以补充CID的不足而发挥重要作用，高能诱导解离（High energy collisional dissociation， HCD）可以提供更为丰富的低分子段碎片离子信息。多种碎裂方式联合的方法在蛋白质组学中也已经得到有效应用[13]，多种碎裂方式联合应用的方式可以为完整糖肽研究提供借鉴。
本研究以完整糖肽作为检测对象，制作了HILIC富集装置，并联合CID， HCD， ETD等多种串联质谱碎裂方式，在解析糖链结构的同时，获取肽段序列以及糖基化位点信息，从而实现糖蛋白结构的全面解析。
2实验部分
2.1仪器、试剂与材料
基质辅助激光解吸附电离飞行时间串联质谱仪 （UltrafleXtremeMALDITOF/TOFMS， 德国 Bruker Daltonics公司）； 电喷雾电离线性离子阱静电场轨道阱质谱仪（ESILTQOrbitrapXL， 美国Thermo Fisher 公司）；离心机、冷冻干燥离心机（美国Thermo Fisher 公司）；HILIC 小柱（自制，亲水相互作用填料为博纳艾杰尔科技产品）。
牛胎球蛋白（Fetuin）、核糖核酸酶B （RNase B）、2，5二羟基苯甲酸（DHB）、乙腈（美国Sigma公司）；肽N糖苷酶F （PNGase F， NEB公司）； 胰酶Trypsin（测序级， 美国Promega公司）； 二硫苏糖醇（DTT， 美国GE公司），碘乙酰胺（IAA， 比利时Acros公司），三氟乙酸（TFA）、甲酸（美国Fluka公司）； 其它试剂均为国产分析纯，实验用水为MilliQ制备的超纯水。
2.2实验方法
2.2.1糖蛋白酶解取适量牛胎球蛋白或核糖核酸酶B蛋白，溶解于50 mmol/L NH4HCO3。加入适量DTT，使终浓度为10 mmol/L，56 ℃水浴1 h。加入IAA，使其终浓度为40 mmol/L，暗处反应30 min。 加入终浓度为10 mmol/L DTT封闭过量的IAA。按质量比1∶50加入胰酶进行酶切，37 ℃反应过夜。反应溶液置于95 ℃水浴10 min，灭活胰酶，终止酶解反应。
2.2.2HILIC小柱富集完整糖肽本实验使用由移液枪头自制的HILIC小柱富集纯化蛋白酶切混合物中的糖肽。首先，用80%乙腈，1%FA，冲洗活化小柱，然后，浓缩的酶切混合物，溶于50 μL 80%乙腈，1%FA溶液，上样于HILIC小柱。再用100 μL 80%乙腈，1% FA溶液进行脱盐，重复3次。最后用5%乙腈，1%FA溶液100 μL洗脱，收集糖肽。洗脱溶液用冷冻干燥离心机旋干，
Symbolm@@ 20 ℃保存待用。
2.2.3MALDITOF/TOFMS分析条件肽段或富集后的糖肽与DHB（2，5二羟基苯甲酸）基质1∶1混合点靶。采用正离子反射模式，离子源电压20 kV，脉冲离子提取电压18.8 kV，离子提取延时时间110 ns，激光频率2000 Hz，激光能量50%，每张谱图共采集1500个激光点，校准相对误差≤5 ppm。分析质谱图谱的软件为FlexAnalysis 3.4。
2.2.4ESILTQOrbitrapXL分析条件HILIC小柱富集纯化得到的完整糖肽样品，溶解于50%乙腈0.1%甲酸溶液中，用纳升级电喷雾离子源直接进样，采用LTQOrbitrapXL质谱仪，正离子模式下扫描。采用碰撞诱导解离（CID）；高能诱导解离（HCD）；电子转移解离（ETD）等不同的碎裂方式进行碎裂，然后由Orbitrap进行检测。
3结果与讨论
3.1亲水相互作用色谱富集完整糖肽
3.1.1HILIC富集糖肽方法考察本研究采用牛胎球蛋白优化HILIC小柱富集步骤。牛胎球蛋白由Trypsin酶切后，经PNGase F处理去除糖肽上的糖链，未经富集的Fetuin蛋白酶切产物如图1a所示。PNGase F去除糖链后，消除了糖链不均一性对质谱的影响，但由于样品体系的复杂性和肽段性质的差异，去糖后的糖肽在蛋白的总酶切肽段中的相对信号依然较弱。非糖基化肽段形成的分子离子峰1474.84对其它肽段产生了明显抑制（图1a）。例如，去糖后N99位的肽段[M+H]+ m/z 3672.7519，及N156位的肽段[M+H]+ m/z 1741.8247，在谱图中仅为依稀可见的两个小峰，而N176位的肽段[M+H]+ m/z 3017.5538甚至难以在谱图中显现。
基于糖肽中糖链部分的亲水性，以HILIC填料制作的富集小柱可以用于富集并分离样品中的完整糖肽。蛋白质酶切混合物在高有机相溶液中上样，糖肽借助其糖链部分富含的羟基等亲水基团而保留在填料表面的水化层中，而疏水性较强的非糖基化肽段在流动相中分配系数更大而不在小柱上保留。继续用高有机相溶液充分清洗材料上的非特异性吸附后，由高水相溶液洗脱并收集糖肽。这种基于分配机制分离的色谱方法，选择合适有机溶剂含量的流动相，可以减少材料的非特异性吸附，提高富集效率。图1b 采用20%乙腈1%甲酸溶液洗脱糖肽，图1c 采用5%乙腈1%甲酸溶液洗脱糖肽，由PNGase F处理富集后产物，经MALDITOF质谱检测。图中可见，两者都可以有效的富集Fetuin的3个N糖基化肽段。但在20%乙腈洗脱时， m/z 1500～2500区域内有较多非糖肽的杂峰，而在5%乙腈洗脱时，该区域中非特异性吸附引入的干扰明显减少。结果表明，采用5%乙腈1%甲酸溶液洗脱糖肽可以进一步去除非糖肽的干扰，获得更好的糖肽富集效果。
采用移液器枪头作为HILIC填料的载体，可以根据目标样品的多少自由选择合适量的HILIC填料。合适的填料与样品比例，可以保证较好的富集效果，减少吸附损失的影响，也可以防止样品过载。固定填料的用量，依次提高蛋白质的上样量，即选取样品与填料质量比为1∶1000，1∶500，1∶50，1∶10时对Fetuin蛋白的酶切产物进行富集。对在洗脱组分和上样流出组分的糖肽信号进行分析，以3个糖肽中信号强度最高的N156位糖肽的去除糖链后肽段[M+H]+ m/z 1741.8247（序列为LCPDCPLLAPLNDSR）的相对强度作为参照，结果如图2所示。在样品与填料质量比为1∶10，结合组分和流出组分中的糖肽信号都最高，[TS（][HT5”SS]图2不同HILIC填料与糖蛋白样品的比例对富集效果的影响
Fig.2Relative intensity of glycopeptides under different reaction ratio between glycoprotein and HILIC material
1. 洗脱组分（Elution）； 2. 流出组分（Flow through）。[HT5][TS）]因此以该条件下的糖肽信号为100%，分别计算其它条件下结合组分和流出组分中的糖肽相对强度。当选取样品与填料质量比为1∶1000和1∶500时，虽然流出组分中未结合的糖肽比例低于20%，但洗脱组分中的糖肽信号也小于40%。当样品与填料质量比为1∶50时，结合组分中糖肽得到有效的富集，而流出组分中糖肽信号仍低于20%。样品与填料比例为1∶10时，上样流出组分中的糖肽相对信号大幅增加，表明此时糖肽已经过载。因此，在制作HILIC小柱时，采用样品与填料质量比为1∶50时富集效果显著，并能得到较好的回收率。
