异补骨脂素通过PPAR-γ-Axin2-Wnt信号通路调节对大鼠骨代谢的影响

    王军 王剑 鲁敏 牧亭亭 耿亚会

    

    

    

    摘要 目的：探討异补骨脂素通过PPAR-γ-Axin2-Wnt信号通路调节对大鼠骨代谢的影响。方法：选择雌性大鼠40只，随机分为模型组和异补骨脂素组，各20只，实验12周后，对大鼠骨密度、骨组织形态进行观察，并检测各组大鼠血清骨代谢生化指标情况，采用蛋白质免疫印迹法（Western blotting）检测PPAR-γ、Axin2及β-catenin蛋白的表达情况。结果：12周后，模型组大鼠股骨、骨盆、脊柱及全身骨密度值均低于异补骨脂素组（P<0.05）;异补骨脂素组大鼠血清钙、磷及抗酒石酸酸性磷酸酶（Tartrate Resistant Acid Phosphatase，TRACP）水平低于模型组，血清碱性磷酸酶（Alkaline Phosphatase，ALP）水平高于模型组（P<0.05）;骨组织形态计量学分析结果显示，模型组大鼠骨小梁稀疏、断裂明显，而异补骨脂素组大鼠骨小梁面积百分数和骨小梁数目明显增加，骨小梁分离度明显下降（P<0.05）。12周后，与模型组比较，异补骨脂素组PPAR-γ和Axin2蛋白水平下调，β-catenin蛋白表达明显增加（P<0.05）。结论：异补骨脂素可能通过抑制Axin2/PPAR-γ信号通路，激活Wnt信号通路，改善大鼠骨代谢。

    关键词 异补骨脂素;骨质疏松;骨代谢;骨组织形态;Wnt信号通路;PPAR-γ蛋白;Axin2蛋白;β-catenin蛋白

    Effects of Isopsoralen on Bone Metabolism in Rats Via PPAR Gamma-Axin 2-Wnt Signal Regulation

    WANG Jun，WANG Jian，LU Min，MU Tingting，GENG Yahui

    （Department of Traumatic Orthopaedics，People′s Hospital of Inner Mongolia Autonomous Region，Hohhot 010000，China）

    Abstract Objective：To investigate the effects of isopsoralen on bone metabolism in rats through PPAR-gamma-Axin2-Wnt signal regulation.Methods：A total of 40 female rats were randomly divided into a model group and an isopsoralen group with 20 rats in each group.After 12 weeks of experiment，the bone mineral density（BMD） and bone histomorphology of rats were observed，and the biochemical indexes of bone metabolism in serum of rats in each group were detected.The expressions of PPAR-gamma，Axin 2 and beta-catenin protein were detected by Western blotting.Results：After 12 weeks，BMD values of femur，pelvis，spine and whole body in model group were lower than those in isopsoralen group（P<0.05）; serum Ca，P and TRACP levels in isopsoralen group were lower than those in model group，and serum ALP levels were higher than those in model group（P<0.05）; bone histomorphometric analysis showed that the trabeculae of model group were sparse and fractured obviously.The percentage of bone trabecular area and the number of bone trabeculae increased significantly，and the degree of trabecular segregation decreased significantly（P<0.05）.After 12 weeks，compared with model rats，PPAR-gamma and Axin 2 protein levels in isopsoralen group were down-regulated and beta-catenin protein expression was significantly increased（P<0.05）.Conclusion：Isopsoralen may improve the abnormal bone metabolism in rats by inhibiting Axin2/PPAR gamma signaling pathway，activating Wnt signaling pathway and improving bone metabolism in rats.

