离子选择性电极在脑神经化学活体分析中的研究进展

    赵丽君　郑卫　毛兰群

    

    

    

    摘?要?脑功能的实现需要多种离子的共同参与，因此，在活体层次实时监测脑内离子的动态变化，对于理解许多生理病理事件具有重要意义。离子选择性电极作为一类电化学传感器，具有成本低、操作简单、能耗低等特点，被广泛应用于活体分析等领域。本文以离子选择性电极的发展历程为主线，主要对其基本构造及其在脑神经化学活体分析領域的应用进行了评述。

    关键词?离子选择性电极; 活体分析; 脑神经化学; 评述

    1?引 言

    脑内信息传递及与脑神经相关的各种生理病理过程都有化学物质参与，而脑内的各种离子（如H+、Na+、Mg2+、Ca2+等）对维持中枢神经系统（CNS）的正常生理功能发挥了重要作用[1～10]。例如，脑内H+与细胞生长与凋亡、酶的活性、信号转导和离子传输等密切相关[1，2]。K+对于维持细胞正常的渗透压、保持细胞正常的形态具有重要作用; 同时，还直接参与神经信号的传导过程[3，4]。Ca2+是参与基因表达、神经递质释放、突触形成和突触传导等生理活动的重要信号转导元素; 并且，作为第二信使，Ca2+参与了调节肌肉收缩、激素分泌、神经递质释放、细胞代谢和细胞凋亡等[5～9]。由此可见，脑内离子的浓度必须维持在一定的稳态范围内才能实现正常的脑神经活动，任何离子浓度的失衡都会对神经系统造成严重的影响[9，11～14]。因此，建立脑内离子动态变化的活体实时分析方法，对于了解脑神经活动的基本过程和神经系统性疾病（如帕金森症、阿兹海默症、脑缺血等）的发病机制、探索生命活动的化学本质具有重要意义[4，5，9，15]。早在1968年，Bradbury等[16]就利用火焰原子吸收分光光度法，实现了对脑内Ca2+和Mg2+的检测。随着分析方法的不断发展，目前离子的检测方法主要有原子吸收光谱法、电感耦合等离子体质谱法、核磁共振和荧光成像等[17～21]，然而这些分析方法无法满足在活体动物水平上进行离子浓度的在线实时检测的要求[22，23]。与上述方法相比，电化学方法具有仪器设备简单、操作方便，且可以通过灵活设计电化学界面来实现选择性和稳定性等优点[24，25]。离子选择性电极（Ion?selective electrode，ISE）作为一类电化学传感器，具有体积小、携带方便、能耗低、成本低等特点，因此被广泛应用于生命科学、环境监测和过程控制等领域[26， 27]。此外，使用ISE进行检测时无需对复杂样品进行预处理，能够实现样品的连续检测，因此在活体分析领域得到了迅速发展。本文对液体接触式ISE和固态ISE在活体分析领域的应用进行了综述。

    2?液体接触式ISE在脑神经化学中的应用

    传统的ISE通常称为液体接触式离子选择性电极，它主要是由敏感膜、内参比溶液、内参比电极和惰性腔体组成。其中，敏感膜是ISE的核心，它能将待测离子的活度转化为可测量的电位值。敏感膜的种类较多，从最早的玻璃膜、卤化银薄膜，逐渐发展到聚合物敏感膜。目前，聚合物膜敏感膜的主要成分是离子载体、离子交换剂、增塑剂和聚合物基体材料。其中，离子载体是敏感膜的重要组成部分，它可与待测离子键合形成配合物，从而实现对待测离子的选择性分析; 离子交换剂主要是亲脂性盐，其作用是促进离子的交换过程，降低带相反电荷的离子对检测结果的干扰; 增塑剂能够增强敏感膜的塑性; 聚合物基体用于保证敏感膜具有良好的机械稳定性。Ag/AgCl电极通常用作ISE的内参比电极。

