徐州地区猪源致病性大肠杆菌耐药性调查
昌莉丽 李华坤 孙朋
摘要：为了掌握徐州地区猪场大肠杆菌耐药菌株的产生情况和耐药程度，在2016-2018两年间对徐州地区猪源大肠杆菌进行耐药监测。从猪场分离鉴定致病性大肠杆菌，采用纸片扩散法测定46株分离菌株对15种抗菌药物的敏感性。结果表明，猪源大肠杆菌分离株多重耐药现象严重，至少耐药10种以上，其中10耐和11耐的菌株所占比例最大，分别为28.3%和23.9%；分离菌株对阿莫西林、氟苯尼考、强力霉素耐药率最高，达到80%以上，对头孢噻呋耐药率最低，为17.4%。两年间痢菌净耐药率下降幅度最大，丁胺卡那霉素耐药率增长幅度最大。
关键词：猪源大肠杆菌；药敏试验；耐药监测
中图分类号：S858.28 文献标识码：A 文章编号：1007-273X（2018）10-0011-02
作为猪肉消费大国，养猪在我国畜牧业中一直占有重要地位，而由致病性大肠杆菌引起的仔猪腹泻一直是危害养猪业的重大疾病。致病性大肠杆菌主要危害1月龄以内的仔猪和断奶仔猪，常发生严重的腹泻和败血症。常见的疾病有仔猪黄痢、仔猪白痢、仔猪水肿病，具有流行面广、发病率和死亡率高等特点。养猪生产中，尤其是一些饲养管理条件较差的中小型猪场，一旦环境改变，气温骤变，大肠杆菌就易趁虚而入，还常常和流行性腹泻、伪狂犬等病毒性疾病混合感染，给养猪业造成巨大的经济损失。目前，对该病的防治主要是应用疫苗预防和药物防治。然而由于大肠杆菌菌株血清型众多且每个地方流行血清型不同，应用疫苗对大肠杆菌病无法进行有效预防，临床上大多使用抗菌药物来防治。但是由于抗菌药的过量和滥用，大肠杆菌耐药现象日益严重，应用新的抗生素就有新的耐药菌株出现，细菌产生耐药性的变异速度远高于新药的研发速度，抗生素的选择压力愈来愈大。因此，对大肠杆菌耐药性进行监测研究已成为国内外重要的研究方向之一。
为了解江苏省徐州地区猪源大肠杆菌的耐药现状，本研究从徐州地区多个猪场采集患病仔猪腹泻粪便和病死猪肠道内容物，分离鉴定46株致病性大肠杆菌，开展徐州地区猪源大肠杆菌的耐药监测，旨在掌握该地区猪源致病性大肠杆菌耐药性的变迁情况，为该地猪场大肠杆菌病的防治提供指导。
1 材料与方法
1.1 材料
药敏质控菌株ATCC25922，购于中国兽药监察所，本实验室保存。
46株致病性大肠杆菌临床分离株来源于徐州铜山、邳州、丰县、沛县等养猪场，根据腹泻症状初步诊断为仔猪黄白痢，无菌棉拭子采取患病仔猪肛门粪便、病死猪肠道内容物涂在即用型麦康凯培养基平板上进行培养分离，挑取粉红单个菌落接种到即用型伊红美兰培养基平板上，挑取黑色金属光泽单个菌落进行革兰氏染色形态学观察，生化反应检查，鉴定为大肠杆菌，在普通琼脂斜面培养基上进行纯培养，胶塞密封保存，4 ℃冰箱保存备用。
药敏纸片：除氟苯尼考、多粘菌素、恩诺沙星等药敏片为实验室保存自制药敏片外，其他药敏片为BIO-KONT 温州市康泰生物科技有限公司生产。
培养基：麦康凯琼脂培养基平板（即用型）、伊红美兰培养基平板（即用型）、营养琼脂培养基平板（即用型）、营养肉汤培养基、营养琼脂培养基，杭州微生物试剂有限公司生产。
1.2 方法
在2016-2018两年间，从江苏省徐州市周边养殖场仔猪腹泻病例中分离所得大肠杆菌中随机挑选46株作为试验菌株，采用WHO推荐的Kirby—Bauer法对临床常用15种药物进行药敏试验。依据NCCLS有关标准，每次测定均以质控菌株为对照，只有当质控菌株的抑菌圈直径在允许范围内测试菌株的结果才有效。按抗菌药物敏感性试验扩散法标准判定各菌株的敏感度，对所分离的细菌进行药敏试验。以敏感、中介、耐药3种形式对抑菌圈大小作出判定，监测细菌对临床常用药物的耐药性。
2 结果与分析
2.1 猪源大肠杆菌耐药性监测结果
2016-2018两年间从猪肠道分离的46株大肠杆菌对15种药物均产生了耐药性，其中有12种药物耐药率在50%以上。耐药情况比较严重的阿莫西林、氟苯尼考、强力霉素均达到了80%以上，其余依次是氨苄西林钠、复方SMZ、痢菌净、恩诺沙星、乳酸环丙沙星、头孢曲松、新霉素、庆大霉素、丁胺卡那霉素，头孢噻呋、多粘菌素、氧氟沙星耐药率则比较低。两年内，除氟苯尼考、多粘菌素、乳酸环丙沙星、痢菌净4种药物的耐药率有所下降之外，其他药物对大肠杆菌的耐药率均保持或出现不同程度地增长，其中痢菌净耐药率下降幅度最大，丁胺卡那霉素耐药率增长幅度最大。
