基于网络药理学探讨血府逐瘀汤治疗冠心病的作用机制
叶嘉豪 胡志希 钟森杰 杨梦 姚涛 邱宏 熊霞军
摘要 目的：分析血府逐瘀湯治疗冠心病的作用机制。方法：借助中药系统药理学数据库与分析平台（TCMSP）检索血府逐瘀汤的化学成分和靶基因，利用GeneCards获得与冠心病相关的靶基因，采用Cytoscape 3.7.2绘制“中药成分-疾病靶基因”网络图，采用String数据库构建蛋白质-蛋白质相互作用（PPI）网络图，将PPI网络图导入Cytoscape 3.7.2，借助CytoNCA插件进行网络拓扑分析，采用R64 3.6.1软件对靶基因进行GO功能和KEGG通路富集分析。结果：筛选出血府逐瘀汤相关化合物224个，作用于冠心病的相关靶点3 564个，PPI网络显示Degree值排名前10位的靶基因依次为IL6、AKT1、ALB、VEGFA、CCL2、EGF、IL1B、MMP-9、CASP3、MAPK1，拓扑分析结果显示Degree值排名前10位的靶基因依次为PTGS2、MMP2、VEGFA、AKT1、ALB、CASP3、STAT3、IL6、MMP9、SERPINE1。GO富集分析预测出此方对冠心病的治疗机制可能与调控营养水平反应、对氧含量的反应、膜筏、膜微域、磷酸酶结合等通路相关。KEGG富集分析预测出此方治疗冠心病可能是通过糖尿病并发症AGE-RAGE信号通路、流体剪切应力和动脉粥样硬化、HIF-1信号通路、TNF信号通路等几个关键的通路达到治疗效果。结论：本研究探讨了血府逐瘀汤治疗冠心病的活性成分及其作用机制，血府逐瘀汤可通过多靶点、多通路治疗冠心病，为进一步研究该方作用机制提供了理论依据。
关键词 冠心病;血府逐瘀汤;网络药理学;靶基因;通路;作用机制
Abstract Objective：To analyze the mechanism of Xuefu Zhuyu Decoction in the treatment of coronary heart disease.Methods：GeneCards was used to obtain target genes related to coronary heart disease，Cytoscape 3.7.2 was used to draw a network diagram of “Chinese medicine components-disease target genes”，String database was used to construct a PPI network diagram，the PPI network diagram was imported into Cytoscape 3.7.2，and CytoNCA plug-in was used for network topology analysis.R64 3.6.1 was used software for GO function and KEGG pathway enrichment analysis of target genes.Results：A total of 224 related compounds of Xuefu Zhuyu Decoction were screened，and 3 564 related targets for coronary heart disease were screened.The PPI network showed that the top 10 target genes with degree value were IL6，AKT1，ALB，VEGFA，CCL2，EGF，IL1B，MMP-9，CASP3，MAPK1，topological analysis results showed that the top 10 target genes with degree value were PTGS2，MMP2，VEGFA，AKT1，ALB，CASP3，STAT3，IL6，MMP9，SERPINE1.GO enrichment analysis predicted that the treatment mechanism of this formula for coronary heart disease may be related to the regulation of nutritional level response，response to oxygen content，membrane rafts，membrane microdomains，phosphatase binding and other pathways.KEGG enrichment analysis predicted that the treatment of coronary heart disease by this prescription may achieve the curatie effects through several key pathways such as the AGE-RAGE signaling pathway，fluid shear stress and atherosclerosis，HIF-1 signaling pathway，and TNF signaling pathway.effect.Conclusion：This study explores the active components of Xuefu Zhuyu Decoction on coronary heart disease and its mechanism of action.Xuefu Zhuyu Decoction treats coronary heart disease through multiple targets and multiple pathways，which provides a theoretical basis for further research on the mechanism of action of the prescription.