3.1.2RNase B完整糖肽制备与纯化RNase B经过Trypsin酶切，在DHB基质辅助下，得到糖肽和肽段混合物的一级质谱图，如图3a所示。由于糖基化的微不均一性，核糖核苷酶B的同一糖基化位点含有5个不同糖链长度的高甘露糖（Mannose， Man），即在化学计量水平，一个肽段的丰度被分散到5个糖肽上。对于相对含量较低的糖型，受到其它肽段的干扰更为严重，而不利于质谱的选择与检测。经过HILIC小柱富集后，酶切产物中的非糖基化肽段被有效的去除，仅留下5个清晰的糖肽（图3b），为肽段序列SRNLTK上分别连接Man5，Man6，Man7，Man8，Man9等不同长度的高甘露糖糖链。
3.2多重碎裂方式互补，全面解析完整糖肽
3.2.1完整糖肽在经典CID模式下的碎裂碰撞诱导解离（CID）是生物质谱中肽段序列分析最为常用的碎裂模式，肽段活化碰撞后主要产生b、y系碎片离子而得以解析序列。但糖基化修饰的糖链结构分子量较大，在CID的能量碰撞下，糖肽不能充分碎裂。以肽段序列SRNLTK上连接Man5的糖肽为例，其在电喷雾离子源中双电荷离子为[M+2H]2+ m/z 967.93。由于糖苷键稳定性比酰胺键弱，在CID条件下优先断裂，而形成糖肽上逐一丢失单糖的二级碎裂图谱。改变CID的碎裂能量，从10%至50%。当CID 能量为20%，糖肽母离子开始碎裂，其最强的子离子占母离子相对丰度的70%，当CID能量为30%时， 母离子全部碎裂（图4）。继续提高能量至35%，40%，45%和50%， 其碎裂情况基本不变。因此，CID的碎裂谱图上难以得到肽段序列的信息，不能全面阐明完整糖肽的结构。
[TS（][HT5”SS]图4母离子为[M+2H]2+ m/z 967.93糖肽的CID碎裂二级质谱图（方块为N乙酰葡萄糖胺，圆圈为甘露糖）
Fig.4MS/MS spectrum of glycopeptide by collisioninduced dissociation （CID） fragmentation， the precursor ion [M+2H]2+ m/z 967.93 （squares， Nacetylhexoseamine， HexNAc； circles， Hexose， Hex）[HT5][TS）]
3.2.2完整糖肽在HCD模式下碎裂能量的优化在HCD碰撞模式下，累积后的母离子将被注入HCD碰撞池中与中性氮气分子碰撞，碎裂后经CTrap送入Orbitrap检测。此处仍然采用肽段序列SRNLTK上连接Man5的糖肽，m/z 967.93为检测对象。依次提高HCD的碰撞能量，在20%能量下，糖肽的碎裂基本与CID 30%能量碎裂时一致。当HCD能量为25%时，糖肽的谱图如图5所示。在低分子量区域，产生系列糖的特征离子，如m/z 204（HexNAc+H）+，m/z 366（HexNAc+Hex+H）+，以及氧鎓离子m/z 204（HexNAc+H）+继续碎裂而产生的碎片离子，例如m/z 126， 138， 168和186等。由于HCD模式下不存在离子阱质谱仪CID模式下的低质量端1/3质量丢失，使得上述糖碎片离子得以检测。在中高分子量区域，HCD谱图得到一系列的逐一丢失单糖的Y系列碎片离子，各离子有1电荷与双电荷两种状态，故形成两组m/z不同的离子峰。其中Y1（肽段+HexNAc+H）+离子峰m/z 921.45强度高，因此Y1离子和糖碎片氧鎓离子是显著的糖肽离子特征峰。
[TS（][HT5”SS]图5母离子为[M+2H]2+ m/z 967.93糖肽的HCD碎裂二级质谱图（方块为N乙酰葡萄，圆圈为甘露糖）。插图显示低质量端糖碎片离子
Fig.5MS/MS spectrum of glycopeptide by high energy collisional dissociation （HCD） fragmentation， the precursor ion [M+2H]2+ m/z 967.93 （ squares， Nacetylhexoseamine， HexNAc； circles， Hexose， Hex）. Insert view showed the fragment ions of glycans in the low mass region[HT5][TS）]
由图6可见，不同的HCD碰撞能量下，糖肽的特征离子相对丰度各有不同。随着HCD能量的增加，糖的特征碎片离子信号不断升高，其中可以继续碎裂的m/z 204与366离子在能量大于25%时开始降低。同时，双电荷状态下的Y系列离子主要在20%～25%的中高能量下信号较高，随着能量的进一步加强，双电荷离子完全碎裂。1电荷的Y碎片离子系列，在HCD能量25%时达到高峰，但并不随能量的提高而继续增强。故采用HCD能量为25%，对糖肽进行碰撞解离，其二级谱图可以得到最为充分的信息。 [TS（][HT5”SS]图6不同HCD碎裂能量下，糖肽二级谱图中碎片离子的相对丰度： （a） 糖的特征离子；（b）双电荷的Y系列离子；（c）1电荷的Y系列离子
Fig.6Relative intensity of glycopeptides′ fragment ions in different HCD energy （a） carbohydratespecific ions； （b） a series of Y ions doublelycharged； （c） a series of Y ions singlelycharged[HT5][TS）]
3.2.3完整糖肽在ETD碎裂中肽段序列分析ETD碎裂方式是将电子从一个活泼的阴离子基团转移到带正电荷的肽段上，从而诱发肽段序列碎裂产生c、z离子。由于ETD的软碎裂模式，翻译后修饰的基团常得以保留，因此有利于准确识别修饰位点。如图7所示，m/z 967.93的Man5糖肽在ETD谱图中，产生肽段骨架结构的碎片离子，从C3～C5及Z4～Z6两组离子中，得到该糖肽的肽段序列为SRNLTK。从C2～C3及Z3～Z4之间，有大范围的质量跳跃，可以清晰指示糖基化位点。
综上所述，CID主要产生糖苷键断裂的碎片，为糖链的结构组成分析提供了线索；HCD在低分子量区域提供了糖链的特征离子信息，并产生明确的糖肽Y1特征离子，同时也产生部分糖苷键断裂的碎片，为糖链结构信息提供参考；ETD保留了完整的修饰基团而产生肽段骨架的断裂，可以提供有效的肽段序列信息。因此，联合CID、HCD、ETD等多种碎裂方式，即可得到糖链结构、糖基化位点和肽段序列等糖蛋白质结构的全面信息。