    Keywords Isopsoralen; Osteoporosis; Bone metabolism; Bone histomorphology; Wnt signaling pathway; PPAR-γ protein; AXIN2 protein; β-Catenin protein

    中图分类号：R284文献标识码：Adoi：10.3969/j.issn.1673-7202.2021.09.011

    骨质疏松（Osteoporosis，OP）是临床常见的全身性骨骼疾病，其特征表现为骨组织微结构受损、骨量降低及骨脆性增加[1]。OP易导致骨折，引起患者致残和致死率增高，严重影响患者的生命质量[2]。目前OP已成为全球范围的一个公共健康问题，因此，对OP的防治具有重要的临床意义[3]。目前临床上OP的药物治疗虽然具有一定疗效，但其不良反应较多，且经济成本较高，因此探寻一种安全、不良反应小、费用低廉的药物治疗方法显得十分必要[4]。异补骨脂素是从豆科植物中提取的一种香豆素类化合物，具有促进骨代谢的作用[5]。本研究通过动物实验，探讨异补骨脂素调控大鼠PPAR-γ-Axin2-Wnt信号通路的机制及对骨代谢的影响，为防治OP提供新思路。

    1 材料与方法

    1.1 材料

    1.1.1 动物 选用6月龄雌性健康大鼠[动物批准号：SCXK（京）2018-0013]40只，均购于北京华阜康生物科技股份有限公司，饲养于清洁级实验室中，所有大鼠自由饮水摄食。本研究经我院实验动物管理与动物福利伦理委员会审批通过（伦理审批号：20180121）。

    1.1.2 药物

    地塞米松钠注射液（天津药业焦作有限公司，国药准字H41020035）、异补骨脂素（成都瑞芬思生物科技有限公司，批号：20180122）。

    1.1.3 试剂与仪器

    骨密度仪（NORLAND公司，美国，型号：XR-46）、电子天平（日本岛津公司，型号：AEL-40SM）、全自动酶标仪（上海闪谱生物科技有限公司，型号：Read Max 1900Plus）、显微镜（日本OLYMPUS公司，型号：Olympus IX71）、电泳仪（美国Bio-Rad公司，型号：Bio-RaD）;钙（Ca）检测试剂盒（北京康为世纪生物科技有限公司，批号：180103）、磷（P）检测试剂盒（宁波博泰生物技术有限公司，批号：170903）、碱性磷酸酶（ALP）检测试剂盒（宁波博泰生物技术有限公司，批号：171104），抗酒石酸酸性磷酸酶（TRACP）检测试剂盒（宁波博泰生物技术有限公司，批号：180115）、PPAR-γ抗体（美国Ssanta Cruz公司，批号：180112）、β-catenin抗体（美国Ssanta Cruz公司，批号：180107）和Axin2抗体（美国SsSanta Cruz公司，批号：180110）;Trizol总RNA提取试剂（北京康为世纪生物科技有限公司，批号：180103）、Western blotting及凝胶电泳试剂（南京凯基生物有限公司，批号：171014）。

    1.2 方法

    1.2.1 分组与模型制备

    将40只健康大鼠采用随机数字表法分为模型组和异补骨脂素组，每组20只。各组大鼠右侧臀部肌内注射地塞米松钠注射液（2.5 mg/kg），每周2次，连续注射12周。

    1.2.2 给药方法 自造模之日起，模型组大鼠给予10 mL/（kg·d）生理盐水灌胃，异补骨脂素组给予异补骨脂素混悬液治疗，剂量为25 mg/（kg·d），每周停1 d，连续治疗12周，期间密切观察各组大鼠的生理反应及生活习性变化情况。

    1.2.3 检测指标与方法

    大鼠骨密度及血清骨代谢检测：12周后将各组大鼠用10%水合氯醛腹腔麻醉后，采用骨密度仪对各组大鼠股骨、骨盆、脊柱及全身骨密度进行检测。检测完毕后，腹部脱毛后正中纵切开、分离肌肉和筋膜，将腹动脉暴露，抽取2.0 mL血液样本，然后将腹动脉结扎。血标本采用离心机离心（离心半径：10 cm）10 min，取上清，-80 ℃备存待测。采用全自动生化分析仪检测各组大鼠血清钙、磷、碱性磷酸酶（Alkaline Phosphatase，ALP）及抗酒石酸酸性磷酸酶（Tartrate Resistant Acid Phosphatase，TRACP）水平，严格按照相关剂盒使用说明书进行操作。

