基于网络药理学探讨大复方祛邪胶囊治疗结直肠癌的作用机制

    宋卓 陈悦 翟嘉威 谷珊珊 唐末 龚璐天 杨宇飞 许云

    摘要 目的：大復方祛邪胶囊是基于明代医家李中梓治疗积聚的名方——阴阳攻积丸研制而成，文章通过网络药理学方法挖掘其对结直肠癌的作用机制，为揭示经典名方阴阳攻积丸的临床价值和现代机制提供借鉴。方法：通过中药系统药理学数据库与分析平台（TCMSP）、中医药百科全书（ETCM）等数据库筛选祛邪胶囊的活性成分及靶点，通过Swiss Target Prediction靶标垂钓，取药物靶点的并集。通过TTD、OMIM、Drugbank和GeneCards数据库筛选结直肠癌的靶点，取并集。取药物靶点与疾病靶点的交集，并依据化合物的Degree值筛选，建立“中药-成分-靶点”数据库，依据核心靶点构建蛋白质-蛋白质相互作用（PPI）网络，进行基因本体（GO）功能和京都基因和基因组百科全书（KEGG）富集分析，与前期研究结果进行对比。结果：构建祛邪胶囊治疗结直肠癌的活性成分127个，靶向254个核心基因，核心基因的PPI网络包含248个节点，共有5个核心网络。富集分析显示祛邪胶囊可能主要通过调控RNA聚合酶的启动、DNA转录、翻译、蛋白的激活和增殖、凋亡、耐药、炎症反应等过程介导HIF-1α、PI3K/Akt、TNF、FoxO、Toll样受体等多个信号通路，其中凋亡、免疫方面的调节及FoxO信号通路得到本团队前期研究的验证。结论：祛邪胶囊治疗结直肠癌的作用机制与介导凋亡、免疫及FoxO信号通路方面有关，此外还可能调控HIF-1α、PI3K/Akt、TNF、Toll样受体等多个信号通路，体现了祛邪胶囊治疗结直肠癌成分多、调控通路和靶点复杂的特点，同时展现了古人“反激逆从”和“温阳通下”论治肿瘤的理论魅力和临床价值，为后续的深入研究提供指导。

    关键词 结直肠癌;网络药理学;大复方;祛邪胶囊;阴阳攻积丸;经典名方;分子机制;中草药

    Abstract Objective：Dafufang Quxie Capsules are developed based on the famous prescription Yinyang Gongji Pills used by the physician LI Zhongzi in the Ming Dynasty to treat accumulation. The uses network pharmacology to explore its mechanism of action on colorectal cancer， in order to reveal the classic prescription Yin Yang Gongji Pills Provide reference for clinical value and modern mechanism. Methods：TCMSP， ETCM and other databases were searched to establish the database of active ingredients and targets of Quxie Capsules. Fishing through the Swiss Target Prediction target， we took the union of the drug targets. Through TTD， OMIM， Drugbank and GeneCards databases， we screened the targets of colorectal cancer and took the union. We took the intersection of drug target and disease target， and screened according to the degree value of the compound， established a “Chinese medicine-component-target” database， constructed a PPI network based on the core target， performed GO function and KEGG enrichment analysis， and compared the results with preliminary research. Results：The final data about Quxie Capsule for the treatment of colorectal cancer had 127 active ingredients targeting 254 core genes. The PPI network contains 248 core genes， and there were 5 subnet networks in total. Enrichment analysis results showed that Quxie Capsules may mediate HIF1α， PI3K/AKT， TNF， FoxO， Toll-like receptors through processes such as the initiation of RNA polymerase， DNA transcription， translation， protein activation and proliferation， apoptosis， drug resistance， and inflammation. And many other signaling pathways， among which the regulation of apoptosis， immunity and FoxO signaling pathway have been verified by our team′s previous research. Conclusion：Mechanism of Quxie Capsules on the treatment of colorectal cancer is related to mediating apoptosis， immunity and FoxO signaling pathway. In addition， it may also regulate multiple signaling pathways such as HIF1α， PI3K/AKT， TNF， and Toll-like receptors. This revealed that Quxie Capsules have many components in the treatment of colorectal cancer， and its regulatory pathways and targets are complex. At the same time， it demonstrates the theoretical charm and clinical value of the ancients′ “anti-excitement and rebellion” and “warming yang and ventilating the lower part” theory of treating tumors， providing guidance for follow-up in-depth research.