4结论
本研究从解析完整糖肽水平入手，用自制HILIC亲水相互作用小柱富集纯化样品中的糖肽并保持其完整性，采用LTQOrbitrap质谱检测，联合CID、HCD、ETD等多种碎裂方式分析糖肽结构。因此，本方法在有效富集糖肽的同时，获取了肽段序列以及糖基化位点信息，并且能够得到位点特异的糖型结构，为糖蛋白结构的进一步解析提供了一种简单、有效的方法。虽然不同碎裂条件下所获得的糖肽谱图均比较复杂，且糖链结构解析缺乏有效的数据库，规模化糖肽数据的解析还比较困难，但随着计算机自动化软件的进一步发展，亲水作用色谱联合多重碎裂方式的串联质谱方法将在糖蛋白质结构解析中发挥更大的作用。
[TS（][HT5”SS]图4母离子为[M+2H]2+ m/z 967.93糖肽的CID碎裂二级质谱图（方块为N乙酰葡萄糖胺，圆圈为甘露糖）
Fig.4MS/MS spectrum of glycopeptide by collisioninduced dissociation （CID） fragmentation， the precursor ion [M+2H]2+ m/z 967.93 （squares， Nacetylhexoseamine， HexNAc； circles， Hexose， Hex）[HT5][TS）]
3.2.2完整糖肽在HCD模式下碎裂能量的优化在HCD碰撞模式下，累积后的母离子将被注入HCD碰撞池中与中性氮气分子碰撞，碎裂后经CTrap送入Orbitrap检测。此处仍然采用肽段序列SRNLTK上连接Man5的糖肽，m/z 967.93为检测对象。依次提高HCD的碰撞能量，在20%能量下，糖肽的碎裂基本与CID 30%能量碎裂时一致。当HCD能量为25%时，糖肽的谱图如图5所示。在低分子量区域，产生系列糖的特征离子，如m/z 204（HexNAc+H）+，m/z 366（HexNAc+Hex+H）+，以及氧鎓离子m/z 204（HexNAc+H）+继续碎裂而产生的碎片离子，例如m/z 126， 138， 168和186等。由于HCD模式下不存在离子阱质谱仪CID模式下的低质量端1/3质量丢失，使得上述糖碎片离子得以检测。在中高分子量区域，HCD谱图得到一系列的逐一丢失单糖的Y系列碎片离子，各离子有1电荷与双电荷两种状态，故形成两组m/z不同的离子峰。其中Y1（肽段+HexNAc+H）+离子峰m/z 921.45强度高，因此Y1离子和糖碎片氧鎓离子是显著的糖肽离子特征峰。
[TS（][HT5”SS]图5母离子为[M+2H]2+ m/z 967.93糖肽的HCD碎裂二级质谱图（方块为N乙酰葡萄，圆圈为甘露糖）。插图显示低质量端糖碎片离子
Fig.5MS/MS spectrum of glycopeptide by high energy collisional dissociation （HCD） fragmentation， the precursor ion [M+2H]2+ m/z 967.93 （ squares， Nacetylhexoseamine， HexNAc； circles， Hexose， Hex）. Insert view showed the fragment ions of glycans in the low mass region[HT5][TS）]
由图6可见，不同的HCD碰撞能量下，糖肽的特征离子相对丰度各有不同。随着HCD能量的增加，糖的特征碎片离子信号不断升高，其中可以继续碎裂的m/z 204与366离子在能量大于25%时开始降低。同时，双电荷状态下的Y系列离子主要在20%～25%的中高能量下信号较高，随着能量的进一步加强，双电荷离子完全碎裂。1电荷的Y碎片离子系列，在HCD能量25%时达到高峰，但并不随能量的提高而继续增强。故采用HCD能量为25%，对糖肽进行碰撞解离，其二级谱图可以得到最为充分的信息。 [TS（][HT5”SS]图6不同HCD碎裂能量下，糖肽二级谱图中碎片离子的相对丰度： （a） 糖的特征离子；（b）双电荷的Y系列离子；（c）1电荷的Y系列离子
Fig.6Relative intensity of glycopeptides′ fragment ions in different HCD energy （a） carbohydratespecific ions； （b） a series of Y ions doublelycharged； （c） a series of Y ions singlelycharged[HT5][TS）]
3.2.3完整糖肽在ETD碎裂中肽段序列分析ETD碎裂方式是将电子从一个活泼的阴离子基团转移到带正电荷的肽段上，从而诱发肽段序列碎裂产生c、z离子。由于ETD的软碎裂模式，翻译后修饰的基团常得以保留，因此有利于准确识别修饰位点。如图7所示，m/z 967.93的Man5糖肽在ETD谱图中，产生肽段骨架结构的碎片离子，从C3～C5及Z4～Z6两组离子中，得到该糖肽的肽段序列为SRNLTK。从C2～C3及Z3～Z4之间，有大范围的质量跳跃，可以清晰指示糖基化位点。
综上所述，CID主要产生糖苷键断裂的碎片，为糖链的结构组成分析提供了线索；HCD在低分子量区域提供了糖链的特征离子信息，并产生明确的糖肽Y1特征离子，同时也产生部分糖苷键断裂的碎片，为糖链结构信息提供参考；ETD保留了完整的修饰基团而产生肽段骨架的断裂，可以提供有效的肽段序列信息。因此，联合CID、HCD、ETD等多种碎裂方式，即可得到糖链结构、糖基化位点和肽段序列等糖蛋白质结构的全面信息。
4结论
本研究从解析完整糖肽水平入手，用自制HILIC亲水相互作用小柱富集纯化样品中的糖肽并保持其完整性，采用LTQOrbitrap质谱检测，联合CID、HCD、ETD等多种碎裂方式分析糖肽结构。因此，本方法在有效富集糖肽的同时，获取了肽段序列以及糖基化位点信息，并且能够得到位点特异的糖型结构，为糖蛋白结构的进一步解析提供了一种简单、有效的方法。虽然不同碎裂条件下所获得的糖肽谱图均比较复杂，且糖链结构解析缺乏有效的数据库，规模化糖肽数据的解析还比较困难，但随着计算机自动化软件的进一步发展，亲水作用色谱联合多重碎裂方式的串联质谱方法将在糖蛋白质结构解析中发挥更大的作用。
[TS（][HT5”SS]图4母离子为[M+2H]2+ m/z 967.93糖肽的CID碎裂二级质谱图（方块为N乙酰葡萄糖胺，圆圈为甘露糖）
Fig.4MS/MS spectrum of glycopeptide by collisioninduced dissociation （CID） fragmentation， the precursor ion [M+2H]2+ m/z 967.93 （squares， Nacetylhexoseamine， HexNAc； circles， Hexose， Hex）[HT5][TS）]
