硫酸链霉素分子印迹传感器的研究

陈怡等
摘要:基于分子印迹技术,以硫酸链霉素(STR)为模板分子,邻苯二胺(OPD)为功能单体,通过循环伏安电聚合在玻碳电极表面构建出对STR具有选择特异性的电化学传感器,且制备过程中STR无需衍生处理。以K3[Fe(CN)6]为探针的方波伏安(SWV)分析,模板分子与单体的摩尔配比为1∶4、洗脱溶剂为70%乙醇溶液,在此条件下制备的传感器性能良好。
关键词:硫酸链霉素; 邻苯二胺; 分子印迹; 电聚合; 电化学传感器
1引言
链霉素(Streptomycin)是一种氨基糖苷类广谱抗生素,对革兰氏阴性菌和部分革兰氏阳性菌有显著的抗菌活性,广泛应用于饲料添加剂和动物疾病治疗中,临床上一般使用其硫酸盐。然而,链霉素具有肾毒性和耳毒性,能够引起过敏反应,滥用、不遵守休药期、超量用药造成的药物残留直接或通过诱导抗性菌株间接威胁人、畜的健康[1~4]。链霉素残留物主要存在于肉类,肝,肾,牛奶以及蜂蜜中。
目前,国内外关于链霉素检测的报道主要有基于微生物的检测法[5]、免疫学检测法[6,7]和仪器分析法[1,8,9]。微生物法所需设备简单,但不易筛选到特异敏感菌株,易受条件限制,灵敏度低;酶联免疫法和微生物法易产生假阳性结果,通常仅用于普通筛查;高效液相色谱法(HPLC)、液相色谱串联质谱法(LCMS/MS)等方法灵敏高。但是,链霉素缺少紫外吸收生色基团,往往需要进行一系列柱前或者柱后衍生处理后再进行检测,操作繁琐、耗时长,而且大型设备的使用对操作人员要求较高,检测成本高[10]。
分子印迹聚合物(MIPs)具有成本低,易于合成,在高温、有机溶剂、酸碱等条件下稳定性高的特点[11],已作为传感器识别元件应用于环保、生物分析、食品和医药等领域,提供定量或半定量检测分析 [12~14]。采用电聚合方法制备分子印迹聚合膜操作简便,膜厚可控,特异性强,重现性高,且可以水溶液中完成聚合[15]。文献[16,17]采用此法制备的分子印迹聚合膜选择性、灵敏度及重现性良好。本实验以硫酸链霉素为模板分子、邻苯二胺为功能单体,经电化学聚合制备了硫酸链霉素分子印迹电化学传感器,实验过程中无需对链霉素进行衍生处理,而是间接地通过电化学手段分析,操作简单快捷,特异性强,灵敏度较高,成本低,为小型化和自动化的电化学传感器的研究提供依据。2实验部分
2.1仪器与试剂
LK2005A 型电化学工作站(天津市兰力科化学电子高技术有限公司);三电极系统:玻碳电极(GCE,Φ=4 mm)为工作电极,Ag/AgCl电极为参比电极,铂片电极为对电极(天津艾达恒晟科技发展有限公司);超声波清洗机(宁波新芝生物科技股份有限公司)。
硫酸链霉素(Streptomycin sulfate,STR,纯度>99%,上海生工生物有限公司);邻苯二胺(oPhenylenediamine,OPD,分析纯,北京鼎国生物科技有限责任公司); K3[Fe(CN)6](分析纯,天津市永大化学试剂开发中心);其余试剂均为分析纯。
2.2玻碳电极预处理
将玻碳电极依次在涂有0.3 和0.05 μm Al2O3浆液的麂皮上抛光至镜面,再用HNO3溶液(1∶1, V/V)、无水乙醇和二次蒸馏水分别超声清洗3 min。将电极置于0.5 mol/L H2SO4溶液中,在-1.0~+0.8 V电位区间内, 以0.1 V/s的扫速进行循环伏安(CV)扫描,待循环伏安响应稳定,氧化峰和还原峰的电位差小于80 mV,电极预处理完成。
2.3分子印迹膜的制备
