当代天然产物开发及进展

    石月

    摘 ? ? ?要：介绍了近几年来天然产物开发思路及相关进展。通过查阅文献，从化学、生物、代谢组学三个方面，进行分析、总结，并举例例证。天然产物作为前体药物分子的主要来源，其开发过程已从传统的提取分离筛选，向针对性强、以现代技术手段为支持方向发展，大大提高了发掘新型天然产物的效率，同时促进了现代药物开发。

    关 ?键 ?词：天然产物;新产物;药物开发

    中图分类号：TQ 041 ? ? ? 文献标识码： A ? ? ? 文章编号： 1671-0460（2020）02-0365-04

    Abstract： The development and related progress of natural products in recent years were viewed. Referring to the literatures of chemistry， biology， metabonomics， natural products were analyzed and summarized. Related development process of natural products as the main source of prodrugs， has been advanced from traditional way to high-level techniques， which greatly improves the efficiency of discovering new natural products as well as drug development.

    Key words： Natural products; New products; Drug development

    天然产物，是指自然界中天然存在的物质，包括动物、植物、微生物、矿物等。其广泛的化学和生物学多样性，使之成为新型分子结构骨架的宝贵源泉[1]，同时，也是各类临床用药的先导化合物，包含针对感染、衰老、癌症等疾病的药物[2-4]。调查表明，1981年至2014年期间，美国FDA超过59%新批准的药物，直接或间接来自于天然产物[5]。在研究天然产物过程中，发现了更为有效的药物，就如同抗生素的发展历史一样：20世纪20年代，Fleming偶然发现了青霉素的存在[6]，开启了治疗微生物感染疾病的新时代，自那之后，种类繁多的抗生素被先后发掘，为医疗和人类健康做出了巨大贡献;然而，随着抗生素的广泛应用，其带来的危害也日益突出，导致抗生素耐药菌的出现，不仅使得原抗生素效果大不如前，甚至令病原菌“进化”，更加难以控制，从此人类走上抵抗抗生素耐药性的道路，需要不断发现更加有效的天然药物分子。某种程度上正是自然界及天然产物的进化和反馈，推动了自然科学的进步。当然，直接对自然生物的探索，也是科学进步的一大助力，例如，通过研究细菌和古细菌体内适应性免疫作用及机制，发明了一项应用广、精度高的基因编辑技术CRISPR（Clustered regularly interspaced short palindromic repeats）[7]。

    至今为止，对庞大天然产物资源的挖掘，主要应用于药物及人类健康。然而，在此过程中，由于传统的天然产物研究方法费时费力，且较为盲目，已逐渐淡出多数天然产物研究者的视野;因此，相关前沿技术的兴起是大势所趋。同时，将天然产物研究与不同领域结合，已然“碰撞”出数不胜数有价值的科学成果。

    1 ?天然产物修饰

    将具备研究前景的新型天然产物化合物，作为先导化合物，并通过化学及计算机科学等手段进行结构改造或修饰，从而发现效果更好、更安全、生产成本更低的候选分子，然后经过各期临床试验，判断此分子是否适合作为新药上市，是当代国内外药物研发中高效途径之一。

    1.1 ?天然产物半合成

    由于大多天然产物结构复杂，其全合成研究工艺研究也相对困难。因此，基于天然产物为起始化合物，通过构效关系对其进行修饰，衍生出一系列新药的具体方法，通常以在天然产物基础上进行半合成来实现。例如在青霉素G基础上合成阿莫西林继续作为一线治疗药物;洛伐他烃上市后，很快，通过多引入一个甲基形成了更高效的药物—辛伐他汀 （Zocor）;类似的，在商业化微管蛋白抑制剂紫杉醇 （紫杉醇） 之后，基于10-脱乙酰巴卡亭III的半合成，研发出了多西紫杉醇 （Taxotere）[8]。这样的经典案例还有很多，近几年相关研究仍有新发现：Jia-Dai Zhai 等报道，从天然产物小白菊内酯，经过三步高度立体选择性的化学反应，半合成出应用于临床的一种抗癌药物arglabin，其化学半合成的成功，也为相关生物合成提供了思路[9];来自中国华南理工大学的研究团队，在天然产物α-mangostin基础上，设计并合成了一系列两亲阳离子氧杂蒽酮类分子，它们以新型作用方式，对抗真菌，且其中两个化合物，可以通过直接破坏真菌细胞膜，迅速杀死真菌，避免耐药性产生，是治疗耐药性真菌感染有价值的候选药物分子之一[10]。以上表明，天然产物半合成手段，是激发、加强或延伸天然产物活性的有效途径。

