四种常用化学消毒剂对猪2型圆环病毒杀灭效果研究

    储玉双 李红英 黄小红

    摘要：试验应用复合碘制剂、2%戊二醛消毒液、优氯净消毒粉（二氯异氰尿酸钠）、苯扎溴铵四种常用的化学消毒剂对猪2型圆环病毒杀灭效果进行研究，采用病毒滴定、中和剂鉴定及病毒灭活试验进行检测。结果表明，二氯异氰尿酸钠的杀灭效果最好，其次是戊二醛，复合碘制剂也有一定的杀毒作用，苯扎溴铵消毒液的杀灭效果最差，建议将二氯异氰尿酸钠和戊二醛作为控制猪2型圆环病毒的消毒剂，可有效防止猪2型圆环病毒的传播。

    关键词：化学消毒剂;猪2型圆环病毒;杀灭效果

    中图分类号：S858.28? ? ? ? 文献标识码：A? ? ? ? 文章编号：1007-273X（2018）12-0005-02

    猪圆环病毒（PCV）按照致病性的有无分为1型和2型，PCV1被认为不具备致病性，具有致病性的

    PCV2被认为同猪断奶后多系统衰竭综合征（PMWS）等疫病有关[1]。猪圆环病毒是无囊膜病毒，也称裸病毒，是目前发现的动物疾病中最小的病毒，通常裸病毒很难消灭，所以一定要使用有效消毒剂才能杀灭裸病毒。对该类病毒，许多消毒剂如酚制剂、阳离子表面活性剂、季铵盐类等的使用效果不理想或没有效果。目前市场上真正称得上是广谱高效消毒剂的有碘制剂、甲醛、戊二醛及二氯异氰尿酸钠（DCCNa）等，能够杀灭各种细菌、芽孢、真菌、囊膜病毒和非囊膜病毒等，试验选择复合碘制剂、2%戊二醛消毒液、优氯净消毒粉（二氯异氰尿酸钠，DCCNa）、苯扎溴铵四种消毒剂来杀灭猪2型圆环病毒，比较其消毒效果，旨在为猪2型圆环病毒的预防提供参考。

    1? 材料与方法

    1.1? 毒株与细胞

    猪圆环病毒2型（PCV2）由江西农业大学实验室分离鉴定、保存和提供。不含PCV1和PCV2的猪肾细胞PK（15）由本实验室培养传代保存。

    1.2? 主要试剂

    复合碘制剂、戊二醛消毒液、优氯净消毒粉（5%二氯异氰尿酸钠）、苯扎溴铵四种消毒剂购买自江西汇康实业有限公司。甘氨酸为河南特康生物科技有限公司，吐温80为Sigma产品，细胞培养试剂中DMEM培养基购自Sigma公司。无菌胎牛血清购自杭州四季青生物工程材料有限公司。复合碘制剂和优氯净消毒粉（5%二氯异氰尿酸钠）的中和剂为0.1 mol/L硫代硫酸钠的磷酸盐缓冲溶液（PBS）;戊二醛消毒液的中和剂为0.3%吐温80+0.1%甘氨酸的PBS;苯扎溴铵为季铵盐类消毒剂，它的中和剂为卵磷脂+吐温80+组氨酸[2]。

    1.3? 主要仪器

    电热恒温水浴锅，芬兰百得实验室仪器（中国）有限公司;超净工作台，苏净集团安泰公司;振荡培养箱，广东医疗器械厂;培养箱，广东医疗器械厂;电子天平，YP202N型，上海精密科学仪器有限公司;96孔培养板。

    1.4? 方法

    1.4.1? 病毒滴定的方法? 将PCV2病毒株用细胞维持液（1%血清的DMEM培养基）进行10倍系列稀释（101～106），分别接种于PK（15）细胞（96孔培养板）中，每个稀释度接种8孔，置于37 ℃、50% CO2培养箱中培养，每日观察细胞病变的结果，连续观察3 d，按Reed-Muench法计算该病毒的半数细胞感染剂量（TCID50）[3]，每次试验重复3次，计算标准差。

    1.4.2? 中和剂鉴定试验? 试验共分为6组，第1-3组为中和剂，后3组为阴性对照，分别为细胞维持液、标准硬水、PBS，混匀接种3～4 h后观察细胞生长情况。

    1.4.3? 病毒灭活试验? 用标准硬水将消毒剂按待测浓度的1.5倍稀释成试验用的消毒剂，将0.5 mL待测消毒剂置（20±1） ℃水浴30 min，再吸加0.5 mL各病毒悬液，混匀。待作用至试验规定的灭活病毒时间（5、10、20 min），立即取出0.1 mL，加入含0.9 mL中和剂混匀，作用10 min，作系列稀释后，吸取样液，接种于单层细胞培养板上，每个滴度接种4孔;阳性对照组，用0.6 mL无菌去离子水代替消毒剂，将细胞培养板置37 ℃二氧化碳培养箱中，吸附1～2 h后，将细胞培养板内液体弃去，在板内加入细胞维持液，37 ℃二氧化碳孵箱培养5 d，分别测定不同浓度消毒剂、不同作用时间对PCV2的杀灭效果，试验重复3次。