将处理好的电极浸入含有20 mmol/L邻苯二胺、5 mmol/L硫酸链霉素和0.2 mol/L 磷酸盐缓冲液(PBS,pH 5.0)的聚合底液(含0.1 mol/L KCl,作为支持电解质),通纯N2 预聚合10 min后,在0~0.8 V的电位区间内采用CV扫描20圈,扫速为0.05 V/s。电极取出后,经70%乙醇溶液洗脱后得到硫酸链霉素分子印迹聚合膜电极(MIP/GCE)。非印迹聚合膜电极(NIP/GCE)的制备以同样的方法进行,只是聚合物底液中不加入模板分子。
2.4印迹膜的洗脱
制备多支印迹及非印迹电极,分别浸入到1 mol/L NaOH溶液、1 mol/L H2SO4溶液和70% 乙醇溶液中洗脱若干分钟,取出后用二次蒸馏水淋洗5 min,以洗脱出模板分子,并在含有4 mmol/L K3[Fe(CN)6] 的PBS缓冲液中洗脱,采用方波伏安法(SWV)比较洗脱效果。实验中印迹膜电极制备的条件相同,但是由于裸玻碳电极每次打磨抛光情况不能确保一致,会造成制备的印迹膜存在轻微差异。为了减小误差,洗脱效果用溶剂洗脱前后电极在K3[Fe(CN)6]溶液中检测到的方波伏安峰电流变化值(Δip)表征。
摘要:基于分子印迹技术,以硫酸链霉素(STR)为模板分子,邻苯二胺(OPD)为功能单体,通过循环伏安电聚合在玻碳电极表面构建出对STR具有选择特异性的电化学传感器,且制备过程中STR无需衍生处理。以K3[Fe(CN)6]为探针的方波伏安(SWV)分析,模板分子与单体的摩尔配比为1∶4、洗脱溶剂为70%乙醇溶液,在此条件下制备的传感器性能良好。
关键词:硫酸链霉素; 邻苯二胺; 分子印迹; 电聚合; 电化学传感器
1引言
链霉素(Streptomycin)是一种氨基糖苷类广谱抗生素,对革兰氏阴性菌和部分革兰氏阳性菌有显著的抗菌活性,广泛应用于饲料添加剂和动物疾病治疗中,临床上一般使用其硫酸盐。然而,链霉素具有肾毒性和耳毒性,能够引起过敏反应,滥用、不遵守休药期、超量用药造成的药物残留直接或通过诱导抗性菌株间接威胁人、畜的健康[1~4]。链霉素残留物主要存在于肉类,肝,肾,牛奶以及蜂蜜中。
目前,国内外关于链霉素检测的报道主要有基于微生物的检测法[5]、免疫学检测法[6,7]和仪器分析法[1,8,9]。微生物法所需设备简单,但不易筛选到特异敏感菌株,易受条件限制,灵敏度低;酶联免疫法和微生物法易产生假阳性结果,通常仅用于普通筛查;高效液相色谱法(HPLC)、液相色谱串联质谱法(LCMS/MS)等方法灵敏高。但是,链霉素缺少紫外吸收生色基团,往往需要进行一系列柱前或者柱后衍生处理后再进行检测,操作繁琐、耗时长,而且大型设备的使用对操作人员要求较高,检测成本高[10]。
分子印迹聚合物(MIPs)具有成本低,易于合成,在高温、有机溶剂、酸碱等条件下稳定性高的特点[11],已作为传感器识别元件应用于环保、生物分析、食品和医药等领域,提供定量或半定量检测分析 [12~14]。采用电聚合方法制备分子印迹聚合膜操作简便,膜厚可控,特异性强,重现性高,且可以水溶液中完成聚合[15]。文献[16,17]采用此法制备的分子印迹聚合膜选择性、灵敏度及重现性良好。本实验以硫酸链霉素为模板分子、邻苯二胺为功能单体,经电化学聚合制备了硫酸链霉素分子印迹电化学传感器,实验过程中无需对链霉素进行衍生处理,而是间接地通过电化学手段分析,操作简单快捷,特异性强,灵敏度较高,成本低,为小型化和自动化的电化学传感器的研究提供依据。2实验部分
2.1仪器与试剂