    1.2 ?天然產物与计算机辅助药物设计

    以活性天然产物为灵感，设计与其相仿的化合物为类药分子的药物开发过程中，通过计算机程序辅助，可以提高分子合理性设计的概率和时间。与高通量筛选对比，这种方法更为高效，有针对性。计算机软件的核心是将天然产物形象化，通过逐步简化产生与效果直接关联的骨架，从而得到直观的结构。通过计算机辅助，在天然产物基础上，Merk等科学家设计出了三种新型以类视黄醇X受体 （RXR，调节代谢动态平衡和炎症的关键部分） 为靶点的分子，其中发现缬草酸对RXR-β受体具有特异选择性，使之成为有效的药理工具[11]。另外，基于各向异性核磁共振数据的计算机辅助结构解析 （CASE-3D） 策略，则应用于解决复杂天然产物的构型或选择优选构象，该方法已为已知化合物如青蒿素的结构进行了校正，这项技术也将帮助手性药物分子相关设计[12]，类似的计算机辅助结构确定也应用于海洋天然产物[13]。同时，计算机辅助技术还可用于预测混合物天然产物中的有效成分，从而提高天然产物研究效率[14]。

    2 ?生物工程在新型天然产物开发中的应用

    2.1 ?天然产物生物合成研究

    生物合成，是生物体通过酶促反应生成天然产物。通常需要多种酶的连续反应，获得具备生物活性的化合物。在研究天然产物生物合成路径的同时，进行有关基因或酶的修饰，是当代天然产物开发中行之有效的方法之一。Shomar 等研究人员，通过基因工程修饰，增加碳青霉烯类抗生素前体代谢物的浓度，将抗生素产率提高了60倍，并建立了相关工程菌株，为碳青霉烯衍生物的生物合成提供了专属平台，且具备易处理、速度快的特点[15]。

    同时，为了获得新型天然产物，可在已知生物合成途径的基础上，通过将合成前体或中间体分子类似物加入生物活体必要生长因素中，被其利用，以代替原分子参与到生物合成中，产生相应天然产物。通过向海洋真菌Scedosporium apiospermum F41?1培养液中加入不同氨基酸，产生了14个新生物碱类化合物，其中5个具有吡嗪基喹唑啉二酮的稀有骨架，且根据此研究更完整的阐述了相关合成路线[16]; iturin A，作为抗生素类天然产物，其生物合成依赖于D-酪氨酸，因此Moran等在代谢iturin A的枯草芽孢杆菌培养液中加入氟代D-酪氨酸，结果生成氟代iturin类的新天然产物，并具备更有效的生物活性[17]。

    2.2 ?天然产物合成基因簇的激活

    通过现代基因组学技术，可将编码天然产物的基因序列进行测序，得到包括基因和产物功能的预测生物学信息，同时帮助代谢组内产物的鉴定和结构阐明。然而，通过基因组测序，我们发现在天然产物研究中，遗漏了大量产物多样性。也就是说，基因组学证明，与实际分离获得的天然产物相比，大多数天然产物仍处于未开发状态[18]。导致这一现状的主要原因在于，天然产物开发中，这些编码天然产物的基因没有真正表达或者表达率太低，处于“隐藏”状态。因此，通过各种手段，刺激其表达，是发掘天然产物潜力的一大助力。

    2.2.1 ?生物合成基因簇异源表达

    将天然产物合成基因簇与载体质粒结合，构建高质量基因表达重组黏粒，并将其转化入合适的宿主细胞，促进其表达，是激活未表达天然产物合成基因簇的有效方法之一，同时也对天然产物合成机理的研究提供参考。例如，有关研究中，首先通过对比各种链霉菌属细胞，选择出最佳异源基因表达宿主，并优化基因-载体重组体构建方法，获得更高转化效率;之后在此体系中，对150万宏基因组基因进行异源表达，最终发现新型三环多烯类天然产物metatricycloene[19];Alt 和Wilkinson 通过实验，对来源于海洋链霉菌属sp. T676中罕见的抗生素 （炭疽素，atc） 合成基因簇進行发掘，然后将包含反式酰基转移酶和聚酮合成酶的53 bps atc基因座，异源表达于天蓝色链霉菌中 （Streptomyces coelicolor），产生炭疽素，并以此为后续生物工程的基础，提供了新的、药理活性更优良的类似物[20]。同时，异源表达还可以优化生物体性状，产生新颖物种。如天津大学药物科学与技术学院张雁教授团队和中国科学院大学陈义华教授团队合作，将含有两个靛蓝合成的细菌基因及花瓣特异性的启动子/终止子的质粒转化入农杆菌，再将农杆菌注入玫瑰花瓣中，通过表达，使玫瑰细胞合成深蓝色的靛蓝的酶，从而获得了自然界中没有蓝玫瑰[21]。