3.2.2完整糖肽在HCD模式下碎裂能量的优化在HCD碰撞模式下，累积后的母离子将被注入HCD碰撞池中与中性氮气分子碰撞，碎裂后经CTrap送入Orbitrap检测。此处仍然采用肽段序列SRNLTK上连接Man5的糖肽，m/z 967.93为检测对象。依次提高HCD的碰撞能量，在20%能量下，糖肽的碎裂基本与CID 30%能量碎裂时一致。当HCD能量为25%时，糖肽的谱图如图5所示。在低分子量区域，产生系列糖的特征离子，如m/z 204（HexNAc+H）+，m/z 366（HexNAc+Hex+H）+，以及氧鎓离子m/z 204（HexNAc+H）+继续碎裂而产生的碎片离子，例如m/z 126， 138， 168和186等。由于HCD模式下不存在离子阱质谱仪CID模式下的低质量端1/3质量丢失，使得上述糖碎片离子得以检测。在中高分子量区域，HCD谱图得到一系列的逐一丢失单糖的Y系列碎片离子，各离子有1电荷与双电荷两种状态，故形成两组m/z不同的离子峰。其中Y1（肽段+HexNAc+H）+离子峰m/z 921.45强度高，因此Y1离子和糖碎片氧鎓离子是显著的糖肽离子特征峰。
[TS（][HT5”SS]图5母离子为[M+2H]2+ m/z 967.93糖肽的HCD碎裂二级质谱图（方块为N乙酰葡萄，圆圈为甘露糖）。插图显示低质量端糖碎片离子
Fig.5MS/MS spectrum of glycopeptide by high energy collisional dissociation （HCD） fragmentation， the precursor ion [M+2H]2+ m/z 967.93 （ squares， Nacetylhexoseamine， HexNAc； circles， Hexose， Hex）. Insert view showed the fragment ions of glycans in the low mass region[HT5][TS）]
由图6可见，不同的HCD碰撞能量下，糖肽的特征离子相对丰度各有不同。随着HCD能量的增加，糖的特征碎片离子信号不断升高，其中可以继续碎裂的m/z 204与366离子在能量大于25%时开始降低。同时，双电荷状态下的Y系列离子主要在20%～25%的中高能量下信号较高，随着能量的进一步加强，双电荷离子完全碎裂。1电荷的Y碎片离子系列，在HCD能量25%时达到高峰，但并不随能量的提高而继续增强。故采用HCD能量为25%，对糖肽进行碰撞解离，其二级谱图可以得到最为充分的信息。 [TS（][HT5”SS]图6不同HCD碎裂能量下，糖肽二级谱图中碎片离子的相对丰度： （a） 糖的特征离子；（b）双电荷的Y系列离子；（c）1电荷的Y系列离子
Fig.6Relative intensity of glycopeptides′ fragment ions in different HCD energy （a） carbohydratespecific ions； （b） a series of Y ions doublelycharged； （c） a series of Y ions singlelycharged[HT5][TS）]
3.2.3完整糖肽在ETD碎裂中肽段序列分析ETD碎裂方式是将电子从一个活泼的阴离子基团转移到带正电荷的肽段上，从而诱发肽段序列碎裂产生c、z离子。由于ETD的软碎裂模式，翻译后修饰的基团常得以保留，因此有利于准确识别修饰位点。如图7所示，m/z 967.93的Man5糖肽在ETD谱图中，产生肽段骨架结构的碎片离子，从C3～C5及Z4～Z6两组离子中，得到该糖肽的肽段序列为SRNLTK。从C2～C3及Z3～Z4之间，有大范围的质量跳跃，可以清晰指示糖基化位点。
综上所述，CID主要产生糖苷键断裂的碎片，为糖链的结构组成分析提供了线索；HCD在低分子量区域提供了糖链的特征离子信息，并产生明确的糖肽Y1特征离子，同时也产生部分糖苷键断裂的碎片，为糖链结构信息提供参考；ETD保留了完整的修饰基团而产生肽段骨架的断裂，可以提供有效的肽段序列信息。因此，联合CID、HCD、ETD等多种碎裂方式，即可得到糖链结构、糖基化位点和肽段序列等糖蛋白质结构的全面信息。
4结论
本研究从解析完整糖肽水平入手，用自制HILIC亲水相互作用小柱富集纯化样品中的糖肽并保持其完整性，采用LTQOrbitrap质谱检测，联合CID、HCD、ETD等多种碎裂方式分析糖肽结构。因此，本方法在有效富集糖肽的同时，获取了肽段序列以及糖基化位点信息，并且能够得到位点特异的糖型结构，为糖蛋白结构的进一步解析提供了一种简单、有效的方法。虽然不同碎裂条件下所获得的糖肽谱图均比较复杂，且糖链结构解析缺乏有效的数据库，规模化糖肽数据的解析还比较困难，但随着计算机自动化软件的进一步发展，亲水作用色谱联合多重碎裂方式的串联质谱方法将在糖蛋白质结构解析中发挥更大的作用。
摘要 蛋白质的糖基化修饰在生理及病理过程中发挥着重要作用。由于技术条件的限制，传统的糖蛋白分析方法中，通常分别鉴定蛋白质和糖链两者的结构，而忽略了蛋白质与糖链的连接关系。本研究旨在以完整糖肽作为检测对象，对糖肽中肽段序列和糖链结构的同步解析。采用亲水相互作用色谱对完整糖肽进行分离纯化，联合生物质谱中碰撞诱导解离（CID）、高能诱导解离（HCD）、电子转移解离（ETD）等裂解模式，对完整糖肽的糖基化位点、糖链结构、肽段序列等进行全方面的解析。结果表明，亲水相互作用色谱中样品与填料比1∶50可有效富集糖肽，采用30% CID能量，主要产生糖苷键断裂的碎片，为糖链的结构组成分析提供了线索；采用25% HCD能量，在低分子量区域提供了糖链的特征离子信息，并产生明确的糖肽Y1特征离子；ETD保留了完整的修饰基团而产生肽段骨架的断裂，可以提供有效的肽段序列信息。本研究结合亲水相互作用色谱与质谱仪中的多种碎裂方式，为完整糖肽的结构解析提供了一种快速、有效的研究方案。
关键词 亲水作用色谱； 串联质谱； 完整糖肽； 碰撞诱导解离； 高能诱导解离； 电子转移解离
1引言
蛋白质的糖基化修饰是生物体内普遍存在的一种重要翻译后修饰方式[1，2]，但其研究面临很多挑战。糖基化修饰具有多样性。糖基化修饰没有任何模板[3]，而是由200多种糖基转移酶调控，同一蛋白质的不同位点的修饰水平不一，同一位点所携带的糖链也存在多种结构，这给分析技术和软件工具带来了巨大挑战；目前完整糖肽的分析手段有限，主要以质谱分析为主，但由于糖肽修饰的微不均一性，及在质谱中离子化困难、碎裂情况复杂等特点，严重制约了完整糖肽的富集和质谱分析技术的发展。