LK2005A 型电化学工作站(天津市兰力科化学电子高技术有限公司);三电极系统:玻碳电极(GCE,Φ=4 mm)为工作电极,Ag/AgCl电极为参比电极,铂片电极为对电极(天津艾达恒晟科技发展有限公司);超声波清洗机(宁波新芝生物科技股份有限公司)。
硫酸链霉素(Streptomycin sulfate,STR,纯度>99%,上海生工生物有限公司);邻苯二胺(oPhenylenediamine,OPD,分析纯,北京鼎国生物科技有限责任公司); K3[Fe(CN)6](分析纯,天津市永大化学试剂开发中心);其余试剂均为分析纯。
2.2玻碳电极预处理
将玻碳电极依次在涂有0.3 和0.05 μm Al2O3浆液的麂皮上抛光至镜面,再用HNO3溶液(1∶1, V/V)、无水乙醇和二次蒸馏水分别超声清洗3 min。将电极置于0.5 mol/L H2SO4溶液中,在-1.0~+0.8 V电位区间内, 以0.1 V/s的扫速进行循环伏安(CV)扫描,待循环伏安响应稳定,氧化峰和还原峰的电位差小于80 mV,电极预处理完成。
2.3分子印迹膜的制备
将处理好的电极浸入含有20 mmol/L邻苯二胺、5 mmol/L硫酸链霉素和0.2 mol/L 磷酸盐缓冲液(PBS,pH 5.0)的聚合底液(含0.1 mol/L KCl,作为支持电解质),通纯N2 预聚合10 min后,在0~0.8 V的电位区间内采用CV扫描20圈,扫速为0.05 V/s。电极取出后,经70%乙醇溶液洗脱后得到硫酸链霉素分子印迹聚合膜电极(MIP/GCE)。非印迹聚合膜电极(NIP/GCE)的制备以同样的方法进行,只是聚合物底液中不加入模板分子。
2.4印迹膜的洗脱
制备多支印迹及非印迹电极,分别浸入到1 mol/L NaOH溶液、1 mol/L H2SO4溶液和70% 乙醇溶液中洗脱若干分钟,取出后用二次蒸馏水淋洗5 min,以洗脱出模板分子,并在含有4 mmol/L K3[Fe(CN)6] 的PBS缓冲液中洗脱,采用方波伏安法(SWV)比较洗脱效果。实验中印迹膜电极制备的条件相同,但是由于裸玻碳电极每次打磨抛光情况不能确保一致,会造成制备的印迹膜存在轻微差异。为了减小误差,洗脱效果用溶剂洗脱前后电极在K3[Fe(CN)6]溶液中检测到的方波伏安峰电流变化值(Δip)表征。
摘要:基于分子印迹技术,以硫酸链霉素(STR)为模板分子,邻苯二胺(OPD)为功能单体,通过循环伏安电聚合在玻碳电极表面构建出对STR具有选择特异性的电化学传感器,且制备过程中STR无需衍生处理。以K3[Fe(CN)6]为探针的方波伏安(SWV)分析,模板分子与单体的摩尔配比为1∶4、洗脱溶剂为70%乙醇溶液,在此条件下制备的传感器性能良好。
关键词:硫酸链霉素; 邻苯二胺; 分子印迹; 电聚合; 电化学传感器
1引言
链霉素(Streptomycin)是一种氨基糖苷类广谱抗生素,对革兰氏阴性菌和部分革兰氏阳性菌有显著的抗菌活性,广泛应用于饲料添加剂和动物疾病治疗中,临床上一般使用其硫酸盐。然而,链霉素具有肾毒性和耳毒性,能够引起过敏反应,滥用、不遵守休药期、超量用药造成的药物残留直接或通过诱导抗性菌株间接威胁人、畜的健康[1~4]。链霉素残留物主要存在于肉类,肝,肾,牛奶以及蜂蜜中。
目前,国内外关于链霉素检测的报道主要有基于微生物的检测法[5]、免疫学检测法[6,7]和仪器分析法[1,8,9]。微生物法所需设备简单,但不易筛选到特异敏感菌株,易受条件限制,灵敏度低;酶联免疫法和微生物法易产生假阳性结果,通常仅用于普通筛查;高效液相色谱法(HPLC)、液相色谱串联质谱法(LCMS/MS)等方法灵敏高。但是,链霉素缺少紫外吸收生色基团,往往需要进行一系列柱前或者柱后衍生处理后再进行检测,操作繁琐、耗时长,而且大型设备的使用对操作人员要求较高,检测成本高[10]。