    将液接式ISE插入到含有待测离子的溶液中，由于离子敏感膜只允许待测离子通过，这使得敏感膜内外两侧的离子活度不同，因此待测离子会由高浓度向低浓度扩散，导致敏感膜内外两侧电荷分布不均，产生界面电势，即为ISE的电极电位。ISE的电极电位与溶液中待测离子的活度遵守能斯特方程：

    =φ0+RTzLFlnaL（1）

    其中， φ为电极电位， φ0为标准电极电位，aL为待测离子活度，zL为待测离子的带电荷数，R为气体常数，T为绝对温度，F为法拉第常数。当aL=1时，可以得到电极的标准电极电位φ0。当工作电极和参比电极在溶液中组成原电池时，所测原电池的电动势为：

    E=E0+SlnaI（2）

    其中，E为测得的电动势; 当aL=1时，得到电极的标准电动势E0; S是响应斜率，在理想情况下S=2.3026RT/F。在25℃时，S=59.18/zL。

    ISE不受待测样品溶液悬浮物、浑浊度、颜色等因素的影响，且无需样品分离，因此可直接进行原液或原位的分析。自1959年Hinke等[28]首次将微管电极用于细胞内离子活度的测量以来，基于玻璃管的离子选择性微电极（Ion?selective microelectrode， ISME）得到了越来越广泛的应用，特别是在生命科学领域。该类ISME尖端的尺寸可以小到105～106m。在测量时，通常采用两根玻璃管电极，一根为ISE，尖端填充敏感膜，管内填充内充液，作为指示电极（图1A）[29]， 另一根作为参比电极; 或者直接采用将ISME和参比电极整合在一起的双管微电极（Double?barreled microelectrode， 图1B）[30]; 甚至是可实现两种离子同时检测的三管微电极（Three?barreled microelectrode， 图1C）[31]。

    2.1?脑片层次

    脑内相关神经生理病理过程的研究主要是基于细胞层次、脑片层次和活体层次展开的。其中，细胞层次的研究主要是对相应生理病理模型的神经细胞进行离体培养，然后再以单独的神经细胞为研究对象，对其进行生物及化学性质的分析。在进行离体培养的体外研究时，神经细胞由于脱离了细胞赖以生存的环境，阻断了神经细胞与其它细胞之间的相互联系，因此获得的研究结果无法还原脑内真实的神经生理病理过程。而脑片层次的研究能够在一定程度上解决细胞层次研究的局限性，因为单个脑片中包含了研究对象的基本微环境，能够在一定程度上保留不同细胞之间的神经连接，保证了大脑神经功能的完整性，因此在脑片层次开展脑内离子的研究能够更加准确的反映出神经生理病理过程的真实情况。

    早在1980年，Benninger等[32]就开始利用两根双管ISME检测了海马脑切片CA1区在顺行电刺激下的离子浓度变化，所使用的电极由两根θ管分别拉制而成（图2），电极尖端直径为2～4 μm，K+和Ca2+敏感膜分别采用K+交换树脂和Ca2+中性载体，发现海马切片中K+和Ca2+浓度的变化与在体内刺激下获得的结果相似，该结果对于研究相关离子在脑内微环境中变化的机制和影响具有潜在的应用价值。1983年，Yaari等[33]通过降低大鼠海马脑切片中的Ca2+浓度来诱导CA1区中的自发癫痫，利用两根双管ISME发现癫痫发作期间细胞外Na+浓度降低和K+浓度升高。1987年，Hablitz等[34]用两根双管ISME在大鼠新皮质切片上进一步研究了癫痫发作期间细胞外K+和Ca2+的变化。Sick等[35]采用双管ISME研究了缺氧状态下海马脑切片细胞外K+浓度的变化与神经元兴奋性的关系。1990年，Mcbain等[36]利用ISME实时测量了四甲基铵根离子（TMA+）在海马脑切片不同脑区中的扩散情况，并通过扩散方程进行拟合计算得到了细胞外体积分数（EVF），发现CA1区锥体细胞层EVF为0.12，而CA3区的锥体细胞层和颗粒细胞层的EVF分别为0.18和0.15。而且，当海马脑切片细胞外K+的浓度从3.5 mmol/L升高至8.5 mmol/L时，CA1区的EVF可逆地减少了30%，这主要是由于K+浓度的升高，诱导了CA1区中的自发性癫痫。这些结果表明，海马脑区不同亚区的细胞外间隙存在差异，这可能是海马脑区的CA1区在病理条件下更容易遭受损伤的原因。1993年，Leschinger等[37]采用K+浓度升高和Mg2+、Ca2+浓度降低來诱导癫痫发作，利用双管ISME研究了癫痫发作期间的场电位和细胞外离子浓度的变化。2000年，Holthoff等[38]用ISME研究了电刺激引起的新大脑皮层脑片细胞外间隙和K+浓度的变化，进一步揭示了皮层脑组织的细胞外间隙缓冲机制。由此可见，在脑片层次利用ISME可以实现细胞周围或完整组织细胞外一种或多种离子的同时检测，并可结合电生理和膜片钳等技术，揭示生理病理条件下离子变化机制以及与神经元之间的相互关系。

