FOXP3基因多态性在广西壮族女性人群中的分布

    石凤 陈志鸿 庞晓霞 仇雯丽 凌永嫦 李光景 杨凤莲 王俊利

    

    

    【摘要】 目的 探讨FOXP3 单核苷酸多态性（single nucleotide polymorphisms，SNPs）在广西壮族女性人群的分布频率，并与其他人群比较分析基因遗传异质性。

    方法 运用iMLDR技术和DNA测序检测200例广西壮族女性人群中的rs2280883和rs3761549基因型和等位基因频率，并与PubMed数据库公布的千人基因组计划人群进行比较。

    结果 在广西壮族女性人群中，rs2280883主要以TT基因型（71.5%）为主，rs3761549主要以GG基因型（62.5%）为主。rs2280883基因型和等位基因与非洲人群、美国人群、欧洲人群和南亚人群分布频率差异有统计学意义（P<0.05）。rs3761549基因型与非洲人群、美国人群、欧洲人群和南亚人群分布频率差异有统计学意义（P<0.05）;rs3761549等位基因与美国人群、欧洲人群和南亚人群分布频率差异有统计学意义（P<0.05）。

    结论 在广西壮族女性人群中，FOXP3存在rs2280883和rs3761549多态性，并且与其他种族地区（非洲、美国、欧洲和南亚）存在基因遗传异质性。

    【关键词】 FOXP3;单核苷酸多态性;种族

    中图分类号：R737.9 ? 文献标志码：A ? DOI：10.3969/j.issn.1003-1383.2020.11.003

    【Abstract】 Objective To investigate the distribution frequency of FOXP3 single nucleotide polymorphism （SNP） among Zhuang women in Guangxi， and to analyze their genetic heterogeneity by comparing with ?populations from other ethnic regions.

    Methods iMLDR techniques and DNA sequencing were used to detect rs2280883 and rs3761549 genotypes and allele frequencies in 200 Zhuang women in Guangxi and compared with population of the 1000 Genomes Project published in PubMed database.

    Results Among Zhuang women in Guangxi， TT genotype （71.5%） was the main genotype of rs2280883， and GG genotype （62.5%） was the main genotype of rs3761549. The distribution frequency of rs2280883 genotypes and alleles were significantly different from those in Africa， the United States， Europe and South Asia （P < 0.05）. The distribution frequency of rs3761549 genotype was significantly different from those of population in Africa， the United States， Europe and South Asia （P < 0.05）. In addition， the distribution frequency of rs3761549 allele was significantly different from those of population in the United States， Europe and South Asia （P < 0.05）.

    Conclusion Among Zhuang women in Guangxi， FOXP3 has rs2280883 and rs3761549 polymorphisms， and there are genetic heterogeneity with other ethnic regions （Africa， the United States， Europe and South Asia）.