分子印迹聚合物(MIPs)具有成本低,易于合成,在高温、有机溶剂、酸碱等条件下稳定性高的特点[11],已作为传感器识别元件应用于环保、生物分析、食品和医药等领域,提供定量或半定量检测分析 [12~14]。采用电聚合方法制备分子印迹聚合膜操作简便,膜厚可控,特异性强,重现性高,且可以水溶液中完成聚合[15]。文献[16,17]采用此法制备的分子印迹聚合膜选择性、灵敏度及重现性良好。本实验以硫酸链霉素为模板分子、邻苯二胺为功能单体,经电化学聚合制备了硫酸链霉素分子印迹电化学传感器,实验过程中无需对链霉素进行衍生处理,而是间接地通过电化学手段分析,操作简单快捷,特异性强,灵敏度较高,成本低,为小型化和自动化的电化学传感器的研究提供依据。2实验部分
2.1仪器与试剂
LK2005A 型电化学工作站(天津市兰力科化学电子高技术有限公司);三电极系统:玻碳电极(GCE,Φ=4 mm)为工作电极,Ag/AgCl电极为参比电极,铂片电极为对电极(天津艾达恒晟科技发展有限公司);超声波清洗机(宁波新芝生物科技股份有限公司)。
硫酸链霉素(Streptomycin sulfate,STR,纯度>99%,上海生工生物有限公司);邻苯二胺(oPhenylenediamine,OPD,分析纯,北京鼎国生物科技有限责任公司); K3[Fe(CN)6](分析纯,天津市永大化学试剂开发中心);其余试剂均为分析纯。
2.2玻碳电极预处理
将玻碳电极依次在涂有0.3 和0.05 μm Al2O3浆液的麂皮上抛光至镜面,再用HNO3溶液(1∶1, V/V)、无水乙醇和二次蒸馏水分别超声清洗3 min。将电极置于0.5 mol/L H2SO4溶液中,在-1.0~+0.8 V电位区间内, 以0.1 V/s的扫速进行循环伏安(CV)扫描,待循环伏安响应稳定,氧化峰和还原峰的电位差小于80 mV,电极预处理完成。
2.3分子印迹膜的制备
将处理好的电极浸入含有20 mmol/L邻苯二胺、5 mmol/L硫酸链霉素和0.2 mol/L 磷酸盐缓冲液(PBS,pH 5.0)的聚合底液(含0.1 mol/L KCl,作为支持电解质),通纯N2 预聚合10 min后,在0~0.8 V的电位区间内采用CV扫描20圈,扫速为0.05 V/s。电极取出后,经70%乙醇溶液洗脱后得到硫酸链霉素分子印迹聚合膜电极(MIP/GCE)。非印迹聚合膜电极(NIP/GCE)的制备以同样的方法进行,只是聚合物底液中不加入模板分子。
2.4印迹膜的洗脱
制备多支印迹及非印迹电极,分别浸入到1 mol/L NaOH溶液、1 mol/L H2SO4溶液和70% 乙醇溶液中洗脱若干分钟,取出后用二次蒸馏水淋洗5 min,以洗脱出模板分子,并在含有4 mmol/L K3[Fe(CN)6] 的PBS缓冲液中洗脱,采用方波伏安法(SWV)比较洗脱效果。实验中印迹膜电极制备的条件相同,但是由于裸玻碳电极每次打磨抛光情况不能确保一致,会造成制备的印迹膜存在轻微差异。为了减小误差,洗脱效果用溶剂洗脱前后电极在K3[Fe(CN)6]溶液中检测到的方波伏安峰电流变化值(Δip)表征。
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