    2.2.2 ?生物合成基因簇同源激发

    天然产物的表达，需要多种酶的共同作用。因此，异源表达方法虽然特异性强、效率高，但并非所有情况下都适用。对于表达过程复杂且表达率低的天然产物，在原宿主细胞内激活是更好的选择。据报道，以来自真菌的两种氧杂蒽酮类化合物和来自植物的厚朴酚为底物，可以刺激含有葡糖基转移酶突UGT73B6FS的大肠杆菌产生新型芳香醇类天然产物[22];由于真菌Botrytis cinerea的基因组测序显示其丰富的新型生物合成基因簇，Pinedo等通过系统地改变菌种培养条件，用硫酸铜作为化学诱导，激发合成基因簇的表达，发现了一个倍半萜类新颖化合物[23];研究人员通过对同源细胞的蛋白修饰，使33种放线菌中磷酸腺苷基转移酶过表达，发现其中70%的菌种有新产物产生，并成功地从两株菌株中鉴定出5种类卵磷脂和杀虫霉素的新化合物[24];CRISPR-Cas 9作为基因编辑技术新星，也应用于天然产物发掘领域，来自UIUC的科研团队，通过CRISPR-Cas 9技术将较强的 kasO*启动子代替原启动子，插入五种链霉菌的编码基因中，同源启动了低表达代谢产物的表达，并鉴别出其中一个五环Ⅱ型聚酮类新化合物[25]。

    2.3 ?共培养

    微生物作为天然产物的一大分支，在其研究过程中，由于微生物在实验室条件下无法生长，或产生与自然条件下一样的代谢物，导致相应天然产物无法发掘。因此，研究人员开始在实验室下模拟其对应的自然环境，以促进这些微生物的生长、代谢。这个过程中，除了培养基成分、pH、温度等因素外，由于自然界中微生物是以群体方式存在的，说明微生物共同培养也是模拟条件之一。通过不同菌种在同一培养液中共同培养，一定程度上可以刺激不同于单体培养的产物产生，提高天然产物多样性以及新型天然产物分离概率，同时能更系统、完整的理解天然产物形成过程与自然规律。通过天麻植物内生真菌Phoma sp. YUD17001和共生真菌蜜环菌共培养，产生5个新的次级代谢产物，包括两种酚类化合物和三种脂族酯衍生物[26];来自同一环境中的九种放线菌，共培养状态下具备各个单体没有的抗菌活性，因此，通过对菌种随机配对共培养，将群体简化成两个菌种，其中一个为诱导菌，刺激另一个菌种产生了含有环氧异腈基的高度改性脂肪酸新分子，并可有效抑制耐药菌-金黄色葡萄球菌[27]。

    3 ?次级代谢组学和天然产物开发

    代謝组学同基因组学、蛋白质组学同作为系统生物学的重要组成部分，虽发展较晚，但趋势迅猛。其中，初级代谢组学通常用于人类或细胞系中的疾病研究。近年来，研究人员开始将统计学方法与次级代谢组学分析结合，并将这种方法用于对植物、微生物、海洋生物体样品的分类，以及帮助鉴定活性化合物[28-30]。此技术与数据时代相对接，通过数据统计更系统完善的研究未开发的天然产物，并揭示了其潜力。一些多变量统计技术，例如主成分分析、层序聚类分析、主最小二乘分析和分子网络策略，也已应用于以上领域[31，32]。同时，用于分析和处理代谢组学数据的软件平台，也逐渐开发完善[33，34]。当然，由于统计和代谢组学研究的整合仍处于初期阶段，对当前技术的优化，仍有巨大空间。

    4 结束语

    天然产物作为药物前体分子的来源，其开发过程的优化，可促进药物研发，利于人类健康。以上主要基于化学、生物、代谢组学三个方面，介绍了当代天然产物开发的思路及各项技术。当然，除此之外，发掘极地环境中天然新物种以及各项技术联合应用等，也是当代天然产物开发的有效途径。通过概括现代以不同技术，发掘天然产物的相关进展，旨在为天然产物开发理清思路，从而为今后研发更先进的方法与技术奠定良基。

    参考文献：

    [1]Koehn FE， Carter GT. The evolving role of natural products in drug discovery[J]. Nature Reviews Drug Discovery， 2005， 4： 206-220.

