豆类植物接种微生物对土壤DEHP的降解效果研究
何诗琳 谢方文
摘要：邻苯二甲酸二（2-乙基己）酯（Di-（2-ethylhexyl）phthalate，DEHP）是使用最广和产量最大的塑化剂，属于内分泌干扰物，具有致癌、致畸、致突变的“三致”效应。随着DEHP的广泛应用，土壤和水体已经受到了不同程度的污染。如何有效修复受DEHP等邻苯二甲酸酯化合物（Phthalic Acid Esters，PAEs）污染的土壤已成为当前研究的热点之一。在此背景下，本文采用黄豆（Glycine max）与芽孢杆菌（Bacillus sp1）（DW）、革登氏菌（Gordona sp1）（DH）联合，通过盆栽实验研究土壤中DEHP的残留状态，并探讨豆类植物接种微生物对DEHP降解的影响，以期为植物-微生物联合修复DEHP污染土壤提供科学依据。
关键词：邻苯二甲酸二（2-乙基己）酯；植物-微生物联合修复；有机物污染土壤
中图分类号：X131.3 文献标识码：A 文章编号：2095-672X（2018）05-0120-02
DOI：10.16647/j.cnki.cn15-1369/X.2018.05.071
Abstract： Di-（2-ethylhexyl）phthalate （DEHP） is the most widely used and most powerful plasticizer. It belongs to endocrine disruptors and has carcinogenic and teratogenic effects. Mutagenic “triple” effect. With the widespread use of DEHP， soil and water have been polluted to varying degrees. The restoration of contaminated soils such as DEHP and other Phthalic Acid Esters （PAEs） has become one of the current research hotspots. In this study， soybean （Glycine max） was combined with Bacillus sp1 （DW） and Gordona sp1 （DH） to study the residual status of DEHP in soil by pot experiment to investigate the inoculation of legumes on legumes. The effect of DEHP degradation provided a scientific basis for plant-microorganism combined repair of DEHP-contaminated soil.
Key words： Di（2-ethylhexyl） phthalate； Plant-microorganism combined repair； Organic matter contaminated soil
DEHP是目前世界上生产量大、应用面较广的人工合成有机化合物之一。因其能够改善塑料产品的柔軟性和耐寒性，增大产品的可塑性，提高产品的强度，而被作为增塑剂，被广泛应用于食品包装材料、容器、医疗用品、建筑产品、衣物以及人造革等领域[1]。
但DEHP在使用过程中也存在用量大、毒性高、降解难等突出的环保问题，且DEHP属内分泌干扰物，其具有致癌、致畸、致突变的“三致”效应。此外，DEHP还可对人类基因的表达有重要影响，并且在适当浓度下它可能影响胎儿神经系统的发育从而导致出生缺陷[2]。在土壤中，高浓度DEHP对测试生物都产生了一定程度的危害，反过来，土壤生物（主要是细菌）可富集或降解DEHP，降解作用只有在DEHP浓度较低时，才很明显[3]。农业土壤中，DEHP施加量达100mg/kg时显著抑制了土壤脱氢酶活性，导致了土壤为生物群落功能多样性的下降。DEHP还能使植物生长缓慢，减少产量，影响作物品质，作物对土壤中DEHP还有一定的吸收累积效应，从而对人体健康构成威胁[4]。
1 材料与方法
1.1 试验材料与仪器
试验材料：本实验供试作物包括黄豆（Glycine max）、DEHP高效降解菌株芽孢杆菌Bacillus sp1 （DW） 和革登氏菌Gordona sp1（DH）。
试验用土壤：采自水稻土耕作层（0-20cm），风干、磨碎后过5.0mm筛备用，配置污染土所需土样过1.0mm铜筛。
1.2 植物-微生物联合降解研究
1.2.1 污染土壤的制备