    2.2?活体层次

    在脑片层次上开展的与离子相关的研究虽然取得了很多成果，但是由于脑片不能进行长时间培养，因此无法进行长期生理病理过程的研究; 并且在动物死亡过程中细胞也会发生一系列的变化，如细胞膜通透性的改变使得细胞会发生一定程度的水肿。因此，脑片层次上的研究结果不能完全揭示神经系统发生的变化。为了能够真实地反映出神经系统在各种生理病理过程中对外界刺激的响应，更多的研究者开始在活体层次上开展脑内神经化学物质的研究，这也将使我们可以同时结合行为学研究去更好地认识神经生理病理过程。目前采用ISME开展的针对脑神经化学活体分析的研究主要集中在酸中毒、低血糖症、癫痫、电刺激、SD和缺血以及物质干预等病理模型引起的离子的变化等方面。

    2.2.1?酸中毒?1975年， Heuser等[39]通过两根ISME连续记录了猫大脑皮层细胞外pH值和K+浓度的变化。当静脉注射乙酰唑胺引起脑酸中毒大概10 min后，大脑皮层细胞外pH值下降至0.203±0.0046（n=8），但在该过程中并未发现细胞外K+浓度的变化。该结果与Severinghaus等[40]的观点相吻合，即碳酸性酸中毒是由乙酰唑胺对脑组织的直接作用引起的。

    2.2.2?低血糖症?Astrup等[41]在1976年使用双微管ISME（尖端直径1～2 μm）研究了大鼠发生严重低血糖时大脑皮层细胞外的K+浓度变化，发现低血糖引起的脑缺氧会导致大脑皮层中细胞外K+浓度显著快速增加，表明K+释放到了细胞外。1984年，Harris等[42]利用三管ISME研究了胰岛素诱导的低血糖症中细胞外Ca2+与K+浓度的变化趋势以及不稳定化合物三磷酸腺苷（ATP）和磷酸肌酸（PCr）的浓度变化与能量负荷（EC）之间的关系。

    2.2.3?癫痫?1977年，Heinemann等[43]用ISME对猫大脑皮层阵发性活动（电刺激或癫痫）中体感皮层细胞外aCa和aK进行了研究，发现重复电刺激对侧前爪、丘脑腹外侧核和皮层表面时可同时引起aCa的下降和aK的增加，而在癫痫发作期间aCa显著下降（下降最多可达0.7 mmol/L），而且aCa的下降发生在阵发性放电和aK升高之前。1985年，Siesjo等[44]用ISME研究了癫痫发作和停止后恢复期间大脑皮层细胞内外pH值的变化。

