基于生物金属有机骨架封装亚甲基蓝复合材料和信号放大策略高灵敏检测microRNA-141

    王存 刘蕃鑫 惠俊敏 邹晓川 邓明川 郑天平 刘林

    

    

    

    摘?要?MicroRNA-141（miRNA-141）的检测对相关癌症的早期诊断和预后评估具有重要意义。本研究建立了一种无酶的生物传感器，用于高灵敏检测miRNA-141。首先，合成了具有多孔结构和良好生物相容性的生物金属有机骨架（bio-MOF），通过离子交换的方式，bio-MOF可以封装大量亚甲基蓝（MB）信号分子，并保持其生物活性。其次，利用目标物循环信号放大策略中的催化发夹自组装（CHA）、辅助目标miRNA-141循环，实现信号放大，进一步提高了传感器的灵敏度。在1.0×1016～1.0×106 mol/L范围内，目标miRNA-141浓度的对数与传感器电化学信号呈线性相关，检出限为3.3×1017 mol/L（S/N=3）。将此方法应用于健康人血清中miRNA-141检测，加标回收率为99.9%～102.0%（RSD≤2.1%）。此生物传感器简单、可靠、灵敏度高、线性范围宽，为高灵敏检测其它miRNA提供了参考。

    关键词?生物传感器; 催化发夹自组装; 信号放大策略; MicroRNA-141; 生物金属有机骨架; 亚甲基蓝

    1?引 言

    MicroRNA-141（miRNA-141）是一种具有22个核苷酸的内源性、单链、非编码RNA，参与细胞增殖、分化和凋亡过程[1]。miRNA-141的异常表达（下调或上调）通常与多种癌症相关，如乳腺癌、胰腺癌、卵巢癌和前列腺癌等[2]。但是，miRNA-141具有分子量小和超低表达的特征，难以检测。尽管传统的分析方法，如Northern印迹杂交法[3]、荧光法[4]、微阵列分析法[5]和实时定量聚合酶链式反应（RT-PCR）[6]等，可以定量检测miRNA-141，但这些方法通常存在费用高、耗时长、样品前处理过程繁琐和仪器操作步骤复杂等问题[7]。电化学生物传感器具有灵敏度高、特异性好、操作简单和背景信号低等优点[8]，在检测微量甚至痕量miRNA-141方面效果良好。Mo等[7]以Mn掺杂的CdS@ZnS量子点和卟啉锰（MnPP）为信号探针和敏化剂，结合杂交链式反应（HCR）信号放大策略，构建了无酶生物传感器，实现了对miRNA-141的高灵敏检测，检出限达到3.3×1012 mol/L。Liu等[9]以9，10-二苯基蒽（DPA）纳米立方体为信号探针，将DNA纳米机器和目标物循环放大策略相结合，进一步提高了传感器的灵敏度，该方法具有灵敏度高和选择性好等优点，miRNA-141的检出限为3.0×1017 mol/L。

    生物金属有机骨架（bio-MOF），作为金属有机骨架（MOF）的一个新分支，属于超分子化学和生物科学交叉学科研究范畴[10]。bio-MOF不仅具有MOF的周期性重复的通道结构、孔径可调等优点，还具有环境友好、低毒、良好的生物相容性和独特的仿生特性等优点[11]。特别是当bio-MOF孔径和形状与客体分子（如染料分子）相匹配时，可以将客体固定到bio-MOF骨架內。基于此，bio-MOF已成功应用于生物马达[12]、药物输送[13]、电化学传感器[14]、催化[15]和环境保护材料[16]等领域。如Chen等[17]将罗丹明封装到bio-MOF的骨架中，用于二极管发光。Wang等[18]将荧光染料封装到bio-MOF中，合成了荧光复合材料，可作为双发射平台，识别不同种类硝基爆炸物。Zhang等[19]通过调节bio-MOF中Tb3+和Eu3+的能量转移过程，构建了用于检测炭疽生物标志物的传感器，具有生物相容性好、灵敏度高和选择性好等优点。因此，bio-MOF替换传统MOF应用于电化学生物传感器具有重要的理论和实际研究意义。