取适量过1.0mm铜筛的土壤，分层淋入DEHP储备液，使其浓度达到500mg/kg，置于阴凉处并翻动3-5遍以使DEHP混合均匀。待丙酮挥发完全后，取适量过5.0mm铜筛的土壤与上述污染土混合制成浓度为50mg/kg的污染土壤，同时混入预先准备好的尿素、磷酸二氢钾、氯化钾（用量为N：0.20g/kg土，P：0.15g/kg土，K：0.20g/kg土），装到干净瓷盆中，每盆装土5kg。向装填好的瓷盆中每盆添加500mL蒸馏水，使其持水量保持在30%～40%。盆栽前，空白土壤和人工配置的污染土壤PAEs含量水平分别为0.372mg/kg（干重）和 50.435 mg/kg（干重）。
1.2.2 菌种的培养与保存
采用LB培养基（蛋白胨，10g/L；酵母，5g/L；氯化钠，5g/L；蒸馏水，1L）将保存在斜面中的DW1和DH3转接到平板和斜面，再将分离无杂菌的DW1和DH3分别保存到甘油管，另一部分以斜面保存。
接种菌株DW和DH于100mL 富集培养基 （3g/L牛肉膏、5g/L蛋白胨、5g/L NaCl、pH 7.0） 中，121℃湿热灭菌30min，30℃振荡培养48h，10000r/min离心5min， 收集菌体，0.1mol/L的MgSO4·7H2O洗涤菌体3次，最后用0.1mol/L的MgSO4·7H2O将菌体悬浮，测定细菌悬液的光密度（λ=600nm） 并调整至密度约为1012个/mL。
1.2.3 盆栽实验方法
室内人工配置一定浓度DEHP污染土壤（50mg/kg），设置土壤接种DW、DH、DW+DH（1：1）以及不接种降解菌的对照（CK）共4个处理。
播种时，在瓷盆中挖一个深约2cm的圆环，均匀撒入6-10颗种子，将50mL菌液缓慢均匀地喷淋在圆环内外两侧，最后浇水两次。设置不种植豆类的空白土壤（分别接种DW、DH、DW+DH（1：1）以及不接种降解菌）。
分别于不同时间采集土壤（15d、25d、40d、60d）和豆类（60d）样品，测定样品中DEHP含量。
1.2.4 样品预处理流程
样品预处理采用超声波提取法。提取液在特定温度下采用旋转蒸发仪浓缩至5mL左右，采用三氧化二铝-硅胶-无水硫酸钠层析柱净化分离，用约40mL的二氯甲苯进行洗脱。洗脱液用旋转蒸发仪浓缩至<0.5mL，转移至棕色样品瓶（2.0mL），用GC-MS测定。
2 结果分析
土壤-豆类-菌株系统中DEHP的残留特征：
根据图1，DEHP污染水平相同的情况下，无论是否接种豆类，土壤DEHP残留含量与栽种时间呈负相关，随着栽种时间的延长，土壤DEHP含量均有一定程度下降。在前15d内，DEHP的降解速率较慢；在15～40d的时间段内，DEHP的降解速率较快；40d之后，其降解速率趋于缓慢。不种植豆类的空白土壤DEHP降解速度呈匀速状态，平稳而且缓慢。在50d后，空白土壤比种植黄豆的土壤DEHP残留浓度更低，说明豆类在短时间内是会促进DEHP降解，50d以后，豆类对DEHP的吸收有可能对DEHP酶促降解产生影响。
根据图2，所有的接种处理，无论是单独接种或是联合接种，与对照相比，均明显降低了土壤中DEHP含量，影响从大到小依次是DH+DW>DH>DW；菌株-黄豆联合种植土壤DEHP残留浓度更低，说明黄豆的种植对于DEHP的降解有一定的促進作用。
3 结论
（1）土壤-豆类-菌株系统中，土壤中DEHP含量随着时间增加而下降，在前15d内，DEHP的降解速率最慢，在15～40d的时间段内，DEHP的降解速率最快，40d之后，降解速率趋于缓慢。
（2）土壤中接种菌株后，DEHP降解能力增强，革登氏菌对DEHP降解能力大于芽孢杆菌，联合接种比单一接种降解能力更强。豆类植物在快速生长期（约50d内）对菌株降解DEHP有促进作用。
参考文献
[1]谢沁珊，王杉杉，蔡凤云等.塑料增塑剂DEHP环境污染水平、人体负荷及生物毒性的初步研究[J].公共卫生与预防医学，2010，5（21）：19-22.
[2]Svechnikova I， Svechnikov K， Soder O. The influence of di-（2-ethylhexyl） phthalate on steroidogenesis by the ovarian granulosa cells of immature femals rats[J].Journal of Endocrinology，2007，194（3）：603-609.
[3]陈强，孙红文，王兵等.邻苯二甲酸二异辛酯（DEHP）对土壤中微生物和动物的影响[J].农业环境科学学报，2004，23（6）：1156-1159.
[4]曾巧云，莫测辉，蔡全英.农业土壤中邻苯二甲酸酯的污染现状与危害[J].广东农业科学，2009，（7）：90-96.