2012年，Doerr等[4]总结了糖蛋白质结构解析的经典研究手段，并指出主要的研究方法是先将糖链从蛋白上释放，然后分别对两者进行解析，这导致了蛋白与糖链之间联系的缺失。聚糖结构解析[5]，可以解析大量糖链结构，却忽视了糖链的来源；蛋白部分研究[6]，可以得到明确的蛋白序列及大规模糖基化位点，却丢失了糖链信息。Nakano等[7]研究发现，特异位点的糖基化修饰影响生物学功能，这表明位点特异性水平的糖基化修饰研究对进一步阐释糖蛋白质的生理功能及其在病理过程中的变化具有重要意义。因此，开发完整糖肽水平的研究方法，保留蛋白质与聚糖之间的连接，已成为当前的研究热点。
完整糖肽的复杂结构对分析方法的制约，需要从富集和鉴定两方面解决。首先是由不均一性导致的糖肽低化学计量水平，及其在质谱中离子化效率不高而受非糖肽信号抑制的问题。可以通过完整糖肽的富集与分离，去除非糖肽的干扰而提高糖肽的相对丰度。目前应用于富集糖蛋白/糖肽的方法主要有凝集素[8]、二氧化钛[9]、酰肼[10]和亲水相互作用色谱（Hydrophilic interaction liquid chromatography， HILIC）[11]等。其中，HILIC是基于富含多羟基的糖链结构的强亲水特性，而使糖肽与非糖基化肽段得以分离。HILIC对不同类型的糖肽没有偏性，且能保持糖链结构的完整性，适合作为完整糖肽结构研究中的富集技术。其次，完整糖肽包含肽段和糖链两部分，其结构和连接方式的差异导致两者在串联质谱中的碎裂行为有较大的区别，仅采用经典的碰撞诱导解离（Collisioninduced dissociation， CID）碎裂不能有效得到糖肽的全面信息，Wiesner等[12]指出， 电子转移解离（Electron transfer dissociation， ETD）碎裂模式在蛋白质翻译后修饰研究中， 可以补充CID的不足而发挥重要作用，高能诱导解离（High energy collisional dissociation， HCD）可以提供更为丰富的低分子段碎片离子信息。多种碎裂方式联合的方法在蛋白质组学中也已经得到有效应用[13]，多种碎裂方式联合应用的方式可以为完整糖肽研究提供借鉴。
本研究以完整糖肽作为检测对象，制作了HILIC富集装置，并联合CID， HCD， ETD等多种串联质谱碎裂方式，在解析糖链结构的同时，获取肽段序列以及糖基化位点信息，从而实现糖蛋白结构的全面解析。
2实验部分
2.1仪器、试剂与材料
基质辅助激光解吸附电离飞行时间串联质谱仪 （UltrafleXtremeMALDITOF/TOFMS， 德国 Bruker Daltonics公司）； 电喷雾电离线性离子阱静电场轨道阱质谱仪（ESILTQOrbitrapXL， 美国Thermo Fisher 公司）；离心机、冷冻干燥离心机（美国Thermo Fisher 公司）；HILIC 小柱（自制，亲水相互作用填料为博纳艾杰尔科技产品）。
牛胎球蛋白（Fetuin）、核糖核酸酶B （RNase B）、2，5二羟基苯甲酸（DHB）、乙腈（美国Sigma公司）；肽N糖苷酶F （PNGase F， NEB公司）； 胰酶Trypsin（测序级， 美国Promega公司）； 二硫苏糖醇（DTT， 美国GE公司），碘乙酰胺（IAA， 比利时Acros公司），三氟乙酸（TFA）、甲酸（美国Fluka公司）； 其它试剂均为国产分析纯，实验用水为MilliQ制备的超纯水。
2.2实验方法
2.2.1糖蛋白酶解取适量牛胎球蛋白或核糖核酸酶B蛋白，溶解于50 mmol/L NH4HCO3。加入适量DTT，使终浓度为10 mmol/L，56 ℃水浴1 h。加入IAA，使其终浓度为40 mmol/L，暗处反应30 min。 加入终浓度为10 mmol/L DTT封闭过量的IAA。按质量比1∶50加入胰酶进行酶切，37 ℃反应过夜。反应溶液置于95 ℃水浴10 min，灭活胰酶，终止酶解反应。
2.2.2HILIC小柱富集完整糖肽本实验使用由移液枪头自制的HILIC小柱富集纯化蛋白酶切混合物中的糖肽。首先，用80%乙腈，1%FA，冲洗活化小柱，然后，浓缩的酶切混合物，溶于50 μL 80%乙腈，1%FA溶液，上样于HILIC小柱。再用100 μL 80%乙腈，1% FA溶液进行脱盐，重复3次。最后用5%乙腈，1%FA溶液100 μL洗脱，收集糖肽。洗脱溶液用冷冻干燥离心机旋干，
Symbolm@@ 20 ℃保存待用。
2.2.3MALDITOF/TOFMS分析条件肽段或富集后的糖肽与DHB（2，5二羟基苯甲酸）基质1∶1混合点靶。采用正离子反射模式，离子源电压20 kV，脉冲离子提取电压18.8 kV，离子提取延时时间110 ns，激光频率2000 Hz，激光能量50%，每张谱图共采集1500个激光点，校准相对误差≤5 ppm。分析质谱图谱的软件为FlexAnalysis 3.4。
2.2.4ESILTQOrbitrapXL分析条件HILIC小柱富集纯化得到的完整糖肽样品，溶解于50%乙腈0.1%甲酸溶液中，用纳升级电喷雾离子源直接进样，采用LTQOrbitrapXL质谱仪，正离子模式下扫描。采用碰撞诱导解离（CID）；高能诱导解离（HCD）；电子转移解离（ETD）等不同的碎裂方式进行碎裂，然后由Orbitrap进行检测。
3结果与讨论
3.1亲水相互作用色谱富集完整糖肽
3.1.1HILIC富集糖肽方法考察本研究采用牛胎球蛋白优化HILIC小柱富集步骤。牛胎球蛋白由Trypsin酶切后，经PNGase F处理去除糖肽上的糖链，未经富集的Fetuin蛋白酶切产物如图1a所示。PNGase F去除糖链后，消除了糖链不均一性对质谱的影响，但由于样品体系的复杂性和肽段性质的差异，去糖后的糖肽在蛋白的总酶切肽段中的相对信号依然较弱。非糖基化肽段形成的分子离子峰1474.84对其它肽段产生了明显抑制（图1a）。例如，去糖后N99位的肽段[M+H]+ m/z 3672.7519，及N156位的肽段[M+H]+ m/z 1741.8247，在谱图中仅为依稀可见的两个小峰，而N176位的肽段[M+H]+ m/z 3017.5538甚至难以在谱图中显现。
基于糖肽中糖链部分的亲水性，以HILIC填料制作的富集小柱可以用于富集并分离样品中的完整糖肽。蛋白质酶切混合物在高有机相溶液中上样，糖肽借助其糖链部分富含的羟基等亲水基团而保留在填料表面的水化层中，而疏水性较强的非糖基化肽段在流动相中分配系数更大而不在小柱上保留。继续用高有机相溶液充分清洗材料上的非特异性吸附后，由高水相溶液洗脱并收集糖肽。这种基于分配机制分离的色谱方法，选择合适有机溶剂含量的流动相，可以减少材料的非特异性吸附，提高富集效率。图1b 采用20%乙腈1%甲酸溶液洗脱糖肽，图1c 采用5%乙腈1%甲酸溶液洗脱糖肽，由PNGase F处理富集后产物，经MALDITOF质谱检测。图中可见，两者都可以有效的富集Fetuin的3个N糖基化肽段。但在20%乙腈洗脱时， m/z 1500～2500区域内有较多非糖肽的杂峰，而在5%乙腈洗脱时，该区域中非特异性吸附引入的干扰明显减少。结果表明，采用5%乙腈1%甲酸溶液洗脱糖肽可以进一步去除非糖肽的干扰，获得更好的糖肽富集效果。