    Keywords Colorectal cancer; Network pharmacology; Great prescription; Quxie Capsules; Yinyang Gongji Pills; Classic prescription; Molecular mechanism; Chinese medicinal

    中圖分类号：R285;R273;R242文献标识码：Adoi：10.3969/j.issn.1673-7202.2021.09.002

    结直肠癌（Colorectal Cancer，CRC）是常见的胃肠道恶性肿瘤，占全球所有癌症病例的10%以上，对社会经济造成沉重负担[1]。近20年来，我国结直肠癌的发病率显著增长，预计2020年患病人数将达到30万[2]。中医药作为独具我国特色的传统医学方法，在多种辨治思想的指导下成为结直肠癌综合治疗体系中必不可少的组成部分[3]。

    中国中医科学院西苑医院杨宇飞教授团队20余年来致力于结直肠癌的中西医结合研究，在“阴瘤理论”指导下，挖掘古代经典名方“阴阳攻积丸”研制出院内制剂祛邪胶囊。祛邪胶囊主要由巴豆、吴茱萸、猪牙皂、鸡内金、生麦芽等21味中药组成，融温散、理气、化痰、散结、通下为一炉，扶阳散阴或遏阳消阴，祛除体内的致癌因素如痰毒、瘀毒、湿毒等病理产物，从中医的病根上治疗结直肠癌[4]。我们团队既往的队列研究和随机对照研究表明祛邪胶囊在减少Ⅱ/Ⅲ期结直肠癌术后复发，延长晚期肠癌生存期，提高肠癌患者生命质量上均有较好的疗效[5-7]。基础研究方面，祛邪胶囊在调节小鼠免疫和肠道微生态平衡方面也都有一定的效果[8-9]。然而，鉴于中医理论的特殊性，祛邪胶囊配伍复杂、药味多、活性成分杂而不明，作用靶点网络化，且部分药物有一定的毒性，使得其组方配伍的筛选、优化和药效机制研究均面临较大的困难。

    中药网络药理学（Network Pharmacology）基于“药物-靶点-基因-疾病”之间的复杂关系，从分子水平上阐明药物与疾病网络之间的协同效应和潜在机制[10]。其系统性、整体性的特点与复方的整体观不谋而合，为大复方的深入研究提供了一个新的思路[11]。本研究采用网络药理学方法，探索祛邪胶囊治疗结直肠癌的分子机制，并结合前期研究结果进行佐证，从分子水平探索大复方祛邪胶囊的体内生物学特征，为后续的组方优化和机制研究奠定基础。

    1 资料与方法

    1.1 祛邪胶囊治疗结直肠癌网络药理学分析的流程图。见图1。

    1.2 祛邪胶囊活性成分及对应靶点的收集

    借助中药系统药理学数据库与分析平台（Traditional Chinese Medicine Systems Pharmacology Database and Analysis Platform，TCMSP）[12]和中医药百科全书（The Encyclopedia of Traditional Chinese Medicine，ETCM）[13]分别检索祛邪胶囊巴豆霜、猪牙皂、吴茱萸、干姜、肉桂、川乌、黄连、半夏、橘红、茯苓、槟榔等19味组方中药的活性成分。TCMSP数据库依据药物吸收、分布、代谢、排泄（Absorption，Distribution，Metabolism，Excretion，ADME）特性的口服生物利用度（Oral Bioavailability，OB）和类药性（Drug Likeness，DL）作为筛选指标，筛选阈值为OB≥30%，DL≥0.18，筛选出符合条件的活性成分及对应靶点;对于不符合筛选条件但既往被验证靶向结直肠癌的化合物及其靶点也纳入本研究。ETCM筛选可靠性分值大于0.8的化合物及对应靶点。由于鸡内金的活性成分在TCMSP、ETCM均未纳入，因而通过BATMAN-TCM数据库[14]和化学专业数据库[15]进行筛选;而琥珀在上述4种数据库均无靶点的记录。同时，通过文献搜索21味中药中已被验证治疗结直肠癌的活性成分及靶点完善数据。应用Uniprot数据库[16]中的蛋白转化功能，将TCMSP获得的蛋白靶点依据物质为“Human”、证据来源为“Reviewed”转化为对应的基因名称。利用PubChem数据库[17]，将所有活性化合物转化为标准的Canonical SMILES格式，统一化合物的CAS号，应用Swiss Target Prediction在线数据库[18]预测筛选的所有活性化合物的可能靶点，扩充其靶点信息。