    2.2.4?电刺激、SD和缺血?扩散性抑制（Spreading depression， SD）是一种脑内神经细胞去极化后神经活动受到抑制的现象，该过程伴随离子的重新分布、神经元的肿胀以及神经元和胶质细胞活动的抑制[45～47]。1977年，Nicholson等[48]对大鼠小脑平行纤维?浦肯野细胞回路进行反复电刺激时，用双管ISME研究了其细胞外Ca2+和K+的浓度变化，发现在该过程中细胞外Ca2+浓度下降到基线浓度的80%左右，K+浓度增加。而在SD过程中和缺氧末期，细胞外Ca2+浓度下降到基线的10%左右。但是，在SD和缺氧过程中，细胞外K+浓度均显著增加。这些结果表明， 在神经元活动期间，Ca2+浓度会发生变化，并且在SD和缺氧病理模型下Ca2+浓度变化可能是极端的。由于低浓度的Ca2+和K+会影响神经元集合的能力，如细胞外Ca2+浓度的减少会提高轴突的兴奋性、减少化学突触传递，因此，他们认为脑细胞外微环境中Ca2+浓度的变化可能是神经元整体行为的重要参数。

    Kraig等[49]在1978年利用ISME测定了SD过程中鲶鱼小脑细胞外K+、Ca2+、Na+和Cl的浓度变化。他们发现在SD过程中，细胞外K+的浓度从静息水平的2.3 mmol/L开始上升，大约在K+浓度上升后的20～40 s内（K+浓度超过10 mmol/L时），Ca2+、Na+和Cl的浓度才开始下降。在SD最强烈时，K+上升至35 mmol/L， Ca2+浓度降至0.8 mmol/L（基础值为2.2 mmol/L），Na+浓度57 mmol/L（基础值为149 mmol/L），Cl浓度降至47 mmol/L（基础值为137 mmol/L）; 这些结果表明了SD过程中细胞外主要离子浓度变化的幅度和时间顺序。1981年，Hansen等[50]用ISME比较了大鼠在SD和缺血两种情况下大脑皮层间隙离子浓度的变化。在SD和缺血的最初阶段，他们观察到细胞外K+浓度从3 mmol/L增加到约10 mmol/L， 但其它离子的浓度的变化很小。随着SD和缺血时间的延长，K+浓度在2～3 s的时间内快速增加至55 mmol/L，而此时Na+、Cl和Ca2+的浓度则分别下降至60、75和0.08 mmol/L，同时，这些变化还伴随着局部电势的迅速负移。然而，在SD和缺血两种生理过程中，离子的变化还是存在一些差异。一方面，在SD发生的5～10 s内，K+的浓度开始增大，而缺血持续1～2 min后才开始出现K+浓度的增大。另一方面，各离子浓度的扰动在SD结束后均恢复正常，但在缺血结束后，离子浓度的失衡会持续一段时间，在5 min后K+ 浓度变为75 mmol/L，Na+为50 mmol/L，Cl为72 mmol/L，Ca2+为0.06 mmol/L。 这些结果表明在SD和缺血期间离子浓度的变化可能与细胞的离子通透性有关。

    1978年，Nicholson等[51]采用两根双管ISME同时检测了猫小脑皮层细胞外微环境中Ca2+和K+浓度的变化。当给予小脑皮层30 s的局部电刺激时，该脑区的Ca2+浓度从基线的1.2 mmol/L降至0.8 mmol/L，K+浓度从3 mmol/L增加至8 mmol/L，并且离子浓度的变化幅度与刺激的频率直接相关。同样地，Hansen等[52]利用ISME对大鼠皮层缺血和皮层SD时细胞外间隙的体积变化进行了研究。采用含有标记物的50 mmol/L胆碱或50 mmol/L三甲基?三?（羟甲基）?甲基铵离子（N?TRIS）的等渗人工脑脊液冲洗皮层表面，并通过双管ISME监测它们在大脑皮层细胞外的浓度变化。由于这两种物质都具有较低的细胞渗透性，因此其浓度的变化反映了细胞外间隙的体积变化。该研究发现在SD和缺血期间，细胞外间隙体积收缩为初始体值的50%左右。