采用移液器枪头作为HILIC填料的载体，可以根据目标样品的多少自由选择合适量的HILIC填料。合适的填料与样品比例，可以保证较好的富集效果，减少吸附损失的影响，也可以防止样品过载。固定填料的用量，依次提高蛋白质的上样量，即选取样品与填料质量比为1∶1000，1∶500，1∶50，1∶10时对Fetuin蛋白的酶切产物进行富集。对在洗脱组分和上样流出组分的糖肽信号进行分析，以3个糖肽中信号强度最高的N156位糖肽的去除糖链后肽段[M+H]+ m/z 1741.8247（序列为LCPDCPLLAPLNDSR）的相对强度作为参照，结果如图2所示。在样品与填料质量比为1∶10，结合组分和流出组分中的糖肽信号都最高，[TS（][HT5”SS]图2不同HILIC填料与糖蛋白样品的比例对富集效果的影响
Fig.2Relative intensity of glycopeptides under different reaction ratio between glycoprotein and HILIC material
1. 洗脱组分（Elution）； 2. 流出组分（Flow through）。[HT5][TS）]因此以该条件下的糖肽信号为100%，分别计算其它条件下结合组分和流出组分中的糖肽相对强度。当选取样品与填料质量比为1∶1000和1∶500时，虽然流出组分中未结合的糖肽比例低于20%，但洗脱组分中的糖肽信号也小于40%。当样品与填料质量比为1∶50时，结合组分中糖肽得到有效的富集，而流出组分中糖肽信号仍低于20%。样品与填料比例为1∶10时，上样流出组分中的糖肽相对信号大幅增加，表明此时糖肽已经过载。因此，在制作HILIC小柱时，采用样品与填料质量比为1∶50时富集效果显著，并能得到较好的回收率。
3.1.2RNase B完整糖肽制备与纯化RNase B经过Trypsin酶切，在DHB基质辅助下，得到糖肽和肽段混合物的一级质谱图，如图3a所示。由于糖基化的微不均一性，核糖核苷酶B的同一糖基化位点含有5个不同糖链长度的高甘露糖（Mannose， Man），即在化学计量水平，一个肽段的丰度被分散到5个糖肽上。对于相对含量较低的糖型，受到其它肽段的干扰更为严重，而不利于质谱的选择与检测。经过HILIC小柱富集后，酶切产物中的非糖基化肽段被有效的去除，仅留下5个清晰的糖肽（图3b），为肽段序列SRNLTK上分别连接Man5，Man6，Man7，Man8，Man9等不同长度的高甘露糖糖链。
3.2多重碎裂方式互补，全面解析完整糖肽
3.2.1完整糖肽在经典CID模式下的碎裂碰撞诱导解离（CID）是生物质谱中肽段序列分析最为常用的碎裂模式，肽段活化碰撞后主要产生b、y系碎片离子而得以解析序列。但糖基化修饰的糖链结构分子量较大，在CID的能量碰撞下，糖肽不能充分碎裂。以肽段序列SRNLTK上连接Man5的糖肽为例，其在电喷雾离子源中双电荷离子为[M+2H]2+ m/z 967.93。由于糖苷键稳定性比酰胺键弱，在CID条件下优先断裂，而形成糖肽上逐一丢失单糖的二级碎裂图谱。改变CID的碎裂能量，从10%至50%。当CID 能量为20%，糖肽母离子开始碎裂，其最强的子离子占母离子相对丰度的70%，当CID能量为30%时， 母离子全部碎裂（图4）。继续提高能量至35%，40%，45%和50%， 其碎裂情况基本不变。因此，CID的碎裂谱图上难以得到肽段序列的信息，不能全面阐明完整糖肽的结构。
[TS（][HT5”SS]图4母离子为[M+2H]2+ m/z 967.93糖肽的CID碎裂二级质谱图（方块为N乙酰葡萄糖胺，圆圈为甘露糖）
Fig.4MS/MS spectrum of glycopeptide by collisioninduced dissociation （CID） fragmentation， the precursor ion [M+2H]2+ m/z 967.93 （squares， Nacetylhexoseamine， HexNAc； circles， Hexose， Hex）[HT5][TS）]
3.2.2完整糖肽在HCD模式下碎裂能量的优化在HCD碰撞模式下，累积后的母离子将被注入HCD碰撞池中与中性氮气分子碰撞，碎裂后经CTrap送入Orbitrap检测。此处仍然采用肽段序列SRNLTK上连接Man5的糖肽，m/z 967.93为检测对象。依次提高HCD的碰撞能量，在20%能量下，糖肽的碎裂基本与CID 30%能量碎裂时一致。当HCD能量为25%时，糖肽的谱图如图5所示。在低分子量区域，产生系列糖的特征离子，如m/z 204（HexNAc+H）+，m/z 366（HexNAc+Hex+H）+，以及氧鎓离子m/z 204（HexNAc+H）+继续碎裂而产生的碎片离子，例如m/z 126， 138， 168和186等。由于HCD模式下不存在离子阱质谱仪CID模式下的低质量端1/3质量丢失，使得上述糖碎片离子得以检测。在中高分子量区域，HCD谱图得到一系列的逐一丢失单糖的Y系列碎片离子，各离子有1电荷与双电荷两种状态，故形成两组m/z不同的离子峰。其中Y1（肽段+HexNAc+H）+离子峰m/z 921.45强度高，因此Y1离子和糖碎片氧鎓离子是显著的糖肽离子特征峰。
[TS（][HT5”SS]图5母离子为[M+2H]2+ m/z 967.93糖肽的HCD碎裂二级质谱图（方块为N乙酰葡萄，圆圈为甘露糖）。插图显示低质量端糖碎片离子
Fig.5MS/MS spectrum of glycopeptide by high energy collisional dissociation （HCD） fragmentation， the precursor ion [M+2H]2+ m/z 967.93 （ squares， Nacetylhexoseamine， HexNAc； circles， Hexose， Hex）. Insert view showed the fragment ions of glycans in the low mass region[HT5][TS）]
由图6可见，不同的HCD碰撞能量下，糖肽的特征离子相对丰度各有不同。随着HCD能量的增加，糖的特征碎片离子信号不断升高，其中可以继续碎裂的m/z 204与366离子在能量大于25%时开始降低。同时，双电荷状态下的Y系列离子主要在20%～25%的中高能量下信号较高，随着能量的进一步加强，双电荷离子完全碎裂。1电荷的Y碎片离子系列，在HCD能量25%时达到高峰，但并不随能量的提高而继续增强。故采用HCD能量为25%，对糖肽进行碰撞解离，其二级谱图可以得到最为充分的信息。 [TS（][HT5”SS]图6不同HCD碎裂能量下，糖肽二级谱图中碎片离子的相对丰度： （a） 糖的特征离子；（b）双电荷的Y系列离子；（c）1电荷的Y系列离子