Keywords Coronary heart disease; Xuefu Zhuyu Decotion; Network pharmacology; Target genes; Pathways; Mechanism
中图分类号：R289.5;R541文献标识码：Adoi：10.3969/j.issn.1673-7202.2021.09.009
冠心病是由于冠状动脉粥样硬化病变[1]，导致血管狹窄或阻塞而引起心肌组织缺血、坏死。中医将其归类为“胸痹”“真心痛”等范畴，是以膻中或左胸部发作性憋闷、疼痛为主要临床表现的一种病证。根据《中国心血管病报告2018》统计[2]，我国目前估计心血管病现患病总人数为2.9亿，其中冠心病患者为1 100万，患病率及病死率也处于持续上升的趋势[3-4]。网络药理学是基于系统生物学和计算机技术所形成的理论，对生物系统进行网络分析，选取特定信号节点，进行多靶基因药物分子设计的新学科。通过网络药理学研究中药治疗冠心病为目前研究热点之一，目前已知通过网络药理学研究了川芎[5]、丹参[6]、红花[7]等单味中药治疗冠心病的作用，但药物之间可能存在相互作用，仅从单味中药分析缺乏了对治疗疾病的整体认识，因此本研究基于中药系统药理学数据库与分析平台（Traditional Chinese Medicine Systems Pharmacology Database and Analysis Platform，TCMSP），筛选出血府逐瘀汤主要活性成分和靶点，从GeneCards数据库（http：//www.genecards.org/）中筛选出冠心病相关疾病靶点，并取“中药-疾病”交集靶点，通过蛋白质-蛋白质相互作用（Protein Protein Interaction，PPI）网络筛选交集靶点，得到其核心蛋白，并对核心蛋白进行拓扑分析;对其作用靶基因进行GO、KEGG等数据富集分析，为阐明血府逐瘀汤治疗冠心病作用机制提供理论依据及数据支持。
1 资料与方法
1.1 中药活性成分及作用靶基因查询与筛选
通过TCMSP平台，以“桃仁”“红花”“甘草”“枳壳”“赤芍”“柴胡”“川芎”“桔梗”“牛膝”“地黄”为关键词，检索其化学成分及靶点。化学成分筛选标准为口服生物利用度（Oral Bioavailability，OB）≥30%和类药性（Drug Likeness，DL）≥0.18，得到符合标准的中药活性成分及靶基因。
1.2 冠心病疾病靶基因的筛选
利用GeneCards数据库检索与冠心病发病相关的靶基因。通过Gifts算法计算靶基因与疾病之间的相关度，筛选出相关度>30的靶基因。
1.3 构建“中药-疾病”交集靶基因数据库及靶基因网络图
将筛选出的方剂靶基因与冠心病疾病靶基因利用PERL软件进行合并，取交集靶基因，获取“中药-疾病”交集靶基因数据库。利用Cytoscape 3.7.2软件构建“中药-活性成分-靶基因”网络图。
1.4 PPI网络的构建与关键节点的筛选
将交集靶基因导入在线String数据库（https：//string-db.org/），种族选择Homo sapiens，置信度分值代表PPI程度，将置信度分别设置为0.4和0.9，分别得到疾病靶基因PPI图，并以节点度值（Degree）为指标，筛选出前30个关键节点核心蛋白质靶标。
1.5 靶基因调控网络拓扑分析
将从String数据库中得到的PPI网络图导入Cytoscape，使用软件中的CytoNCA插件进行网络拓扑分析，以节点度值（Degree）和节点介度（Betweenness）来评估节点的重要程度，上述参数值的大小均与对应节点在该网络中的重要程度成正比。在构建关键节点的子网络上以Degree和Betweenness≥中位数为筛选条件，筛选Degree和Betweenness靠前的节点即为血府逐瘀汤治疗冠心病的核心靶基因。
1.6 GO和KEGG富集通路分析