    [2]Newman DJ， Cragg GM. Natural products as sources of new drugs over the 30 years from 1981 to 2010[J]. Journal of Natural Products， 2012， 75（3）： 311-335.

    [3]Takanori I， Chikako Y， Kaori H. Influence of lactic acid bacteria on longevity of Caenorhabditis elegans and host defense against Salmonella entetica serovar enteritidis[J]. Applied and Environmental Microbiology， 2007， 73（20）： 6404-6409.

    [4]Fialho AM， Bernardes N， Chakrabarty AM. Recent patents on live bacteria and their products as potential anticancer agents[J]. Recent Patents on Anti-Cancer Drug Discovery， 2012， 7（1）： 31-35.

    [5]Newman DJ， Cragg GM. Natural products as sources of new drugs from 1981 to 2014[J]. Journal of Natural Products， 2016， 79（3）： 629-661.

    [6]Fleming A. On the antibacterial action of cultures of a penicillium， with special reference to their use in the isolation of B. influenzae. 1929[J]. Bulletin of the World Health Organization， 2001， 79（8）： 780-790.

    [7]Jansen R，Embden JD， Gaastra W， Schouls LM. Identification of genes that are associated with DNA repeats in prokaryotes[J]. Molecular Microbiology， 2002， 43（6）： 1565-1575.

    [8]DeCorte BL. Underexplored Opportunities for Natural Products in Drug Discovery[J]. Journal of Medicinal Chemistry， 2016， 59（20）： 9295-9304

    [9]Zhai JD， Li D， Long J， Zhang HL， Lin JP， Qiu CJ， Zhang Q， Chen Y. Biomimetic Semisynthesis of Arglabin from Parthenolide[J]. The Journal of Organic Chemistry， 2012， 77（16）： 7103-7107.

    [10]Lin S， Sin WLW， Koh JJ， Lim F， Wang L， Cao D， Beuerman RW， Ren L， Liu S. Semisynthesis and Biological Evaluation of Xanthone Amphiphilics as Selective， Highly Potent Antifungal Agents to Combat Fungal Resistance[J]. Journal of Medicinal Chemistry， 2017， 60（24）： 10135-10150.

    [11]Merk D， Grisoni F， FriedrichL， Gelzinyte E， Schneider G. Computer-Assisted Discovery of Retinoid X Receptor Modulating Natural Products and Isofunctional Mimetics[J]. Journal of Medicinal Chemistry， 2018， 61（12）： 5442-5447.

    [12]Navarro-Vazquez A， Gil RR， Blinov K. Computer-Assisted 3D Structure Elucidation （CASE-3D） of Natural Products Combining Isotropic and Anisotropic NMR Parameters[J]. Journal of Natural Products， 2018， 81（1）： 203-210.

    [13]梁小蕊，孫晓伟，刘存海，郭云超，李萌. 一种海洋天然产物分子的红外光谱及核磁共振碳谱的理论研究[J].当代化工，2018，48（12）：2542-2544.

    [14]HarnYC， Su BH， Ku YL， Lin OA， Chou CF， Tseng YJ. NP - StructurePredictor： Prediction of Unknown Natural Products in Plant Mixtures[J]. Journal of Chemical Information and Modeling， 2017， 57（12）： 3138-3148.

    [15]Shomar H， Gontier S， van den Broek NJF， Mora HT， Noga1 MJ， Hagedoorn PL， Bokinsky G. Metabolic engineering of a carbapenem antibiotic synthesis pathway in Escherichia coli[J]. Nature Chemical Biology， 2018， 14： 794-800.

    [16]Huang LH， Xu MY， Li HJ， Li JQ， Chen YX， Ma WZ， Li YP， Xu J， Yang DP， Lan WJ. Amino Acid-Directed Strategy for Inducing the Marine-Derived Fungus Scedosporium apiospermum F4-1 to Maximize Alkaloid Diversity[J]. Organic Letters， 2017， 19（18）： 4888-4891.

    [17]Moran S， Rai DK， Clarka BR， Murphy CD. Precursor-directed biosynthesis of fluorinated iturin A in Bacillus spp[J]. Organic & Biomolecular Chemistry， 2009， 7（4）： 644-646.

    [18]BrianOB， StevenGV， RichardHB. Microbial genome mining for accelerated natural products discovery： is a renaissance in the making[J]. Journal of Industrial Microbiology & Biotechnology， 2014， 41（2）： 175-184.

    [19]Iqbal HA， Low-Beinart L， Obiajulu JU， Brady SF. Natural Product Discovery through Improved Functional Metagenomics in Streptomyces[J]. Journal of the American Chemical Society， 2016， 138（30）： 9341-9344.