    大鼠骨组织形态计量学分析：12周后将各组大鼠用10%水合氯醛腹腔麻醉后，处死大鼠，进行解剖，取第四腰椎骨（L4），放入冷处理后的2.5%戊二醛中固定12 h，常温下脱钙至大头针能刺进骨密质为止，包埋剂进行包埋，切片机冰冻切片（厚度15 μm），粘贴于载玻片上，-20 ℃备存待测。采用改良番红O-固绿软骨染色液试剂盒染色处理后，进行骨组织形态计量学分析，每只大鼠取3张切片，每张切片观察2个视野，显微镜观察并拍照，采用Image-Pro Plus彩色医学图文分析系统对骨小梁形态进行分析，观察骨小梁面积百分数、骨小梁分离度及骨小梁数目情况。

    PPAR-γ、Axin2及β-catenin蛋白表达：采用Western blotting法检测骨组织PPAR-γ、Axin2及β-catenin蛋白表达：12周后，处死大鼠取右侧股骨头，碾碎后倒入匀浆器，加入裂解液混匀，按照Trizol总RNA提取试剂盒说明书进行操作，提取总蛋白，-80 ℃下冻存，将总蛋白溶入等体积的缓冲液中煮沸10 min，经聚丙烯酰胺凝胶电泳进行分离蛋白，然后转印到聚偏二氟乙烯膜（Polyvinylidene Fluoride）上，放入封闭液中摇动1 h，加入一抗（PPAR-γ、β-catenin和Axin2抗體均为1∶500稀释）孵育，4 ℃下过夜。二抗孵育（1∶200 0稀释）12 h，免疫荧光增强法显色，PPAR-γ、Axin2及β-catenin蛋白的表达量与GAPHD的灰度比值表示。

    1.3 统计学方法

    采用SPSS 19.0统计软件处理数据，计量资料以均数±标准差（±s）表示，采用t检验，P<0.05为差异有统计学意义。

    2 结果

    2.1 2组大鼠的骨密度情况

    12周后，异补骨脂素组大鼠股骨、骨盆、脊柱及全身骨密度值均高于模型组（P<0.05）。见表1。

    2.2 2组大鼠血清骨代谢情况

    12周后，异补骨脂素组大鼠血清钙、磷及TRACP水平低于模型组，血清ALP水平高于模型组大鼠（P<0.05）。见表2。

    2.3 2组大鼠骨组织形态情况

    12周后，骨组织形态计量学分析结果显示，与补骨脂素组大鼠比较，模型组大鼠骨小梁稀疏、断裂明显（图1），而异补骨脂素组大鼠骨小梁面积百分数和骨小梁数目明显增加，骨小梁分离度明显下降（P<0.05）。见表3。

    2.4 2组大鼠骨组织PPAR-γ、Axin2及β-catenin蛋白的表达情况

    12周后，与模型组大鼠比较，异补骨脂素组PPAR-γ和Axin2蛋白水平下调，β-catenin蛋白表达明显增加（P<0.05）。见表4，图2。

    3 讨论

    OP是一个全球性的公共卫生问题，随着我国老龄化进程的加快，OP的发病率呈逐年增长的趋势[6]。OP主要是骨吸收和骨形成的骨代谢失衡引起[7]。受各种因素影响（年龄、内分泌、遗传及环境等因素），骨形成减弱或骨吸收增强时，机体会发生OP，并会呈持续性发展，极易导致各种骨折发生，给患者的生命质量带来严重影响，因此对OP的防治具有十分重要的临床意义[8-9]。大鼠是OP动物模型最常用的动物之一，其OP模型稳定性好，并可重复[10]。本研究通过地塞米松诱导建立OP大鼠模型进行实验研究，对研究人类OP有着积极的指导意义。