    1980年，Krnjevic等[53]通过ISME记录了电刺激海马伞部和内嗅区时海马CA3脑区不同深度的细胞外K+和Ca2+活度（aK、aCa）的变化，发现在锥体细胞层中aK和aCa变化最大。而且，当施加10 Hz的刺激时，aK在CA3脑区较宽的深度范围内都出现了不同程度的升高; 而aCa则仅在锥体细胞层中出现了明顯下降，他们认为大量Ca2+流入锥体细胞层可能与海马功能的“可塑性”有关。

    Ekholm等[54]在1993年探讨了短暂性脑缺血过程中能量恢复与Na+/K+转运之间的关系，其中Na+/K+转运是通过ISME测定的细胞外K+的浓度变化来反映的。1984年，Mutch等[55]利用双管ISME研究了SD和全脑缺血过程中大鼠顶叶皮层细胞外pH的变化。Moghaddam等[56]采用ISME测定了SD和缺氧时纹状体脑区细胞外K+浓度，同时用碳纤维微电极测定脑内多巴胺的浓度。在SD过程中，随着K+浓度的急剧升高产生了多巴胺的释放，而在缺氧状态下，多巴胺的释放则明显先于细胞外K+浓度的快速上升。这表明，虽然SD和缺血过程中纹状体脑区内存在明显的多巴胺释放，但在这两种生理过程中，K+浓度升高与多巴胺释放的先后顺序是不同的，这可能是由不同的机制造成的。Silver等[57]采用ISME对大鼠脑缺血缺氧时细胞内外游离Ca2+浓度的变化进行了研究。Nedergaard等[58]采用ISME研究了大鼠局灶性缺血模型中细胞内和细胞外pH值之间的关系。

    2.2.5?物质干预?Zhang等[59]用ISME研究了地佐环平（MK?801）对重度低血糖患者脑细胞aK和aCa的影响。Young等[60]用ISME研究了猫实验性脊髓损伤时大剂量皮质类固醇对血液量、诱发电位和细胞外Ca2+浓度的影响， 采用大剂量皮质类固醇进行治疗对实验性脊髓损伤血流量、诱发电位和细胞外Ca2+浓度的影响。Heinemann等[61]用ISME检测了兴奋性和抑制性氨基酸电渗作用引起的猫感觉运动皮层细胞外Ca2+的浓度变化。Pumain等[62]用ISME研究了兴奋性氨基酸诱导的大鼠运动皮层中的离子浓度变化。

    由于ISE使用方法简单，数据容易处理，仪器设备操作简单，响应时间较快（在0.1 s到几秒之间），因此非常适合用于活体脑内离子的检测。并且，在活体层次利用ISME开展的研究非常有利于探索生理病理条件下离子的变化及其与其他物质或神经元放电等的相互关系，这对于理解疾病的发病机制非常重要， 对于疾病的预防和治疗具有指导作用。

    3?固态离子选择性电极的发展及在活体分析中的应用

    虽然液体接触式ISE在单细胞和活体分析方面得到了广泛地应用，但仍然存在一定的局限性。液体接触式ISE含有将敏感膜与内参比电极分开的内部填充溶液（通常称为内充液），因此液体接触式ISE对内充液的蒸发、样品温度和压强的变化非常敏感[27，63]。此外，样品和内充液之间存在离子强度的差异，由此产生的渗透压会导致水流入或流出内充液，从而引起内充液较大的体积变化，导致ISE敏感膜的分层和灵敏度的降低[27]。因此，液体接触式ISE需要良好的维护，如定期更换内充液。此外，将内充液的体积降低到远低于毫升水平是比较困难的，这就限制了传感器的微型化[64]。尽管目前由玻璃微米管制备的有效面积小于100 nm的液体接触式ISE已经得到了广泛应用，但由于其具有较大的电阻，使得检测过程噪音增加、响应速率降低[65]，从而限制了液体接触式ISE的发展和应用。固态ISE（solid?state ion?selective electrode，SS?ISE）可以通过在敏感膜和导电基底之间形成固体接触来消除液体接触式ISE内充液的影响。1970年， Hirata等[66]提出了一种全固态Cu2+的ISE（Cu2+ISE），该电极是将Cu2S浸渍的敏感膜直接滴涂在铂丝上构成。随后，Cattrall等[67]用涂有Ca2+掺杂聚合物膜的铂丝构建了第一个包含离子载体的涂丝电极（即覆丝电极，Coated?wire electrode， CWE），该电极通常被认为是最早的SS?ISE。