    1.3 结直肠癌疾病靶点收集

    以“colorectal cancer”作为检索词检索GeneCards[19]、OMIM数据库[20]、TTD数据库[21]和Drugbank[22]4大数据库，筛选CRC的靶点基因。其中，GeneCards查询到与CRC相关的靶点基因较多，依据Relevance筛选出与CRC相关性较大的靶点基因，并将4大数据库筛选的结果合并得到CRC疾病的靶点基因。

    1.4 “中药-成分-靶点”网络图的构建

    本研究采用Cytoscape 3.7.1[23]构建祛邪胶囊治疗CRC的“中药-成分-靶点”的网络图展现其药理关系。由于祛邪胶囊的组方大、成分多，直接构建的网络药理图会极其复杂，本研究分别依据其靶点和活性成分缩选，构建准确率更高的数据网络。首先，本研究将祛邪胶囊活性成分的靶点与CRC疾病的靶点取交集，通过交集靶点筛选其对应的活性成分和中药。其次，本研究将缩窄后得到的数据通过Cytoscape 3.7.1分析，依据Degree≥10筛选活性成分，并以此构建“中药-成分-靶点”数据库，利用Cytoscape 3.7.1可视化处理。

    1.5 靶点蛋白质-蛋白质相互作用（PPI）网络图的构建

    将筛选得到的核心靶点利用String数据库[24]，依据Homo sapiens，minimum required interaction score>0.7筛选，删除单一的靶点以保证网络的可读性，构建蛋白质-蛋白质相互作用（Protein Protein Interaction，PPI）网络图，并导入Cytoscape 3.7.1可视化处理。使用Cytoscape的MCODE功能对PPI网络进行模块分析，设置K-core值>4。

    1.6 祛邪胶囊治疗CRC预测靶点的富集分析

    利用DAVID数据库[25]对核心靶点进行基因本体（Gene Ontology，GO）和京都基因和基因组百科全书KEGG（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG）富集分析，并限制物种为人，得到的分析结果以P<0.01进行筛选，将所得结果与前期研究对比分析，最后通过在线网络作图工具进行可视化处理。统计上述祛邪胶囊治疗CRC的核心通路和相关靶点的信息，构建祛邪胶囊的核心通路-靶点关联网络并可视化处理。

    2 结果

    2.1 祛邪胶囊治疗CRC活性成分、靶点的筛选

    TCMSP和ETCM数据库检索到祛邪胶囊19味中药共有活性化合物831个，靶点1 318个，“中药-化合物-靶点”19 077组;其中BATMAN-TCM数据库和化学专业数据库检索到鸡内金含有的活性化合物3個，对应靶点19个，“中药-化合物-靶点”19组;祛邪胶囊的干预靶点汇总后共有1 329个。

    GeneCards数据库获得CRC的靶点8 933个，依据Relevance的中位数筛选3次得到靶点基因1 121个，TTD数据库靶点基因85个，OMIM数据库靶点基因496个，Drugbank数据库靶点基因24个，综合4大数据库共获得CRC疾病的靶点基因1 561个。

    将祛邪胶囊活性成分的靶点与CRC疾病的靶点取交集，得到的交集靶点基因共282个，这些靶基因来源于祛邪胶囊中的20味中药的642个活性化合物，得到“中药-化合物-靶点”5 385组。考虑祛邪胶囊的组方较大，部分化合物仅靶向少数的靶点，本研究将缩窄得到的数据导入Cytoscape 3.7.1分析，并依据活性成分的Degree≥10，筛选出祛邪胶囊治疗CRC可能性较大的活性成分127个。见表1，靶向254个基因，“中药-化合物-靶点”3 418组，来源于19味中药。鸡内金因其所含活性成分及靶点基因与结直肠癌的相关性不高而被上述过程筛掉。

    2.2 祛邪胶囊治疗CRC“中药-成分-靶点”的网络分析

    将2.1筛选得到的数据导入Cytoscape 3.7.1构建祛邪胶囊治疗结直肠癌的靶点网络，网络模型中共有399个节点，3 699条连接。见图2。该网络模型拓扑结构分析的Degree平均值约18.54，中位数12。网络模型中的靶点均有较高的Degree值，提示这些靶点受祛邪胶囊多味药的多种成分的综合调控。本研究进一步对各靶点受祛邪胶囊调控的重要程度进行分析，靶点的Degree值越高表示其越可能是祛邪胶囊作用的主要靶点。靶点网络的254个靶点有57个的Degree值≥20，有19个靶点的值≥36（PTGS2，PTGS1，AR，ESR1，ADH1C，ESR2，PPARG，PGR，PIK3CG，NOS3，PRSS1，AHR，TNF，RHO，PPARD，BCL2，INS，CYP1B1和PRKACA）。