    近年来，各种核酸信号放大策略（如酶辅助的DNA纳米机器[20]和核酸外切酶诱导的目标物循环放大策略[21]等）被用于传感器的研制中，以提高传感器的灵敏度。然而，这些酶辅助的核酸信号放大策略受缓冲液pH值和温度等因素的影响较大。因此，发展高效、无酶、低成本的目标物循环放大策略具有重要意义。催化发夹自组装（CHA）作为一种目标物循环放大策略，不需要任何酶的参与即可实现目标物循环放大，具有成本低和操作简单等优点，在生物分析和生物传感领域引起了广泛关注。Xu等[22]制备了氮化碳纳米片-金纳米粒子（C3N4-AuNPs）纳米复合材料修饰电极，结合CHA信号放大策略，实现了对miRNA-141的高灵敏检测。Zhang等[23]设计了基于双CHA信号放大策略的传感器，实现了对miRNA-21和miRNA-155的同时检测。

    本研究合成了骨架内封装了大量亚甲基蓝信号分子的bio-MOF复合材料（MB@bio-MOF），通过聚乙烯亚胺（PEI）将金纳米粒子引入到MB@bio-MOF表面（AuNPs-MB@bio-MOF）。随后，通过Au-S键将发夹DNA 1（H1）和DNA 2（H2）分别固定到Au修饰的玻碳电极表面（H1/Au/GCE）和AuNPs-MB@bio-MOF表面（H2/AuNPs-MB@bio-MOF）。己硫醇（HT）封闭H1/Au/GCE中Au的非特异性吸附位点。当miRNA-141存在时，miRNA-141通过碱基互补配对将H1的发夹结构打开，使H1茎部的碱基序列暴露出来，暴露出来的碱基序列可以打开H2发卡结构，H1、H2进一步碱基互补配对可以将miRNA-141替换下来，使其进入下一个循环过程，如此不断循环。目标物浓度越大，大量带有MB信号分子的AuNPs-MB@bio-MOF复合材料被引入到电极表面，传感器的电化学信号增大，基于此可实现miRNA-141的高灵敏检测。

    2?实验部分

    2.1?仪器与试剂

    CHI66E电化学工作站（上海辰华仪器有限公司）。JSM-7800F扫描电子显微镜（日本电子株式会社）。实验采用三电极系统：玻碳电极（GCE，直径4 mm）为工作电极，铂丝为对电极，饱和甘汞电极为参比电极。

    腺嘌呤（Adenine，≥99%）、4，4′-联苯二甲酸（BPDC，97%）、N，N-二甲基甲酰胺（DMF，99.5%）、三乙胺（TEA，≥99%）、二水合醋酸锌（Zn（Ac）2·2H2O，99.99%）、HNO3（99%）、柠檬酸钠（AA，98%）、亚甲基蓝（MB，≥90%）、聚乙烯亚胺（PEI，50%）和HAuCl4·3H2O（99.9%）购自上海阿拉丁试剂公司。其它试剂均为分析纯。健康人血清样品来源于重庆市第九人民医院。0.1 mol/L磷酸盐缓冲溶液（PBS，pH 7.4）由Na2HPO4和KH2PO4配制，支持电解质为0.1 mol/L KCl。用DNA杂交和保存用缓冲液为含140 mmol/L NaCl、5 mmol/L KCl、1 mmol/L MgCl2的Tris-HCl缓冲液（0.1 mol/L，pH 7.4）。实验用水为二次蒸馏水。所有寡聚核苷酸均由上海生工生物工程有限公司提供，具体序列详见表1。所有发卡DNA使用之前均在95℃变性5 min，缓慢冷却到室温。

    2.2?实验方法

    2.2.1?Bio-MOF的制备[17] BPDC（0.1211 g）加入到5 mL DMF中，搅拌15 min，然后加入TEA（4 mmol），继续搅拌15 min。完全溶解后，加入腺嘌呤（0.0338 g）、Zn（Ac）2·2H2O（0.1646 g）、HNO3（0.125 mL）、DMF（22 mL）和水（2 mL），持续搅拌30 min后，将上述混合物转移到50 mL 不锈钢高压反应釜中，130℃下反应24 h，得到白色的固体。冷却至室温，分别用DMF和无水乙醇离心洗涤5次，所得样品置于60℃烘箱中干燥6 h，得到白色粉末，记为bio-MOF。