通过GO数据库与KEGG数据库对核心靶标进行富集分析，设定阈值P≤0.5，选择生物过程（Biological Process，BP）、分子功能（Molecular Function，MF）和细胞组成（Cell Composition，CC）3个模块进行GO富集分析，通路分析选择KEGG，并将其前20个条目的结果可视化构建条形图和气泡图。
2 结果
2.1 中药活性成分及作用靶基因查询与筛选
通过检索TCMSP，获得血府逐瘀汤的活性成分及靶基因，并按照标准进行筛选。
结果显示：筛选出活性成分共224个，其中柴胡17个、赤芍29个、川芎7个、甘草92个、红花22个、桔梗7个、牛膝20个、桃仁23个、枳壳5个、地黄2个。筛选出靶基因共10 397个，其中柴胡2 722个、赤芍681个、川芎1 349个、甘草2 506个、红花1 466个、桔梗92个、牛膝1 034个、桃仁342个、枳壳205个、地黄34个，有部分活性成分作用于同一个靶基因，去重后获得相关靶基因3 564个。
2.2 筛选疾病靶基因与构建“中药-疾病”交集靶基因数据库
经GeneCards数据库检索，得到冠心病靶基因6 810个，取相关度>30的靶基因451个;借助Perl软件对451个冠心病疾病靶基因与3 564个血府逐瘀汤潜在作用靶基因合并，得到70个交集靶基因，构建为血府逐瘀汤治疗冠心病的靶基因数据库用于后续分析。
2.3 构建“中药-有效成分-靶基因”网络图
基于血府逐瘀汤中活性成分与冠心病疾病靶基因相互作用的关系，构建中药-有效成分-靶基因相互作用网络图，并采用Cytoscape 3.7.2软件进行可视化。见图1。
2.4 构建PPI网络图及其核心网络的筛选
将得到的交集基因利用String数据库进行分析，置信度设定为大于0.4，得到PPI，其中“边”为作用靶基因之间的关联，“边”的粗细代表其结合度大小，“边”越粗，其结合度越大;节点为作用靶基因。共有70个节点、1 162条边，平均节点度为33.2，平均局部聚类系数为0.765;将置信度设定为大于0.9，筛选得到PPI核心网络图，共有70个节点、218条边，平均节点度为6.23，平均局部聚類系数为0.543。见图2～3。
分别计算网络图中每个靶基因Degree，采用RX64 3.6.1软件绘制Degree前30个靶基因的柱状图，通过Degree测算得重要的冠心病相关蛋白质靶标，Degree值排名前10位的核心节点分别为IL6、AKT1、ALB、VEGFA、CCL2，EGF、IL1B、MMP9、CASP3、MAPK1。见图4。
2.5 拓扑分析
将从String数据库中得到的疾病与化合物交集基因PPI网络图导入Cytoscape，使用软件中的CytoNCA插件进行网络拓扑分析，筛选Degree和Betweenness靠前的节点即为血府逐瘀汤治疗冠心病的核心靶基因，Degree值排名前10的靶基因依次为PTGS2、MMP2、VEGFA、AKT1、ALB、CASP3、STAT3、IL6、MMP9、SERPINE1。见图5～7。
2.6 核心靶基因的通路分析
应用R64 3.6.1软件对血府逐瘀汤作用靶基因的BP、CC、MF进行GO通路富集分析，同时进行KEGG通路富集分析，设定阈值为P≤0.05，绘制条形图和气泡图说明血府逐瘀汤治疗冠心病的作用机制。
GO富集分析结果：GO功能富集分析得到GO条目2 091个，其中BP条目1 917个，CC条目75个，MF相关的条目99个。BP主要与对营养水平反应、对氧含量的反应、对活性氧反应、氧化应激反应、缺氧反应、对氧含量降低的反应、对脂多糖的反应、对细菌源性分子的反应等信号通路有关;CC主要与膜筏、膜微域、膜区域、小凹、囊腔、质膜筏、胞质囊腔、早期内体等信号通路有关;MF主要与磷酸酶结合、蛋白磷酸酶结合、抑制转录因子结合、细胞因子受体结合、核受体活性、转录因子活性，直接配体调控序列特异性DNA结合、蛋白酶结合、类固醇激素受体活性等信号通路有关，研究表明血府逐瘀汤可通过调节多个BP、CC、MF治疗冠心病。BP、CC、MF结果见表1。