    2.3 祛邪胶囊治疗CRC靶点的PPI网络分析

    将筛选得到的254个核心靶点基因采用String数据库构建蛋白靶点PPI网络，并经Cytoscape可视化处理。该PPI网络包含248个节点，2 853条边，平均Degree为23。进一步对靶点网络开展MCODE子簇分析，得到5个子网络。见图3。图中圆形表示靶点，靶点越大代表的Degree值越大，在PPI中越关键，线条表示靶点间的相互作用，作用越强，线条越粗。采用DAVID数据库对子簇进一步富集分析，发现这些子簇聚集的与CRC密切相关的前10条信号通路为病毒致癌作用、蛋白聚糖、细胞周期、p53信号通路、T细胞受体信号通路、HIF-1α信号通路、PI3K/Akt信号通路、TNF信号通路、FoxO信号通路、Toll样受体信号通路。

    2.4 祛邪胶囊治疗CRC关键靶点的生物功能富集分析

    利用DAVID数据库对祛邪胶囊治疗CRC的254个核心靶点进行GO和KEGG富集分析，以P<0.01为界定值筛选。根据GO注释结果筛选分别在分子功能（Molecular Function，MF）、细胞组成（Cell Composition，CC）和生物过程（Biological Process，BP）富集中前10的条目。见图4A。这些基因的生物过程主要涉及调控RNA聚合酶的启动、DNA转录、翻译、蛋白的激活和增殖、凋亡、耐药、炎症反应等方面。KEGG富集分析得到78个条目，前50个条目中与肿瘤相关的富集通路有29条，排除一些与特定肿瘤类型相关而非具体信号通路的条目，最终得到预测通路19条，并以此绘制富集通路的气泡图。见图4B。富集结果显示祛邪胶囊治疗CRC核心基因主要富集的通路为HIF-1信号通路、蛋白聚糖、TNF信号通路、PI3K-Akt信号通路、凋亡、p53信号通路、T细胞受体信号通路、FoxO信号通路、VEGF信号通路、核因子κB、MAPK、Toll样受体信号通路等。

    本团队既往的基础研究表明，祛邪胶囊能明显抑制荷瘤小鼠结肠肿瘤细胞的生长（P<0.05），其机制与增加Bim、FasL和cleaved caspase-3蛋白的表达介导肿瘤细胞的凋亡有关;此外，祛邪胶囊能通过降低FoxO家族蛋白的表达来增加Th1细胞的数量和减少Treg细胞重塑肿瘤免疫抑制的微环境，这些结果对本研究进行了一定程度的验证[8]。

    进一步将上述祛邪胶囊治疗CRC的核心通路和相关靶点整理，构建了祛邪胶囊的核心通路-靶点关联网络，图中信号通路节点的大小和颜色深浅与相关的靶点数量成比例，颜色越深表明参与此通路调控的靶点越多。分析结果显示祛邪胶囊治疗CRC相关靶点参与的核心通路为PI3K-Akt信号通路、肿瘤相关的蛋白聚糖、microRNAs、Ras信号通路、HIF-1信号通路、MAPK信号通路、TNF信号通路、FoxO信号通路、Rap1信号通路等，调控的核心靶点基因为NFKB1、AKT1、PIK3CA、PIK3CG、MAPK1、MAPK3、RELA、HRAS、IKBKB、TP53、RAF1。见图5。

    3 讨论

    大复方祛邪胶囊由古人治疗积聚的经典名方阴阳攻积丸研制而成，在温通、泻下、行气、化痰、逐瘀的基础上加了少量扶正和胃消食的中药，共21味。阴阳攻积丸体现了古人针对复杂病证采用药性相反、升降相逆中药相激搭配的治疗艺术，也体现了古人从“阳不化气、阴成型”对肿瘤病机的认识[26-27]。增加扶正和胃消食中药后的大复方祛邪胶囊，尤为符合结直肠癌虚、痰、瘀、寒的病机特点，集多种治法于一炉，体现了配伍严谨有序、精当贴切、机制明晰周全的中医药学魅力。这种大复方符合今人对肿瘤中医病机认识复杂性的特点，遵循古人“大病需用大药”的学术思想，在恶性肿瘤防治的临床实践中体现出较好的实际意义[28]。然而这种大复方组方复杂、成分众多，应用现代科学技术对其药效物质基础和作用机制的研究面临一定的困难。亦有专家指出，多成分多靶点是对中药作用机制的表面认识，中药作用机制实际上是药物有效成分组成复杂物质体系与病理条件下作用靶點组成复杂生物体系的相互作用，这意味着从单成分、单靶点或单信号通路去揭示大复方作用机制存在一定的问题[29]。网络药理学基于生物数据库及基础和临床实验研究结果，借助数学模型和复杂网络研究方法，将药物的作用靶点与疾病相关的靶点对接，从而建立“药物-靶点-基因-疾病”相互作用的网络[30]。网络药理学反映了大数据时代复方中药系统性研究的新趋势，为大复方的深入研究带来了新的思路和方法。