    为了探索SS?ISE在活体分析中的应用，Hao等[23]以碳纤维电极为基底电极，以氢离子敏感膜为识别元件，设计并制备了微型化的氢离子SS?ISE（H+?ISE），制备的H+?ISE在较窄的生理pH范围内（pH 6.0～8.0）对溶液pH值的变化表现出良好的响应和可逆性，并且不受中枢神经系统中内源性物质的干扰。更重要的是，H+敏感膜无论是在体外 BSA 溶液中，还是在鼠脑内，都表现出了良好的抗蛋白吸附性能，这使得鼠脑内pH值的检测具有很好的可靠性。因此，利用该H+?ISE发展了一种电位分析方法，实时监测了酸碱紊乱模型下大鼠杏仁核脑区pH值的变化（图3）。

    尽管这类电极制备简单，但是其电位稳定性却很难与液体接触式ISE相媲美。这是由于CWE是将敏感膜直接修饰在导电基底上形成的，由于敏感膜是离子导电的，而导电基底是电子导电的，因此在敏感膜和导电基底之间会形成“block”界面，阻碍了敏感膜与导电基底之间离子与电子的相互转导，从而产生了一个纯电容界面[27， 68]。为了提高 CWE 的电位稳定性，需要在 ISM 与金属基底之间引入固态转导层，用于离子与电子的可逆转导。正如Nikolskii等[69]总结的，为了得到电位稳定且可靠的SS?ISEs，转导层必须具备以下3个条件：（1）可逆的离子?电子相互转导; （2）具有较高交换电流密度的理想非极化界面; （3）没有副反应。目前， 最常用的中间转导层主要是导电聚合物、碳纳米材料和金属纳米颗粒等[27，70～75]。

    目前， SS?ISE的离子?电子的转导机制主要有两种[27，75]。一种是在转导层和敏感膜之间形成类似于不对称电容器的双电层电容[27，75～77]，如图4A所示，一侧是离子（敏感膜中的阴离子和阳离子），另一侧是电荷（转导层中的电子或空穴），在敏感膜和转导层之间的界面电容依赖于双电层的电荷量。转导层主要是碳纳米材料和金属纳米颗粒[27，75]。另一种是基于转导层的氧化还原反应提供的可逆离子?电子的转导[27，75，78]，转导层的氧化还原反应涉及到了待测离子或者其疏水的对离子，如图4B所示。该类氧化还原反应包括掺杂小阴离子或者大电解质的导电聚合物，掺杂物质的含量由氧化还原电容和聚合物的导电性控制。导电聚合物既可以被氧化， 又可以被还原，使得它具有氧化还原的缓冲能力。这种类型的转导层通常是导电聚合物，如聚吡咯（PPy）、聚苯胺（PANI）、聚3?辛基噻吩（POT）和聚（3，4?乙烯二氧噻吩）（PEDOT）等[27，75]。

    在SS?ISE应用过程中，研究人员发现SS?ISE仍面临着一个关键问题：导电基底/ISM界面水层的存在[27，63]使得SS?ISE对渗透压的变化非常敏感，而且不可避免地会发生电位漂移。为了提高电位的稳定性，必须采取有效措施防止形成水层。目前，将疏水的纳米材料引入转导层是阻止水层形成的有效方法，最常用材料主要是碳材料，如碳纳米管、炭黑、三维多孔碳、石墨烯、富勒烯、胶体印迹多孔碳和多孔碳球等[27，63]。Zhao等[5]以空心碳纳米球（Hollow carbon nanospheres， HCNs）作为转导层构建了固态Ca2+ISE，发现无转导层的Ca2+ISE电位漂移为2.2 mV/h，而HCNs作为转导层改善了SS?ISE电位的长期稳定性（0.020 mV/h）。他们用内部结构为3层的HCNs作为转导层构建了微型化的Ca2+ISE，并将该电极用于电刺激引起的SD过程中细胞外Ca2+浓度动态变化的研究（图5），发现在SD过程中大鼠大脑皮层细胞外Ca2+浓度降低了50.0%±7.5%，这表明SD过程中有大量的Ca2+会流入细胞内。该研究成果为SS?ISE的微型化、活体脑内金属离子和pH值的测量提供了新的平台。