    2.2.2?MB@bio-MOF的制备[24] 25 mg bio-MOF置于5 mL 5.0×103 mol/L MB溶液（溶剂为DMF）中，搅拌8 h，用DMF和无水乙醇各离心洗涤5次后，置于60℃烘箱中干燥6 h，得到蓝色固体，记为MB@bio-MOF。 bio-MOF和MB@bio-MOF复合材料的制备过程如图1所示。

    2.2.3?AuNPs的制备[25] 在剧烈搅拌条件下，将1 mL AA（1%）迅速加入到100 mL沸腾的HAuCl4溶液（0.01%）中。持续搅拌10 min后，溶液变为酒红色，冷却，于4℃保存，备用。

    2.2.4?AuNPs-MB@bio-MOF的制备?将20 μL PEI（1%）加入到1 mL水中，搅拌15 min。将5 mg MB@bio-MOF加入上述溶液中，室温搅拌8 h。12000 r/min离心5 min，除去游离的PEI，将得到的固体重新分散到1 mL PBS（0.1 mol/L，pH 7.4）中。加入5 mL AuNPs溶液，搅拌30 min，通过AuN键将AuNPs固定到PEI修饰的MB@bio-MOF表面，離心，并重新分散到1 mL PBS中，得到AuNPs-MB@bio-MOF复合材料，室温下保存。

    2.2.5?信标复合物（H2/AuNPs-MB@bio-MOF）的制备

    向1 mL含有5 mg AuNPs-MB@bio-MOF的PBS中加入100 μL发卡DNA 2（H2，10 μmol/L），4℃下搅拌过夜，通过AuS键将H2固定到AuNPs-MB@bio-MOF表面，得到H2/AuNPs-MB@bio-MOF复合物。

    2.3?传感器的构建

    将GCE依次用0.3和0.05 μm的A12O3粉末打磨、抛光成镜面，然后分别用无水乙醇和水超声清洗，室温下晾干，浸入1% HAuCl4溶液，0.2 V恒电位沉积30 s，得到纳米金修饰电极（Au/GCE）。滴加10 μL 发卡DNA 1（H1，2 μmol/L），4℃孵育过夜，通过AuS键将H1修饰到Au/GCE表面。随后，滴加10 μL己硫醇（HT，20 mmol/L）于电极表面，4℃孵育2 h，封闭Au的非特异性吸附位点（记为H1/Au/GCE）。将不同浓度miRNA-141（10 μL）和上述H2/AuNPs-MB@bio-MOF复合物（10 μL）先后滴到H1/Au/GCE表面，37℃下分别孵育2 h。miRNA-141浓度越大，电极表面引入的AuNPs-MB@bio-MOF信标复合物越多，传感器的峰电流响应值越大，从而实现对miRNA-141的灵敏检测（见图2）。

    3?结果与讨论

    3.1?bio-MOF的表征

    由bio-MOF的扫描电镜图（图3）可见，bio-MOF由若干花状结构的球体组成，直径约100 μm，此结果与文献[12]一致。与阴离子型MOFs相似，本研究合成的bio-MOF骨架同样带负电荷[17，18，25]。其中，内源性的二甲铵阳离子（DMF分解的产物（CH3）2NH2+）易与外源性阳离子发生离子交换[17，26]。因此，本研究通过阳离子交换实验将MB封装到bio-MOF骨架内。

    采用能量色散X射线光谱（EDX）进一步研究bio-MOF的组成及元素质量百分比。如图4所示，bio-MOF由C、N、O和Zn元素组成，质量百分比分别为39.05%、5.48%、24.38%和31.10%。结果表明，bio-MOF成功合成。

    采用X射线光电子能谱（XPS）分别研究了MB@bio-MOF和AuNPs-MB@bio-MOF的元素组成。由图5可见，284.7、398.7、530.4和168.7 eV分别为C1s、N1s、O1s、和S2p的特征峰，1043.7和1020.9 eV属于Zn2P3特征峰，89.4和92.2 eV属于Au4f特征峰。结果表明，MB@bio-MOF和AuNPs-MB@bio-MOF复合材料成功合成。

    3.2?傳感器组装过程表征

    在5 mmol/L Fe（CN）3/46的溶液中，采用循环伏安法（CV）和电化学阻抗谱（EIS）对不同修饰电极进行了表征。由图6A可知，与裸GCE（曲线a）相比，Au/GCE（曲线b）峰电流值明显增大，这主要归因于Au的良好导电性。与H1孵育后，由于带负电荷的探针Fe（CN）3/46与相同带负电荷H1之间的静电斥力作用[7]，相比曲线a和b，H1/Au/GCE（曲线c）峰电流值明显下降。滴加HT封闭Au非特异性结合位点后，由于HT导电性差，进一步阻碍了电子传递，峰电流值继续下降（曲线d）。