    本研究利用网络药理学的方法初步探讨了大复方祛邪胶囊治疗结直肠癌的分子机制。通过活性化合物和靶点缩选后仍获得祛邪胶囊治疗CRC的活性成分127个，靶向254个基因，来源于19味中药，表明祛邪胶囊作用于结直肠癌的机制极其复杂。富集分析显示祛邪胶囊治疗结直肠癌的机制除了与本团队已经验证的免疫、凋亡生物过程和FoxO信号通路相关外，还可能与调控HIF-1、PI3K/Akt、TNF、p53、VEGF、NF-κB、MAPK、Ras、Rap1、microRNA等信号通路相关。T细胞受体、FoxO、Toll样受体和TNF信号通路均通过调控机体的免疫炎症信号通路介导结直肠癌的发生和发展[31-34]，部分通路介导的免疫炎症反应已得到我们前期基础研究的验证。p53是重要的抑癌基因，参与肿瘤的分化和转移[35];Ras、Rap1是小G蛋白类的超家族成员，与MAPK在肿瘤细胞的增殖、分化等多种生物过程中都发挥重要的调控作用[36-38]，我们前期的研究也证实祛邪胶囊对结直肠癌细胞增殖、自噬、凋亡均有一定调控作用，其机制是否与这些分子通路相关尚需进一步验证。HIF-1是哺乳动物体内普遍存在的缺氧应答调控因子，参与肿瘤细胞耐受微环境和血管生成等多个生物过程的调控[39];VEGF直接参与促进结直肠癌的血管新生过程[40];PI3K-Akt作为其下游的信号通路，参与肿瘤细胞包括增殖、分化、凋亡、侵袭转移、新生血管生成在内的多个恶性生物行为[41-42]。microRNA[43]是一类进化高度保守的内源性非编码RNA，可通过诱导抑癌基因失活、调控DNA甲基化、介导核酸多态性的遗传修饰、调控传统信号通路等机制影响CRC的发生发展，这些机制为本团队后续的机制研究提供了新的思路。本研究预测的祛邪胶囊治疗CRC的分子机制得到了我们前期研究的部分验证，二者具有较好的一致性，同时体现其受众多通路的综合调控，作用机制极其复杂。

    本研究的目的是借助网络药理学预测大复方祛邪胶囊治疗CRC的分子机制，结合前期研究结果为后续研究提供指导，这就要求本研究纳入更全面的数据。为此，本研究筛选了比较常用的2个中药数据库TCMSP和ETCM的活性化合物和靶点，依据化合物的ADME进行筛选，对不符条件但有被证实与结直肠癌相关的化合物也纳入研究。同时采用文献查找的方法进行补充，最终所有数据取并集。由于数据量较大，我们从化合物和靶点2个角度筛选最可能的化合物和靶点进行研究和展示。由于本研究无法考量组方剂量的配比，且忽略了化合物作用强弱的不同，存在无法按实际效用校正的不足，这些都是网络药理学研究无法回避的问题。此外，由于中药数据库积累的不足，准确性、不可控性以及研究方向的偏向性可能会使研究漏掉有用的活性化合物或靶点，制约了研究结果的可靠性，是本研究的不足。

    4 结论

    综上所述，通过网络药理学技术预测祛邪胶囊通过众多的活性化合物和复杂的信号通路调控CRC的增殖、凋亡及肿瘤微环境乏氧、血管生成、免疫炎症机制的调控等多个生物学过程，部分通路和生物过程得到我们前期研究的验证，为更深入探索祛邪胶囊治疗CRC的分子机制奠定了基础，展现了古人“反激逆从”和“温阳通下”论治肿瘤的理论魅力和临床价值，也为从系统生物学的角度研究大复方提供了借鉴。

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    （2021-03-10收稿 责任编辑：徐颖）