    1.4.4? 猪圆环病毒耐药性试验? 将400 mg/L复合碘溶液、250 mg/L戊二醛消毒液、150 mg/L有效氯的复方二氯异氰尿酸钠及 40 g/L的苯扎溴铵溶液间隔30、90、120 d使用，分组别长期作用猪圆环病毒，对兔进行静脉注射，判断各组别的猪圆环病毒耐药性产生的时间及变化情况。

    2? 結果与分析

    2.1? 中和剂对PK（15）细胞生长状况的影响

    中和剂对PK（15）细胞生长状况的影响见图1。由图1可知，各中和剂没有影响细胞的生长，与对照组相当，表明选用的中和剂及形成的中和产物对PK（15）细胞无毒害作用。

    2.2? 四种消毒剂对PCV2的杀灭效果

    结果表明，以含400 mg/L复合碘溶液对猪圆环病毒作用5 min，灭活率为100%;以200 mg/L复合碘溶液作用10 min，灭活率为99.99%（表1）。

    250 mg/L戊二醛消毒液、150 mg/L DCCNa及40 g/L的苯扎溴铵溶液与猪圆环病毒作用5 min，灭活率均可达到100%（表2、表3、表4）。

    2.3? PCV2耐药性

    猪圆环病毒耐药性研究结果表明，250 mg/L戊二醛和150 mg/L DCCNa抗毒性强，体温无变化，120 d未产生耐药性;400 mg/L复合碘有一定的抗毒性，120 d使用较易产生耐药性;40 g/L的苯扎溴铵抗毒差，120 d使用更易产生耐药性（表5）。

    3? 小结

    四种常用消毒剂在相同的浓度和试验条件下（温度、相对湿度、酸碱度等）杀灭猪圆环病毒，以DCCNa的杀灭效果最好，其次是戊二醛，复合碘制剂也有一定的杀灭作用，苯扎溴铵消毒液的杀灭效果最差。四种消毒剂的消毒效果与文献报道相一致[4]，建议将DCCNa和戊二醛作为控制猪圆环病毒的消毒剂。该方法与秦涛等[5]的研究方法近似，結果满意。

    中和剂鉴定试验表明，四种中和剂安全可靠，无毒副作用，中和剂对PCV2在PK（15）细胞中的增殖无显著抑制作用。文献研究表明决定中和剂选择结果好坏的关键不在于试验病毒 ，而在其宿主培养细胞， 即能否选出对试验细胞无毒或毒性较小的中和剂和中和产物[6]。

    PCV2耐药性研究结果表明，戊二醛和DCCNa抗毒性强，复合碘有一定的抗毒性，苯扎溴铵抗毒性差。该结果与秦秀慧等[7]的戊二醛复合消毒剂对猪病病毒杀灭效果的研究结果相一致。经查询文献资料，关于消毒剂对猪圆环病毒消毒效果及耐药性的研究较少，本研究可为养猪场预防疾病及消毒剂选择提供参考。

    参考文献：

    [1] 司兴奎，郭? 鑫，杨汉春.猪圆环病毒2型感染后血清抗体及组织中病毒含量的动态变化[J].中国兽医杂志，2009，45（7）：24-26.

    [2] 韩? 杰，魏秋华.化学消毒剂的中和剂的研究现状[J].中国消毒杂志，2013，30（12）：1165-1168.

    [3] REED L J，MUENCH H.A simple method of estimating fifty percent endpoints[J].American Journal of Hygiene，1938，27：493-497.

    [4] 杨满军.9种商业消毒剂对猪2型圆环病毒的杀灭效能测试[J].今日养猪业，2009（3）：13-16.

    [5] 秦? 涛，汪川韦，石宝兰，等.四种常用消毒剂对H5N6亚型禽流感病毒灭活效果的研究[J].中国兽医科学，2018，48（9）：1139-1145.

    [6] 薄玉霞，SYED A S .评价化学消毒剂对病毒灭活效果的中和剂选择试验[J].中国消毒学杂志，2007，24（6）：523-524.

    [7] 秦秀慧，张? 冰，李? 军，等.戊二醛复合消毒剂对猪病病毒杀灭效果的研究[J].中国实验动物学报，2002，10（2）：117-119.