Fig.6Relative intensity of glycopeptides′ fragment ions in different HCD energy （a） carbohydratespecific ions； （b） a series of Y ions doublelycharged； （c） a series of Y ions singlelycharged[HT5][TS）]
3.2.3完整糖肽在ETD碎裂中肽段序列分析ETD碎裂方式是将电子从一个活泼的阴离子基团转移到带正电荷的肽段上，从而诱发肽段序列碎裂产生c、z离子。由于ETD的软碎裂模式，翻译后修饰的基团常得以保留，因此有利于准确识别修饰位点。如图7所示，m/z 967.93的Man5糖肽在ETD谱图中，产生肽段骨架结构的碎片离子，从C3～C5及Z4～Z6两组离子中，得到该糖肽的肽段序列为SRNLTK。从C2～C3及Z3～Z4之间，有大范围的质量跳跃，可以清晰指示糖基化位点。
综上所述，CID主要产生糖苷键断裂的碎片，为糖链的结构组成分析提供了线索；HCD在低分子量区域提供了糖链的特征离子信息，并产生明确的糖肽Y1特征离子，同时也产生部分糖苷键断裂的碎片，为糖链结构信息提供参考；ETD保留了完整的修饰基团而产生肽段骨架的断裂，可以提供有效的肽段序列信息。因此，联合CID、HCD、ETD等多种碎裂方式，即可得到糖链结构、糖基化位点和肽段序列等糖蛋白质结构的全面信息。
4结论
本研究从解析完整糖肽水平入手，用自制HILIC亲水相互作用小柱富集纯化样品中的糖肽并保持其完整性，采用LTQOrbitrap质谱检测，联合CID、HCD、ETD等多种碎裂方式分析糖肽结构。因此，本方法在有效富集糖肽的同时，获取了肽段序列以及糖基化位点信息，并且能够得到位点特异的糖型结构，为糖蛋白结构的进一步解析提供了一种简单、有效的方法。虽然不同碎裂条件下所获得的糖肽谱图均比较复杂，且糖链结构解析缺乏有效的数据库，规模化糖肽数据的解析还比较困难，但随着计算机自动化软件的进一步发展，亲水作用色谱联合多重碎裂方式的串联质谱方法将在糖蛋白质结构解析中发挥更大的作用。
[TS（][HT5”SS]图4母离子为[M+2H]2+ m/z 967.93糖肽的CID碎裂二级质谱图（方块为N乙酰葡萄糖胺，圆圈为甘露糖）
Fig.4MS/MS spectrum of glycopeptide by collisioninduced dissociation （CID） fragmentation， the precursor ion [M+2H]2+ m/z 967.93 （squares， Nacetylhexoseamine， HexNAc； circles， Hexose， Hex）[HT5][TS）]
3.2.2完整糖肽在HCD模式下碎裂能量的优化在HCD碰撞模式下，累积后的母离子将被注入HCD碰撞池中与中性氮气分子碰撞，碎裂后经CTrap送入Orbitrap检测。此处仍然采用肽段序列SRNLTK上连接Man5的糖肽，m/z 967.93为检测对象。依次提高HCD的碰撞能量，在20%能量下，糖肽的碎裂基本与CID 30%能量碎裂时一致。当HCD能量为25%时，糖肽的谱图如图5所示。在低分子量区域，产生系列糖的特征离子，如m/z 204（HexNAc+H）+，m/z 366（HexNAc+Hex+H）+，以及氧鎓离子m/z 204（HexNAc+H）+继续碎裂而产生的碎片离子，例如m/z 126， 138， 168和186等。由于HCD模式下不存在离子阱质谱仪CID模式下的低质量端1/3质量丢失，使得上述糖碎片离子得以检测。在中高分子量区域，HCD谱图得到一系列的逐一丢失单糖的Y系列碎片离子，各离子有1电荷与双电荷两种状态，故形成两组m/z不同的离子峰。其中Y1（肽段+HexNAc+H）+离子峰m/z 921.45强度高，因此Y1离子和糖碎片氧鎓离子是显著的糖肽离子特征峰。
[TS（][HT5”SS]图5母离子为[M+2H]2+ m/z 967.93糖肽的HCD碎裂二级质谱图（方块为N乙酰葡萄，圆圈为甘露糖）。插图显示低质量端糖碎片离子
Fig.5MS/MS spectrum of glycopeptide by high energy collisional dissociation （HCD） fragmentation， the precursor ion [M+2H]2+ m/z 967.93 （ squares， Nacetylhexoseamine， HexNAc； circles， Hexose， Hex）. Insert view showed the fragment ions of glycans in the low mass region[HT5][TS）]
由图6可见，不同的HCD碰撞能量下，糖肽的特征离子相对丰度各有不同。随着HCD能量的增加，糖的特征碎片离子信号不断升高，其中可以继续碎裂的m/z 204与366离子在能量大于25%时开始降低。同时，双电荷状态下的Y系列离子主要在20%～25%的中高能量下信号较高，随着能量的进一步加强，双电荷离子完全碎裂。1电荷的Y碎片离子系列，在HCD能量25%时达到高峰，但并不随能量的提高而继续增强。故采用HCD能量为25%，对糖肽进行碰撞解离，其二级谱图可以得到最为充分的信息。 [TS（][HT5”SS]图6不同HCD碎裂能量下，糖肽二级谱图中碎片离子的相对丰度： （a） 糖的特征离子；（b）双电荷的Y系列离子；（c）1电荷的Y系列离子
Fig.6Relative intensity of glycopeptides′ fragment ions in different HCD energy （a） carbohydratespecific ions； （b） a series of Y ions doublelycharged； （c） a series of Y ions singlelycharged[HT5][TS）]
3.2.3完整糖肽在ETD碎裂中肽段序列分析ETD碎裂方式是将电子从一个活泼的阴离子基团转移到带正电荷的肽段上，从而诱发肽段序列碎裂产生c、z离子。由于ETD的软碎裂模式，翻译后修饰的基团常得以保留，因此有利于准确识别修饰位点。如图7所示，m/z 967.93的Man5糖肽在ETD谱图中，产生肽段骨架结构的碎片离子，从C3～C5及Z4～Z6两组离子中，得到该糖肽的肽段序列为SRNLTK。从C2～C3及Z3～Z4之间，有大范围的质量跳跃，可以清晰指示糖基化位点。