    EIS图谱主要由高频区的半圆和低频区的直线组成，分别对应电子转移（或动力学）控制过程和扩散控制过程，其中半圆直径大小对应电子转移电阻（Ret）[27]。由图6B可知，Au/GCE（Ret=37 Ω，曲线b）阻抗小于裸GCE（Ret=73 Ω，曲线a），与H1和HT孵育后，H1/Au/GCE（Ret=570 Ω，曲线c）和HT/H1/Au/GCE（Ret=732 Ω，曲线d）的阻抗值依次增大。EIS图谱与CV表征结果一致，表明目标电极制备成功。

    3.3?可行性实验

    图7为传感器在目标物miRNA-141存在和不存在条件下的电化学响应曲线。当目标物不存在时（曲线a），传感器没有明显的电化学响应。当目标物存在时（曲线b和c），在0.231和0.261 V产生一对明显的氧化还原峰，且随着目标物浓度增大，峰电流值逐渐增强，说明本方法可用于mRNA-141的检测。miRNA-141存在时，H1的发卡结构被打开，触发CHA循环，暴露出来的H1茎部碱基序列可以打开H2发卡结构，AuNPs-MB@bio-MOF复合物被引入到电极表面，传感器出现较强的电化学响应信号。H1、H2进一步反应，可将miRNA-141替换下来，使其进入下一个CHA循环过程中，以此不断循环，提高传感器的检测灵敏度。

    3.4?传感器的分析性能

    不同浓度miRNA-141的差分脉冲伏安（DPV）响应曲线和线性关系曲线如图8所示，随着miRNA-141浓度增加，DPV峰电流值随之增大。在1.0×1016～1.0×106 mol/L浓度范围内，miRNA-141浓度与传感器响应呈现良好的线性关系，线性回归方程为Ip=42.91 + 1.805 lgC（R2=0.992），检出限为3.3×1017 mol/L（S/N=3）。与其它方法相比，此生物传感器具有更宽的线性范围和更高的灵敏度（表2）。

    3.5?传感器的抗干扰能力和稳定性

    在相同检测条件下，通过比较空白样品、目标miRNA-141、干扰物质（凝血酶（TB）、miRNA-182-5P、miRNA-21和miRNA-155）和混合样品（由目标miRNA-141和干扰物质组成）的峰电流值大小，考察传感器的抗干扰能力。由图9可知，1.0×109 mol/L干扰物质的响应电流值与空白样品相近，分别为1.0×1016 mol/L 目标miRNA-141检测信号的15.9%、21.3%、5.0%和10.1%。相反，目标miRNA-141和混合样品（由1.0×109 mol/L干扰物质和1.0×1016 mol/L miRNA-141组成）的响应电流值明显增大，表明所制备的传感器具有较高的选择性。此外，考察了传感器的稳定性。连续测量8次后，传感器峰电流值没有明显变化（RSD=0.7%），表明此传感器具有良好的稳定性。

    3.6?实际样品分析

    采用本方法对健康人血清样品中的miRNA-141进行检测，考察此生物传感器的实用性。将人血清样品（重庆市第九人民医院提供，患者均知情同意）离心10 min，取上清液，用0.1 mol/L PBS（pH 7.4）稀释50倍。分别将1.00×1017 mol/L，1.00×1016mol/L和1.00×1010 mol/L的miRNA-141加入到处理好的血清样品中，采用本方法进行测定，检测结果如表3所示。 miRNA-141的回收率在99.9%～102.0%之间，RSD≤2.1%，表明此传感器具有良好的实用性。

    4?结 论

    基于生物金属有机骨架封装MB复合材料和目标物循环扩增策略，构建了用于高灵敏检测miRNA-141的生物传感器。通过bio-MOF固载大量MB信号分子并保持其生物活性，结合目标物循环扩增策略，实现信号放大，提高传感器灵敏度。此传感器为各种miRNA的高灵敏检测提供了平台，有望为癌症等重大疾病的早期诊断和预后评价提供参考。

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