    【Key words】 FOXP3; SNP; ethnic

    叉头/翼状螺旋转录家族因子3 （Forkhead lineage-transcription factor， FOXP3） 定位于X染色体Xp11.23，含有11个编码外显子，属于FOX家族蛋白，特征性地表达于调节性T细胞（Regulatory T cells， Treg），参与Treg细胞的增殖、分化和成熟，控制Treg细胞的基因表达和转录。Treg細胞在免疫调节中起着重要作用，参与外周免疫耐受，调节病原体特异性免疫应答，抑制移植排斥反应，促进肿瘤免疫逃逸。FOXP3是一种多结构域蛋白，氨基酸端包含亮氨酸拉链、锌指蛋白和阻遏结构域，羧基端包含叉头DNA结合结构域，FOXP3与Treg细胞启动子区域结合，调节Treg细胞的基因表达，影响其转录水平。FOXP3对诱导和维持Treg细胞独特的免疫抑制特性至关重要[1]。FOXP3基因突变导致Treg细胞表达异常，引起自身免疫性疾病[2～3]。FOXP3可抑制乳腺癌细胞的侵袭和转移[4]，促进胃癌细胞的增殖、侵袭和迁移能力[5]。FOXP3在肿瘤细胞中发挥着促癌和抑癌作用，可能存在组织特异性。单核苷酸多态性（single nucleotide polymorphisms， SNPs）是指单个核苷酸碱基发生突变，包括碱基移码、置换、缺失和倒位。基因启动子区域发生突变会引起RNA聚合酶Ⅱ识别异常，导致基因转录水平降低，基因内含子区域突变影响mRNA的可变剪切[6]。基因突变与肿瘤疾病的发病风险密切相关。HE等[7]研究发现TERT内含子基因突变rs10069690与来自非洲人群的乳腺癌患者发病风险呈负相关（OR=0.86， 95%CI=0.75～0.97），而与来自欧洲人群的乳腺癌患者发病风险呈正相关（OR=1.19， 95%CI=1.13～1.25）。YANG等[8]研究展示UNC13A内含子多态性rs12608932增加来自美国和欧洲的肌萎缩患者的发病风险，而与来自日本和中国肌萎缩患者发病风险无关。表明SNPs位点存在人群分布特征。本研究旨在探讨FOXP3 SNPs在不同女性人群中的分布情况，为FOXP3 SNPs在不同人群中的疾病研究，尤其FOXP3 SNPs在女性肿瘤疾病中的研究提供理论基础。

    1 资料与方法

    1.1 研究对象

    随机选取2018～2019年在右江民族医学院附属医院检验科进行健康体检的正常女性共200例，年龄（37.21±12.89）岁，经问卷调查，所研究人群户籍所在地为广西地区，并长期居住于广西地区，研究群体之间无血缘关系，实验室各项检测指标均在正常范围内，既往无慢性病史、肿瘤病史，所纳入对象均未曾患有免疫性疾病。所研究人群均经受试者知情同意并签署知情同意书，该研究经右江民族医学院附属医院伦理委员会讨论批准。

    1.2 DNA提取

    清晨空腹采集志愿者全血2～5 mL于EDTA-K2+抗凝管，轻轻摇晃混匀，采用深圳亚能公司DNA提取试剂盒，按照操作说明书提取DNA，并于-70°冰箱保存待用。

    1.3 PCR引物设计及反应体系

    查阅NCBI数据库中FOXP3基因rs2280883和rs3761549的碱基序列，根据在线primer3.0软件设计FOXP3基因多态性位点的扩增引物序列，由上海天昊生物科技有限公司合成。rs2280883的上游引物为：5′-GAAGGAGTTGGGATGGGGTGAT-3′，下游引物为：5′-CCATCTCTGCACCTTGCCCTAA-3′;rs3761549上游引物为：5′-CGACACCACGGAGGAAGAGAAG-3′，下游引物为：5′-CAAACCTGGGTCCTCTCCACAA-3′。PCR反应体系包括（20 μL）： 1 μL样本DNA，0.3 mM dNTP，1 μL多重PCR引物，1 U HotStarTaq polymerase（Qiagen Inc.），2 U 3.0 mM Mg2+，1x HotStarTaq buffer，剩余体积用超纯水补至20 μL。PCR反应程序：95℃ 2 min，94℃ 20 s，65℃ 40 s，72℃ 1.5 min，共计35个循环。在10 μL PCR产物中加入2 U Exonuclease I酶和5 U SAP酶，37℃水浴1 h， 然后75℃ 灭活15 min进行多重PCR纯化。连接反应体系包括：10x连接缓冲液1 μL、纯化后多重PCR产物2 μL、5′连接引物混合液（1 μM）0.4 μL，3′连接引物混合液（2 μM）0.4 μL、高温连接酶0.25 μL、ddH2O 6 μL混匀。连接反应程序为94℃ 1 min，56℃ 4 min，共计38个循环。

    1.4 iMLDR多重SNP分型

    先采用多重PCR技术将rs2280883和rs3761549所在区段在反应体系中获得扩增产物。扩增产物经外切核酸酶及虾碱酶 （ExoI/SAP）纯化后用于后续连接酶反应的模板。在一个连接反应中，每个位点包含两个5′端等位基因特异探针以及紧挨其后的一条3′端位点的荧光标记的特异探针。通过毛细管电泳鉴别连接产物。该试验由上海天昊生物科技有限公司进行。