    临床上对OP的药物治疗常采用雌激素替代疗法，可有效延缓OP病情的发展，但其引起水肿、高血压及痴呆等不良反应的风险较高[11]。近年来寻找和筛选中药中与雌激素相类似的实验研究成为热点。植物雌激素是存在于植物中的一种活性成分，可与雌激素受体特异性的结合，发挥治疗OP的效果，又可避免不良反应[12]。异补骨脂素是从豆类植物中提取的一种化学活性成分，具有温脾止泻、温补肾阳的功效[13]。相关研究证实，异补骨脂素可促进骨代谢，起到防治骨质疏松的作用[14]。本研究结果显示，12周后，异补骨脂素组大鼠股骨、骨盆、脊柱及全身骨密度值均高于模型组，异补骨脂素组大鼠骨小梁面积百分数和骨小梁数目明显增加，骨小梁分离度明显下降。这可能是因为异补骨脂素可发挥类似雌激素的作用，可有效控制大鼠的骨量流失，促进大鼠成骨细胞增殖，一定程度改善骨小梁微结构，起到防治OP的作用。

    钙和磷是机体必需的微量元素，可在骨代谢中起到重要作用[15]。ALP可由成骨细胞分泌，可参与成骨细胞的分化、增殖及迁移，可作为反映成骨细胞变化的标志物[16]。TRACP可由破骨细胞分泌，可反映破骨细胞的活性[17]。本研究结果显示，12周后，异补骨脂素组大鼠血清钙、磷及TRACP水平低于模型组，血清ALP水平高于模型组大鼠（P<0.05），这是因为通过异补骨脂素治疗，可有效刺激成骨细胞的骨形成，ALP水平上升，同时抑制破骨细胞的骨吸收，TRACP水平下降，另外可降低血清钙和磷水平，促进破骨细胞活性和骨吸收，促进骨代谢效果。

    骨髓細胞大部分为脂肪细胞，其在骨代谢方面具有重要的作用，脂质代谢紊乱被认为可能是骨质疏松的病因之一[18]。PPAR-γ蛋白是一种核激素受体，会抑制成骨细胞特异转录因子表达，造成骨形成减弱，并可促进破骨细胞发育，造成骨吸收增加[19]。PPAR-γ可促进骨髓细胞向脂肪细胞分化，导致脂质代谢紊乱[20]。Wnt信号通路在成骨细胞分化和增殖中起重要作用，β-catenin蛋白是Wnt信号通路的主要成分，可启动Wnt信号通路[21]。Axin2是一种骨架蛋白，可抑制Wnt信号通路的激活[22]。本研究结果显示，12周后，与模型组大鼠比较，异补骨脂素组PPAR-γ和Axin2蛋白水平下调，β-catenin蛋白表达明显增加。这可能是因为异补骨脂素可有效抑制下调PPAR-γ表达，减少骨髓内的脂肪组织堆积，避免骨髓脂质代谢紊乱。通过减少PPAR-γ的活化，可间接下调Axin2的表达，抑制Axin2/PPAR-γ信号通路参与脂质代谢，并可阻断Axin2对Wnt信号通路的抑制，上调β-catenin蛋白表达，使β-catenin进入细胞核后与核内转录因子形成复合体，最终启动Wnt信号通路，实现对大鼠骨髓脂质代谢的调节，进而影响其骨代谢，促进骨形成。

    综上所述，异补骨脂素可能通过抑制Axin2/PPAR-γ信号通路，激活Wnt信号通路，改善大鼠骨代谢异常，促进骨形成，可为OP防治新药物的开发提供新思路，带来良好的社会与经济效益。

    参考文献

    [1]Ganguly P，El-Jawhari JJ，Giannoudis PV，et al.Age-related Changes in Bone Marrow Mesenchymal Stromal Cells：A Potential Impact on Osteoporosis and Osteoarthritis Development[J].Cell Transplant，2017，26（9）：1520-1529.

    [2]Ge DW，Wang WW，Chen HT，et al.Functions of microRNAs in osteoporosis[J].Eur Rev Med Pharmacol Sci，2017，21（21）：4784-4789.

    [3]Verbovoy AF，Pashentseva AV，Sharonova LA.Osteoporosis：Current state of the art[J].Ter Arkh，2017，89（5）：90-97.

    [4]张学武，姚海红，梅轶芳，等.全国多中心使用糖皮质激素风湿病患者骨质疏松调查[J].中华临床免疫和变态反应杂志，2017，11（3）：277-284.