    [20]Alt S， Wilkinson B. Biosynthesis of the Novel Macrolide Antibiotic Anthracimycin[J]. ACS Chemical Biology， 2015， 10 （11）： 2468-2479.

    [21]UrsANN，HuYL，LiPW，YuchiZG，Chen YH， Zhang Y. Cloning and Expression of a Nonribosomal Peptide Synthetase to Generate Blue Rose[J]. ACS Synthetic Biology， 2018，96 （40）：9-9.

    [22]He Q， Yin H， Jiang J， Bai Y， Chen N， Liu S， Zhuang Y， Liu T. Fermentative Production of Phenolic Glucosides by Escherichia coli with an Engineered Glucosyltransferase from Rhodiola sachalinensis[J]. Journal of Agricultural andFood Chemistry， 2017， 65（23）： 4691-4697.

    [23]Pinedo C， Moraga J， Barua J， Gonzalez-Rodríguez VE， Aleu J， Duran-Patron R， ? Macías-Sanchez AJ， Hanson JR， Viaud M， Hernandez-Galan R， Garrido C， Collado IG. Chemically Induced Cryptic Sesquiterpenoids and Expression of Sesquiterpene Cyclases in Botrytis cinerea Revealed New Sporogenic （+）-4-Epieremophil- 9-en-11-ols[J]. ACS Chemical Biology， 2016， 11（5）： 1391-1400.

    [24]Zhang B， Tian W， Wang S， Yan X， Jia X， Pierens JK， Chen W， Ma H， Deng Z， Qu X. Activation of Natural Products Biosynthetic Pathways via a Protein Modification Level Regulation[J]. ACS Chemical Biology， 2017， 12 （7）： 1732-1736.

    [25]Zhang MM， Wong FT， Wang Y， Luo S， Lim YH， Heng E， Yeo1 WY， Cobb RE， Enghiad B， Ang1 EL， Zhao H. CRISPR–Cas9 strategy for activation of silent Streptomyces biosynthetic gene clusters[J]. Nature Chemical Biology， 2017， 10： 607-609.

    [26]Li HT， Zhou H， Duan RT， Li HY， Tang LH， Yang XQ， Yang YB， Ding ZT. Inducing Secondary Metabolite Production by Co-culture of the Endophytic Fungus Phoma sp. and the Symbiotic Fungus Armillaria sp[J]. Journal of Natural Products， ASAP， 2019.

    [27]Pishchany G， Mevers E， Ndousse-Fetter S， Horvath DJ， Paludo CR， Silva-Junior EA， Koren S， Skaar EP， Clardy J， Kolter R. Amycomicin is a potent and specific antibiotic discovered with a targeted interaction screen[J]. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America， 2018， 115（40）： 10124-10129.

    [28]Qiu F， Fine DD， Wherritt DJ， Lei Z， Sumner LW. Plant MAT： A Metabolomics Tool for Predicting the Specialized Metabolic Potential of a System and for Large-Scale Metabolite Identifications[J]. Analytical Chemistry， 2016， 88 （23）： 11373-11383.

    [29]Goulitquer S， Potin P， Tonon T. Mass Spectrometry-Based Metabolomics to Elucidate Functions in Marine Organisms and Ecosystems[J]. Marine Drugs， 2012， 10 （4）： 849-880.

    [30]Clark BR， Bliss BJ， Suzuki JY， Borris RP. Chemotaxonomy of Hawaiian Anthurium Cultivars Based on Multivariate Analysis of Phenolic Metabolites[J]. Journal of Agricultural and Food Chemistry， 2014， 62 （46）： 11323-11334.

    [31]Worley B， Powers R. Multivariate Analysis in Metabolomics[J]. Current Metabolomics， 2013， 1 （1）： 92-107.

    [32]Moss NA， Bertin MJ， Kleigrewe K， Leao TF， Gerwick，L， Gerwick WH. Integrating mass spectrometry and genomics for cyanobacterial metabolite discovery[J]. Journal of Industrial Microbiology & Biotechnology， 2016， 43 （2）： 313-324.

    [33]Xia J， Sinelnikov IV， Han B， Wishart DS. MetaboAnalyst 3.0-making metabolomics more meaningful[J]. Nucleic Acids Research， 2015， 43 （1）： 251-257.

    [34]Mahieu NG， Genenbacher JL， Patti GJ. A roadmap for the XCMS family of software solutions in metabolomics[J]. Current Opinion in Chemical Biology， 2016， 30： 87-93.