综上所述，CID主要产生糖苷键断裂的碎片，为糖链的结构组成分析提供了线索；HCD在低分子量区域提供了糖链的特征离子信息，并产生明确的糖肽Y1特征离子，同时也产生部分糖苷键断裂的碎片，为糖链结构信息提供参考；ETD保留了完整的修饰基团而产生肽段骨架的断裂，可以提供有效的肽段序列信息。因此，联合CID、HCD、ETD等多种碎裂方式，即可得到糖链结构、糖基化位点和肽段序列等糖蛋白质结构的全面信息。
4结论
本研究从解析完整糖肽水平入手，用自制HILIC亲水相互作用小柱富集纯化样品中的糖肽并保持其完整性，采用LTQOrbitrap质谱检测，联合CID、HCD、ETD等多种碎裂方式分析糖肽结构。因此，本方法在有效富集糖肽的同时，获取了肽段序列以及糖基化位点信息，并且能够得到位点特异的糖型结构，为糖蛋白结构的进一步解析提供了一种简单、有效的方法。虽然不同碎裂条件下所获得的糖肽谱图均比较复杂，且糖链结构解析缺乏有效的数据库，规模化糖肽数据的解析还比较困难，但随着计算机自动化软件的进一步发展，亲水作用色谱联合多重碎裂方式的串联质谱方法将在糖蛋白质结构解析中发挥更大的作用。
[TS（][HT5”SS]图4母离子为[M+2H]2+ m/z 967.93糖肽的CID碎裂二级质谱图（方块为N乙酰葡萄糖胺，圆圈为甘露糖）
Fig.4MS/MS spectrum of glycopeptide by collisioninduced dissociation （CID） fragmentation， the precursor ion [M+2H]2+ m/z 967.93 （squares， Nacetylhexoseamine， HexNAc； circles， Hexose， Hex）[HT5][TS）]
3.2.2完整糖肽在HCD模式下碎裂能量的优化在HCD碰撞模式下，累积后的母离子将被注入HCD碰撞池中与中性氮气分子碰撞，碎裂后经CTrap送入Orbitrap检测。此处仍然采用肽段序列SRNLTK上连接Man5的糖肽，m/z 967.93为检测对象。依次提高HCD的碰撞能量，在20%能量下，糖肽的碎裂基本与CID 30%能量碎裂时一致。当HCD能量为25%时，糖肽的谱图如图5所示。在低分子量区域，产生系列糖的特征离子，如m/z 204（HexNAc+H）+，m/z 366（HexNAc+Hex+H）+，以及氧鎓离子m/z 204（HexNAc+H）+继续碎裂而产生的碎片离子，例如m/z 126， 138， 168和186等。由于HCD模式下不存在离子阱质谱仪CID模式下的低质量端1/3质量丢失，使得上述糖碎片离子得以检测。在中高分子量区域，HCD谱图得到一系列的逐一丢失单糖的Y系列碎片离子，各离子有1电荷与双电荷两种状态，故形成两组m/z不同的离子峰。其中Y1（肽段+HexNAc+H）+离子峰m/z 921.45强度高，因此Y1离子和糖碎片氧鎓离子是显著的糖肽离子特征峰。
[TS（][HT5”SS]图5母离子为[M+2H]2+ m/z 967.93糖肽的HCD碎裂二级质谱图（方块为N乙酰葡萄，圆圈为甘露糖）。插图显示低质量端糖碎片离子
Fig.5MS/MS spectrum of glycopeptide by high energy collisional dissociation （HCD） fragmentation， the precursor ion [M+2H]2+ m/z 967.93 （ squares， Nacetylhexoseamine， HexNAc； circles， Hexose， Hex）. Insert view showed the fragment ions of glycans in the low mass region[HT5][TS）]
由图6可见，不同的HCD碰撞能量下，糖肽的特征离子相对丰度各有不同。随着HCD能量的增加，糖的特征碎片离子信号不断升高，其中可以继续碎裂的m/z 204与366离子在能量大于25%时开始降低。同时，双电荷状态下的Y系列离子主要在20%～25%的中高能量下信号较高，随着能量的进一步加强，双电荷离子完全碎裂。1电荷的Y碎片离子系列，在HCD能量25%时达到高峰，但并不随能量的提高而继续增强。故采用HCD能量为25%，对糖肽进行碰撞解离，其二级谱图可以得到最为充分的信息。 [TS（][HT5”SS]图6不同HCD碎裂能量下，糖肽二级谱图中碎片离子的相对丰度： （a） 糖的特征离子；（b）双电荷的Y系列离子；（c）1电荷的Y系列离子
Fig.6Relative intensity of glycopeptides′ fragment ions in different HCD energy （a） carbohydratespecific ions； （b） a series of Y ions doublelycharged； （c） a series of Y ions singlelycharged[HT5][TS）]
3.2.3完整糖肽在ETD碎裂中肽段序列分析ETD碎裂方式是将电子从一个活泼的阴离子基团转移到带正电荷的肽段上，从而诱发肽段序列碎裂产生c、z离子。由于ETD的软碎裂模式，翻译后修饰的基团常得以保留，因此有利于准确识别修饰位点。如图7所示，m/z 967.93的Man5糖肽在ETD谱图中，产生肽段骨架结构的碎片离子，从C3～C5及Z4～Z6两组离子中，得到该糖肽的肽段序列为SRNLTK。从C2～C3及Z3～Z4之间，有大范围的质量跳跃，可以清晰指示糖基化位点。
综上所述，CID主要产生糖苷键断裂的碎片，为糖链的结构组成分析提供了线索；HCD在低分子量区域提供了糖链的特征离子信息，并产生明确的糖肽Y1特征离子，同时也产生部分糖苷键断裂的碎片，为糖链结构信息提供参考；ETD保留了完整的修饰基团而产生肽段骨架的断裂，可以提供有效的肽段序列信息。因此，联合CID、HCD、ETD等多种碎裂方式，即可得到糖链结构、糖基化位点和肽段序列等糖蛋白质结构的全面信息。
4结论
本研究从解析完整糖肽水平入手，用自制HILIC亲水相互作用小柱富集纯化样品中的糖肽并保持其完整性，采用LTQOrbitrap质谱检测，联合CID、HCD、ETD等多种碎裂方式分析糖肽结构。因此，本方法在有效富集糖肽的同时，获取了肽段序列以及糖基化位点信息，并且能够得到位点特异的糖型结构，为糖蛋白结构的进一步解析提供了一种简单、有效的方法。虽然不同碎裂条件下所获得的糖肽谱图均比较复杂，且糖链结构解析缺乏有效的数据库，规模化糖肽数据的解析还比较困难，但随着计算机自动化软件的进一步发展，亲水作用色谱联合多重碎裂方式的串联质谱方法将在糖蛋白质结构解析中发挥更大的作用。