收稿日期：2018-04-06
作者简介：何诗琳（1990-），女，现工作于北京建工环境修复股份有限公司，助理工程师，研究方向为污染场地修复。
摘要：邻苯二甲酸二（2-乙基己）酯（Di-（2-ethylhexyl）phthalate，DEHP）是使用最广和产量最大的塑化剂，属于内分泌干扰物，具有致癌、致畸、致突变的“三致”效应。随着DEHP的广泛应用，土壤和水体已经受到了不同程度的污染。如何有效修复受DEHP等邻苯二甲酸酯化合物（Phthalic Acid Esters，PAEs）污染的土壤已成为当前研究的热点之一。在此背景下，本文采用黄豆（Glycine max）与芽孢杆菌（Bacillus sp1）（DW）、革登氏菌（Gordona sp1）（DH）联合，通过盆栽实验研究土壤中DEHP的残留状态，并探讨豆类植物接种微生物对DEHP降解的影响，以期为植物-微生物联合修复DEHP污染土壤提供科学依据。
关键词：邻苯二甲酸二（2-乙基己）酯；植物-微生物联合修复；有机物污染土壤
中图分类号：X131.3 文献标识码：A 文章编号：2095-672X（2018）05-0120-02
DOI：10.16647/j.cnki.cn15-1369/X.2018.05.071
Abstract： Di-（2-ethylhexyl）phthalate （DEHP） is the most widely used and most powerful plasticizer. It belongs to endocrine disruptors and has carcinogenic and teratogenic effects. Mutagenic “triple” effect. With the widespread use of DEHP， soil and water have been polluted to varying degrees. The restoration of contaminated soils such as DEHP and other Phthalic Acid Esters （PAEs） has become one of the current research hotspots. In this study， soybean （Glycine max） was combined with Bacillus sp1 （DW） and Gordona sp1 （DH） to study the residual status of DEHP in soil by pot experiment to investigate the inoculation of legumes on legumes. The effect of DEHP degradation provided a scientific basis for plant-microorganism combined repair of DEHP-contaminated soil.
Key words： Di（2-ethylhexyl） phthalate； Plant-microorganism combined repair； Organic matter contaminated soil
DEHP是目前世界上生产量大、应用面较广的人工合成有机化合物之一。因其能够改善塑料产品的柔軟性和耐寒性，增大产品的可塑性，提高产品的强度，而被作为增塑剂，被广泛应用于食品包装材料、容器、医疗用品、建筑产品、衣物以及人造革等领域[1]。
但DEHP在使用过程中也存在用量大、毒性高、降解难等突出的环保问题，且DEHP属内分泌干扰物，其具有致癌、致畸、致突变的“三致”效应。此外，DEHP还可对人类基因的表达有重要影响，并且在适当浓度下它可能影响胎儿神经系统的发育从而导致出生缺陷[2]。在土壤中，高浓度DEHP对测试生物都产生了一定程度的危害，反过来，土壤生物（主要是细菌）可富集或降解DEHP，降解作用只有在DEHP浓度较低时，才很明显[3]。农业土壤中，DEHP施加量达100mg/kg时显著抑制了土壤脱氢酶活性，导致了土壤为生物群落功能多样性的下降。DEHP还能使植物生长缓慢，减少产量，影响作物品质，作物对土壤中DEHP还有一定的吸收累积效应，从而对人体健康构成威胁[4]。
1 材料与方法
1.1 试验材料与仪器
试验材料：本实验供试作物包括黄豆（Glycine max）、DEHP高效降解菌株芽孢杆菌Bacillus sp1 （DW） 和革登氏菌Gordona sp1（DH）。
试验用土壤：采自水稻土耕作层（0-20cm），风干、磨碎后过5.0mm筛备用，配置污染土所需土样过1.0mm铜筛。
1.2 植物-微生物联合降解研究
1.2.1 污染土壤的制备