2.7 KEGG富集分析
运用R64 3.6.1软件对筛选出的70个关键靶点基因映射KEGG通路富集分析，KEGG通路富集筛选得到106条信号通路。
结果显示：血府逐瘀汤可能通过糖尿病并发症AGE-RAGE信号通路、流体剪切应力和动脉粥样硬化、HIF-1信号通路、TNF信号通路，癌症中蛋白多糖、膀胱癌、IL-17信号通路、前列腺癌等作用通路发挥对冠心病的治疗作用。KEGG通路富集分析结果前20个条形图和气泡图见图8～9。
3 讨论
血府逐瘀汤出自王清任的《医林改错》[8]，具有活血化瘀、行气止痛之效，治疗胸中血瘀证。方中以桃仁活血化瘀润燥、红花活血止痛为君药;赤芍、川芎化瘀、助君行血，牛膝活血通经、引血下行，共为臣药;生地黄、当归滋养阴血，清热活血不伤阴，枳壳、柴胡宽畅气机、疏肝解郁，共为佐药;桔梗载药上行、甘草调和诸药，共为使药。现代研究表明[9]，血府逐瘀汤具有抗血小板聚集，抗心肌缺血，抑制血管平滑肌细胞增殖，抗心肌纤维化、抗炎、镇痛等作用。
本研究基于网络药理学，筛选出血府逐瘀汤有效活性成分及靶点，系统研究了血府逐瘀汤对疾病的干预作用及作用机制。通过PPI网络分析，发现Degree值排名前10的靶标为IL6、AKT1、ALB、VEGFA、CCL2、EGF、IL1B、MMP-9、CASP3、MAPK1;拓扑分析结果显示Degree值排名前10的靶基因为PTGS2、MMP2、VEGFA、AKT1、ALB、CASP3、STAT3、IL6、MMP9、SERPINE1。以上靶点可能与冠心病发病高度相关。现代研究表明，IL-6可增强局部炎症反应，诱导肝细胞合成CRP，是肝脏释放急性期蛋白的刺激因子，可侵蚀斑块内的基质，导致不稳定斑块破裂[10]。研究发现，在冠心病患者的粥样斑块中，血管平滑肌细胞与巨噬细胞的HB-EGF呈高表达[11-12]，因此认为HB-EGF促进动脉硬化，而正常人动脉中，HB-EGF呈均匀分布，且随着时间不断缓慢增加;故认为HB-EGF可作为冠心病发病的一个独立危险因子存在。MMP-9可通过消化纤维膜成分而促使斑块破裂，在不稳定斑块区域表达明显提高[13-15]。有研究表明CCL2为炎症反应的启动因子，通过诱导炎症介质释放，促进动脉粥样硬化的形成[16-17]。
通过GO富集分析预测出此方对冠心病的作用机制可能是通过调控营养水平反应、对氧含量的反应、对活性氧反应、氧化应激反应、膜筏、膜微域、膜区域、磷酸酶结合、蛋白磷酸酶结合、抑制转录因子结合等通路相关。
通过KEGG富集分析预测出此方对冠心病的作用机制可能与糖尿病并发症AGE-RAGE信号通路、流体剪切应力和动脉粥样硬化、HIF-1信号通路、TNF信号通路、癌症中蛋白多糖、膀胱癌、IL-17信号通路、前列腺癌等疾病通路密切相关，说明血府逐瘀汤可能通过以上通路发挥治疗冠心病的作用。本研究得到的相关通路与目前研究较多的细胞外调节蛋白激酶、PI3K/Akt、MFG-E8、Wnt、ERK-Calpain2、ERK12等冠心病信号通路不大相同[18-23]，说明血府逐瘀汤是通过多靶点、多通路治疗冠心病的。
综上所述，本研究基于网络药理学方法研究了血府逐瘀汤治疗冠心病主要作用活性成分及靶点，构建出中药成分-靶基因网络图，以及PPI网络图，并进行拓扑分析;对其交叉靶点进行GO、KEGG富集分析。结果表明，血府逐瘀汤可通过多靶点、多通路治疗冠心病;目前网络药理学存在一定的局限性，如存在目前基因库未知中药活性成分及靶点以及药物在煎煮过程中所涉及的有效成分的改变等，需要以后的研究进行完善。
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（2020-06-29收稿 责任编辑：张雄杰）