2.2 大肠杆菌多重耐药性
临床分离的46株猪源大肠杆菌对15种抗菌药物均表现出多重耐药性，多重耐药率达到100%，至少耐药10种以上，其中10耐和11耐的菌株所占比例最大，分别为28.3%和23.9%，其次是13耐（17.4%）、12耐（15.2%）、14耐（13.0%）、15耐（2.2%），共有6种耐药谱型，最多的耐药谱为氨苄西林钠-阿莫西林-头孢曲松-恩诺沙星-乳酸环丙沙星-复方SMZ-新霉素-庆大霉素-氟苯尼考-强力霉素。
3 讨论
2016-2018两年内，通过对徐州周边猪场所分离的大肠杆菌进行耐药性监测，发现猪场大肠杆菌耐药情况不容乐观，大肠杆菌几乎对临床常用的抗菌药物都产生了耐药性，个别菌株的多重耐药性甚至达到了15耐（全部）。15种临床常用药物中，阿莫西林、氟苯尼考、强力霉素耐药比较严重，这和该地养殖场用药习惯有很大关系，既要考虑临床疗效，还要考虑成本、经口给药的适口性等因素导致这些药物在临床大量使用产生耐药性。β-内酰胺类抗生素中頭孢曲松和头孢噻呋作为三代和四代头孢的耐药率要远远小于阿莫西林和氨苄西林钠，但是两年内此类抗生素耐药率尤其是头孢类却在快速增长，充分反映出一个严峻现实，产ESBLS大肠杆菌耐菌株普遍存在并能水平传播[1]耐药性，耐药性的发展速度高于新药的研发速度。因此，在临床治疗中使用此类药物应考虑配合ESBLS抑制剂如棒酸、舒巴坦钠、他唑巴坦等来联合用药消除ESBLS大肠杆菌的耐药性，提高治疗效果[2]。氨基糖苷类药物临床多口服用于肠道感染，虽然耐药率较头孢类低，但增长速度也很快，尤其是丁胺卡那霉素和新霉素，需要警惕。氟苯尼考和强力霉素作为药效强强联合的抗生素多年来配伍应用，同样造成耐药性居高不下的局面，值得注意的是氟苯尼考耐药率虽然较高，但已开始下降，说明已有猪场认识到氟苯尼考的耐药性，开始选择性的合理使用药物。对于三种喹诺酮类药物的检测，恩诺沙星和乳酸环丙沙星耐药率普遍都在60%以上，氧氟沙星耐药率则相对较低，这说明在徐州地区恩诺沙星、乳酸环丙在临床使用较多，另外喹诺酮类药物之间存在交叉耐药性，对一种药物产生耐药性后，将会对其他同类药物产生耐药性[3]，提示在临床治疗上，当大肠杆菌对喹诺酮类药物产生耐药性后，要考虑更换其他种类的药物。复方SMZ和痢菌净两种药物疗效明显，成本低，常年大量用于临床，高耐药率应该引起重视。
在大肠杆菌的耐药率监测中，大肠杆菌对氟苯尼考、多粘菌素、乳酸环丙沙星、痢菌净的耐药率有所下降，说明这些药物临床应用有所减少，猪场在选择药物时对细菌的耐药性越来越重视，用药水平有所提高。痢菌净耐药率下降最快，这和痢菌净有一定毒性、容易有药残、绿色养殖得到重视、已被国家限制使用有关。分析结果中，耐药率最低的是头孢噻呋，这可能是头孢噻呋开发应用时间较短，较高的价格影响了其临床使用率。可从多粘菌素、氧氟沙星、氨基糖甙类等药物这几种药物中选择敏感药物进行防治猪大肠杆菌病。另外，本试验所选菌株最少都达到10耐以上，这和黄健强[4]等报道所反映的细菌多重耐药现状一致，说明耐药性的发展速度逐步加快并十分普遍，因此为了减少多重耐药性，临床用药时应掌握适应症，避免长期使用同一种药物，注意交替用药和联合用药，同时还需要加强大肠杆菌耐药机制的研究，寻找消除大肠杆菌耐药质粒和耐药酶的方法，开发出新的药物和耐药抑制剂[5]。
参考文献：
[1] 沈永恕，张春辉，荆新蕊，等.大肠埃希氏细菌中ELBLS耐药质粒的传播与消除研究[J].西北农林科技大学学报（自然科学版），2010，2，38（2）：41-46.
[2]陈志华.β-内酰胺酶抑制剂与β-内酰胺类抗生素联用在兽医学上的应用[J].广东畜牧兽医科技，2003，28（6）：17-19.
[3] 张继瑜，邓旭明，赵荣材，等.喹诺酮类药物耐药性的分子机制[J].中国兽医学报，2001，21（3）：312-316.
[4] 黄健强，南文金，胡鸿惠，等.粤北地区仔猪腹泻大肠杆菌分离鉴定及耐药性分析[J].微生物学杂志，2017，37（3）：59-64.
[5] 贺丹丹，黄良忠，陈孝洁，等.不同动物源大肠杆菌的耐药性调查[J].中国畜牧兽医，2013，40（10）：211-215.