取适量过1.0mm铜筛的土壤，分层淋入DEHP储备液，使其浓度达到500mg/kg，置于阴凉处并翻动3-5遍以使DEHP混合均匀。待丙酮挥发完全后，取适量过5.0mm铜筛的土壤与上述污染土混合制成浓度为50mg/kg的污染土壤，同时混入预先准备好的尿素、磷酸二氢钾、氯化钾（用量为N：0.20g/kg土，P：0.15g/kg土，K：0.20g/kg土），装到干净瓷盆中，每盆装土5kg。向装填好的瓷盆中每盆添加500mL蒸馏水，使其持水量保持在30%～40%。盆栽前，空白土壤和人工配置的污染土壤PAEs含量水平分别为0.372mg/kg（干重）和 50.435 mg/kg（干重）。
1.2.2 菌种的培养与保存
采用LB培养基（蛋白胨，10g/L；酵母，5g/L；氯化钠，5g/L；蒸馏水，1L）将保存在斜面中的DW1和DH3转接到平板和斜面，再将分离无杂菌的DW1和DH3分别保存到甘油管，另一部分以斜面保存。
接种菌株DW和DH于100mL 富集培养基 （3g/L牛肉膏、5g/L蛋白胨、5g/L NaCl、pH 7.0） 中，121℃湿热灭菌30min，30℃振荡培养48h，10000r/min离心5min， 收集菌体，0.1mol/L的MgSO4·7H2O洗涤菌体3次，最后用0.1mol/L的MgSO4·7H2O将菌体悬浮，测定细菌悬液的光密度（λ=600nm） 并调整至密度约为1012个/mL。
1.2.3 盆栽实验方法
室内人工配置一定浓度DEHP污染土壤（50mg/kg），设置土壤接种DW、DH、DW+DH（1：1）以及不接种降解菌的对照（CK）共4个处理。
播种时，在瓷盆中挖一个深约2cm的圆环，均匀撒入6-10颗种子，将50mL菌液缓慢均匀地喷淋在圆环内外两侧，最后浇水两次。设置不种植豆类的空白土壤（分别接种DW、DH、DW+DH（1：1）以及不接种降解菌）。
分别于不同时间采集土壤（15d、25d、40d、60d）和豆类（60d）样品，测定样品中DEHP含量。
1.2.4 样品预处理流程
样品预处理采用超声波提取法。提取液在特定温度下采用旋转蒸发仪浓缩至5mL左右，采用三氧化二铝-硅胶-无水硫酸钠层析柱净化分离，用约40mL的二氯甲苯进行洗脱。洗脱液用旋转蒸发仪浓缩至<0.5mL，转移至棕色样品瓶（2.0mL），用GC-MS测定。
2 结果分析
土壤-豆类-菌株系统中DEHP的残留特征：
根据图1，DEHP污染水平相同的情况下，无论是否接种豆类，土壤DEHP残留含量与栽种时间呈负相关，随着栽种时间的延长，土壤DEHP含量均有一定程度下降。在前15d内，DEHP的降解速率较慢；在15～40d的时间段内，DEHP的降解速率较快；40d之后，其降解速率趋于缓慢。不种植豆类的空白土壤DEHP降解速度呈匀速状态，平稳而且缓慢。在50d后，空白土壤比种植黄豆的土壤DEHP残留浓度更低，说明豆类在短时间内是会促进DEHP降解，50d以后，豆类对DEHP的吸收有可能对DEHP酶促降解产生影响。
根据图2，所有的接种处理，无论是单独接种或是联合接种，与对照相比，均明显降低了土壤中DEHP含量，影响从大到小依次是DH+DW>DH>DW；菌株-黄豆联合种植土壤DEHP残留浓度更低，说明黄豆的种植对于DEHP的降解有一定的促進作用。
3 结论
（1）土壤-豆类-菌株系统中，土壤中DEHP含量随着时间增加而下降，在前15d内，DEHP的降解速率最慢，在15～40d的时间段内，DEHP的降解速率最快，40d之后，降解速率趋于缓慢。
（2）土壤中接种菌株后，DEHP降解能力增强，革登氏菌对DEHP降解能力大于芽孢杆菌，联合接种比单一接种降解能力更强。豆类植物在快速生长期（约50d内）对菌株降解DEHP有促进作用。
参考文献
[1]谢沁珊，王杉杉，蔡凤云等.塑料增塑剂DEHP环境污染水平、人体负荷及生物毒性的初步研究[J].公共卫生与预防医学，2010，5（21）：19-22.
[2]Svechnikova I， Svechnikov K， Soder O. The influence of di-（2-ethylhexyl） phthalate on steroidogenesis by the ovarian granulosa cells of immature femals rats[J].Journal of Endocrinology，2007，194（3）：603-609.
[3]陈强，孙红文，王兵等.邻苯二甲酸二异辛酯（DEHP）对土壤中微生物和动物的影响[J].农业环境科学学报，2004，23（6）：1156-1159.
[4]曾巧云，莫测辉，蔡全英.农业土壤中邻苯二甲酸酯的污染现状与危害[J].广东农业科学，2009，（7）：90-96.
收稿日期：2018-04-06
作者简介：何诗琳（1990-），女，现工作于北京建工环境修复股份有限公司，助理工程师，研究方向为污染场地修复。
