高效的西瓜CRISPR/cas9基因敲除技术

    田守蔚 姜临建 高嫱 张洁 宗梅 张海英 任毅 郭绍贵 宫国义 刘凡 许勇

    

    

    目的与意义：基因编辑技术在植物基因功能鉴定以及重要农艺性状突变获得方面具有重要应用价值。CRISPR/Cas9基因编辑技术已应用于许多植物物种，成功实现了靶点突变。然而，目前在西瓜上还没有CRISPR/Cas9基因编辑技术相关的研究报道，该技术能否成功应用于西瓜研究及育种仍未可知。以西瓜的ClPDS基因（编码八氢番茄红素脱氢酶，突变后植株有明显白化表型）为靶基因，尝试建立西瓜CRISPR/Cas9基因编辑技术体系，以期利用该技术在西瓜基因组实现精准编辑。

    材料与方法：以西瓜自交系‘PI179878为供试材料，利用PEG介导的原生质体转化方法测试靶点特异性与效率，利用农杆菌介导法转化西瓜子叶建立西瓜稳定遗传转化体系，利用酶切、测序等方法检测突变效率及突变类型。

    结果与分析：（1）靶点选择与载体构建：选择西瓜PDS基因ClPDS（Cla010898）作为Cas9核酸内切酶的靶基因。在第1和第3外显子分别选择1个靶点，BanI和XhoI酶切位点分别在这2个靶点预测的切割位点上，有利于识别突变。每个靶点的sgRNA分别被克隆到以pGreen为骨架的PHSN401载体中，命名为PHSN1和PHSN2，用于原生质体转化。2个靶点同时被克隆到pCAMBIA为骨架的PHSE401载体中用于农杆菌介导的西瓜遗传转化。（2）CRISPR/Cas9介导西瓜原生质体ClPDS突变：利用PEG介导的原生质体转染检测靶点的效率，采用PCR/限制性内切酶（PCR/RE）试验检测靶位点的突变并估计突变率。PHSN1或PHSN2分别转染到西瓜原生质体细胞中，打靶效率分别为51.6和42.1%。结果表明，构建的CRISPR/Cas9载体可在西瓜细胞中瞬时表达，Cas9/sgRNA复合体可以高效地对这2个靶点进行打靶。（3）CRISPR/Cas9介导西瓜植株ClPDS突变：对西瓜进行农杆菌介导的遗传转化，共获得16株转基因植株，这些植株均表现出纯的或嵌合的白化表型。限制性内切酶消化PCR产物表明，这2个靶点在16株转基因株系中均发生编辑。随机选择纯白化株系10、株系14和嵌合白化株系3进行PCR和Sanger测序。对于靶点1，株系3是杂合的，株系10和14为嵌合体。对于靶点2，株系3和株系10为单等位基因纯合，分别有7 bp的缺失和1个bp的插入。株系14是杂合体，一个等位基因缺失17bp，另一个等位基因缺失5bp（原图3）。（4）潜在脱靶性分析：PCR产物测序结果表明，与目的靶点序列相似的潜在靶点未发生突变，说明sgRNAs介导的CRISPR/Cas9编辑系统对西瓜ClPDS基因的定向突变具有高的特异性。

    结? ? 論：CRISPR/Cas9基因编辑系统可以通过瞬时转化或稳定遗传转化进行西瓜基因的定点编辑，所获T0阳性植株含有ClPDS突变并表现出明显白化表型，表明CRISPR/Cas9系统在转化株系中具有高的基因编辑效率。CRISPR/Cas9基因编辑系统在单个转化事件中可以实现多个靶点的高效打靶，并在T0代即有可能获得纯合突变株。CRISPR/Cas9基因编辑系统将成为西瓜基因功能研究和遗传改良的有利工具。