    [5]刘锐，杨小杰，李鑫，等.异补骨脂素对去卵巢大鼠骨代谢的影响研究[J].中国骨质疏松杂志，2017，23（6）：807-811.

    [6]Xie F，Zhou B，Wang J，et al.Microstructural properties of trabecular bone autografts：comparison of men and women with and without osteoporosis[J].Arch Osteoporos，2018，13（1）：18.

    [7]Mu WQ，Huang XY，Zhang J，et al.Effect of Tai Chi for the prevention or treatment of osteoporosis in elderly adults：protocol for a systematic review and meta-analysis[J].BMJ Open，2018，8（4）：e020123.

    [8]Sedlak CA，Roller CG，van Dulmen M，et al.Transgender Individuals and Osteoporosis Prevention[J].Orthop Nurs，2017，36（4）：259-268.

    [9]Nakamura Y，Suzuki T，Kato H.Denosumab significantly improves bone mineral density with or without bisphosphonate pre-treatment in osteoporosis with rheumatoid arthritis：Denosumab improves bone mineral density in osteoporosis with rheumatoid arthritis[J].Arch Osteoporos，2017，12（1）：80.

    [10]馬涛，王通.运动对废用性骨质疏松大鼠骨代谢和破骨细胞分化OPG-RANKL-RANK系统的影响[J].中国运动医学杂志，2017，36（7）：578-585.

    [11]Baji P，Gulácsi L，Horváth C，et al.Comparing self-perceived and estimated fracture risk by FRAX of women with osteoporosis[J].Arch Osteoporos，2017，12（1）：4.

    [12]陈梦，赵丕文，赵笛，等.中药植物雌激素的药理作用研究进展[J].江苏中医药，2017，49（4）：82-85.

    [13]刘俊岑，刘海洋，刘国良，等.异补骨脂素对紫外线诱导人真皮成纤维细胞损伤的保护作用及机制研究[J].国际中医中药杂志，2018，40（4）：339.

    [14]张盼阳，王琴，袁晓美，等.异补骨脂素单次给药在大鼠体内的药代动力学研究[J].中国临床药理学杂志，2018，34（14）：1689-1692.

    [15]林上进，程群，邵云潮，等.血骨代谢指标及骨密度与骨组织钙、磷及金属微量元素含量的相关性[J].中华骨质疏松和骨矿盐疾病杂志，2017，10（6）：513-518.

    [16]刘爽，张玉莲，毕聪聪，等.补肾法中药对去卵巢大鼠骨质疏松骨代谢指标的影响[J].中国老年学杂志，2017，37（3）：529-530.

    [17]胡咏新，孙利，褚晓秋，等.左归丸对甲强龙脉冲治疗Graves眼病骨代谢水平的影响[J].南京中医药大学学报，2017，33（2）：118-121.

    [18]李莉莉，钟佩茹.非创伤性股骨头坏死发病相关因素及信号通路机制的研究进展[J].医学综述，2018，24（1）：22-27.

    [19]Sun H，Zhu X，Cai W，et al.Hypaphorine Attenuates Lipopolysaccharide-Induced Endothelial Inflammation via Regulation of TLR4 and PPAR-γ Dependent on PI3K/Akt/mTOR Signal Pathway[J].Int J Mol Sci，2017，18（4）：844.

    [20]Mori H，Okada Y，Tanaka Y.The Effects of Pioglitazone on Bone Formation and Resorption Markers in Type 2 Diabetes Mellitus[J].Intern Med，2017，56（11）：1301-1306.

    [21]Nusse R，Clevers H.Wnt/β-Catenin Signaling，Disease，and Emerging Therapeutic Modalities[J].Cell，2017，169（6）：985-999.

    [22]Hulin A，Moore V，James JM，et al.Loss of Axin2 results in impaired heart valve maturation and subsequent myxomatous valve disease[J].Cardiovasc Res，2017，113（1）：40-51.

    （2019-06-19收稿 责任编辑：杨觉雄）