    1.5 不同种族人群分布频率获取

    通过千人基因组数据库，提取北京汉族女性人群、非洲女性人群、美国女性人群、日本女性人群、欧洲女性人群和南亚女性人群的基因型和等位基因分布频率。

    1.6 统计学方法

    采用SPSS 17.0统计学软件进行分析。hardy-Weinberg检测研究人群的群体遗传平衡定律。计数资料以百分率（%）表示，组间比较采用χ2检验或Fisher确切概率法，检验水准：α=0.05。

    2 结 ?果

    2.1 rs2280883和rs3761549基因分型

    在广西壮族女性健康人群中，rs2280883多态性位点存在三种基因型，分别为TT、TC和CC;rs3761549多态性位点存在三种基因型，分别为GG、GA和AA。测序图谱如图1所示。

    2.2 FOXP3 SNPs在广西壮族女性人群中的分布

    FOXP3 SNPs两位点rs2280883和rs3761549在广西壮族女性人群中的基因型和等位基因分布频率如表1所示，rs2280883的基因型TT、TC和CC分布频率分别为71.5%、25.5%和3.0%，其等位基因T和C分布频率分别占84.2%和15.8%。rs3761549的基因型GG、GA和AA分布频率分别为62.5%、33.5%和4.0%，其等位基因G和A分布頻率分别为79.2%和20.8%。两多态性位点均符合Hardy-Weinberg遗传平衡定律，表明所选群体符合孟德尔遗传平衡定律（P=0.549和P=0.793）。

    2.3 FOXP3 SNPs与其他人群的分布

    由于FOXP3定位于X染色体的特性，查询千人基因组计划不同种族人群，对数据进行二次整理，获得女性健康人群分布规律。将广西壮族女性健康人群与来自PubMed公布的千人基因组计划的其他种族女性健康人群（包括北京汉族人群、非洲人群、美国人群、日本人群、欧洲人群和南亚人群）进行基因型和等位基因分布频率比较。本研究结果显示：广西壮族女性人群rs2280883基因型和等位基因与非洲女性人群、美国女性人群、欧洲女性人群和南亚女性人群的基因型和等位基因分布频率差异有统计学意义（P0.05）。广西壮族女性人群rs3761549基因型分布频率与非洲女性人群、美国女性人群、欧洲女性人群和南亚女性人群差异有统计学意义 （P0.05）;广西壮族女性人群rs3761549等位基因分布频率与美国女性人群、欧洲女性人群和南亚女性人群差异有统计学意义，而与中国北京汉族女性人群、非洲女性人群和日本女性人群差异无统计学意义（P>0.05）。见表2，表3。

    3 讨 ?论

    Treg细胞是肿瘤微环境中免疫逃逸和免疫监测的重要参与者，FOXP3作为Treg细胞的显著特征因子，参与自身免疫耐受及肿瘤发病机制。基因多态性是遗传变异的主要类型，LOU等[9]发现rs2280883增加中国汉族人群大肠癌的患病风险。JIANG等[10]进行Meta分析表明rs3761548和rs3761549 SNP与亚洲人群乳腺癌发病风险无关，而分别增加非小细胞肺癌和降低肝细胞癌的发病风险。CHEN等[11] Meta分析研究发现携带FOXP3 SNPs rs3761548的AA基因型和A等位基因与中国人群患癌风险增加有关，而与总体人群无关，表明该多态性位点可能存在种族遗传差异。因此，本研究进一步探讨FOXP3 rs2280883和rs3761549位点在种族人群中的差异，为以往关于FOXP3 SNPs在同一疾病不同种族人群的研究结论不一致提供合理解释，并为日后研究的人群样本选择提供理论依据。

    本研究结果表明，在广西壮族女性人群中，rs2280883存在TT、TC和CC三种基因型，分布频率分别为71.5%、25.5%和3.0%，其两等位基因T和C分布频率分别为84.2%和15.8%;rs3761549存在GG、GA和AA三种基因型，分布频率分别为62.5%、33.5%和4.0%，其两等位基因G和A分布频率分别为79.2%和20.8%，两基因多态性位点基因型均符合孟德尔遗传平衡定律。将本研究的广西壮族女性人群与来自千人基因组计划中的其他种族的女性人群进行比较，包括中国北京人群、非洲人群、美国人群、日本人群、欧洲人群和南亚人群，结果显示：广西壮族女性人群rs2280883基因型和等位基因与来自北京汉族女性人群和日本女性人群差异无统计学意义，而与非洲女性人群、美国女性人群、欧洲女性人群和南亚女性人群的基因型和等位基因分布频率差异有统计学意义。广西壮族女性人群rs3761549基因型分布频率与中国北京汉族女性人群和日本女性人群差异无统计学意义，而与非洲女性人群、美国女性人群、欧洲女性人群和南亚女性人群差异有统计学意义;广西壮族女性人群rs3761549等位基因分布频率与中国北京汉族女性人群、非洲女性人群和日本女性人群差异无统计学意义，而与美国女性人群、欧洲女性人群和南亚女性人群差异有统计学意义。LI等[12]发现rs3761548和rs3761549 SNP增加亚洲人群甲状腺功能亢進的风险，但与白高加索人群的甲亢疾病风险无关，表明rs3761549存在基因遗传异质性，与本研究结论一致。日本国家与中国国家的地理位置相毗邻，生活习性、环境以及通婚状况越发普遍，可能是rs2280883和rs3761549基因型和等位基因与中国北京人群和日本人群差异不大的原因之一。

    综上所述，FOXP3基因多态性位点rs2280883和rs3761549在不同人群中的分布差异有统计学意义。广西与云南和越南毗邻，少数民族较多，经济发展水平较北京和其他国家相对落后，是多种遗传性疾病的高发地区，如鼻咽癌和地中海贫血。本研究探讨基因多态性在不同人群中的分布频率，为日后研究基因多态性与疾病的相关性提供理论基础，也为选择研究人群多元化的必要性提供理论依据。但本研究存在两点不足：第一，广西作为一个少数民族地区，本次研究均为广西壮族女性人群，未纳入其他少数民族进行分层分析;第二，本研究样本例数相对较少，研究人群均基于医院选择，可能存在样本选择偏倚。因此，在本研究基础上，本课题组将进一步跨区域选择样本研究该两个基因多态性位点与疾病的关系并进行种族分层分析。

    参 考 文 献

    [1] ?HUEHN J， BEYER M.Epigenetic and transcriptional control of Foxp3+regulatory T cells[J]. Semin Immunol， 2015， 27（1）： 10-18.

    [2] ?HASHEMI V， FARROKHI A S， TANOMAND A， et al. Polymorphism of Foxp3 gene affects the frequency of regulatory T cells and disease activity in patients with rheumatoid arthritis in Iranian population[J]. Immunol Lett， 2018， 204： 16-22.

    [3] ?ZHANG Y， ZHANG J， LIU H， et al. Meta-analysis of FOXP3 gene rs3761548 and rs2232365 polymorphism and multiple sclerosis susceptibility[J]. Medicine （Madr）， 2019， 98（38）： e17224.

    [4] ?ZHANG C， XU Y， HAO Q， et al. FOXP3 suppresses breast cancer metastasis through downregulation of CD44[J]. Int J Cancer， 2015， 137（6）：1279-1290.

    [5] ?ZHANG L， XU J， ZHANG X， et al. The role of tumoral FOXP3 on cell proliferation， migration， and invasion in gastric cancer[J]. Cell Physiol Biochem， 2017， 42（5）： 1739-1754.

    [6] ?MUCAKI E J， SHIRLEY B C， ROGAN P K. Expression changes confirm genomic variants predicted to result in allele-specific， alternative mRNA splicing[J]. bioRxiv， 2020， 11：109.