    另外，Zhao等[4]发现氧化石墨炔（Graphdiyne oxide， GDYO）与水的结合速度优于其它含碳材料。因此，他们首次将GDYO 用作SS?ISE的转导层，同时采用MnO2作为辅助中间层，构建了K+?ISE。通过计时电位法发现，以GDYO?MnO2为转导层的K+?ISE的电位漂移（（11±2） μV/s）明显低于以MnO2为转导层的K+?ISE（（39±3） μV/s），这表明GDYO独特的结构和疏水性能够阻碍和稳定水层，进而提高SS?ISE的电位稳定性。他们进一步以GDYO?MnO2为转导层构建了微型的K+?ISE，研究了电刺激条件下大鼠大脑皮层细胞外K+浓度的变化，发现电刺激手段使得细胞外的K+浓度增加了3倍。GDYO作为转导层可推广到不同的ISE，且不需要复杂的处理步骤，这为脑内离子传感提供了新的机会。

    离子的动态变化越来越多地被认为在许多脑疾病的生理病理学中发挥着关键作用，因此，在脑神经科学研究中测量活体大脑中细胞外离子的浓度显得尤为重要。然而，目前大多数用于直接测量活体脑组织细胞外离子浓度的电极一般是基于玻璃毛细管的液体接触式ISE，不仅在制作过程中易碎、耗时，而且这种探针只能用于测量大脑中单一深度和位置的细胞外离子浓度。最近，Odijk等[79]设计并制备了一种可在活体动物脑内同时测量不同深度和位置的微型ISE电极，如图6所示，他们首先在阵列电极上电沉积导电聚合物PEDOT（如图6D所示）， 然后再修饰K+的敏感膜，形成的K+?ISE用于研究野生型小鼠KCl刺激导致的SD过程中大脑皮层细胞外K+浓度的变化，该电极不受pH、值或O2的干扰，具有很好的稳定性和选择性。而且，单纯裸露的PEDOT电极也可用于电位和神经元活动的记录，该研究为同一电极同时检测不同深度和不同位置的离子变化和相关神经元的活动奠定了基础。另外，这种微制造技术还可以将不同种类的传感器集成到同一个平台上，实现不同物质的同时检测。

    大脑功能的实现依赖于多种化学物质的共同作用，而单一化学物质的检测难以阐明其信号转导和疾病發生的生理病理机制。因此，实现大脑中多种物质的同时检测尤为重要。赵凡等[80]设计并构建了一种能够同时检测谷氨酸和Ca2+的新型双功能微电极（DFME）生物传感器。该传感器通过在Pt微电极（Pt?ME）上同时修饰谷氨酸氧化酶GluOX和Pt纳米颗粒（PtNPs）用作谷氨酸的电流记录通道，电沉积的PtNPs大大提高了谷氨酸生物传感器的灵敏度; 采用全固态Ca2+选择性微电极作为Ca2+的电位记录通道（图7）。该双功能微电极不仅两个通道的检测信号互不干扰，并且具有良好的选择性和较低的检测限，已成功应用于大鼠SD和缺血过程中谷氨酸和Ca2+浓度的实时检测。该研究对理解生理病理过程中谷氨酸和Ca2+的共同作用提供了很好的平台，而且为两种或多种化学物质同时检测提供了一种新的分析方法。

    4?ISE在脑神经活体分析化学领域的新进展

    近年来， ISE在脑神经化学活体分析中得到了迅速发展和广泛应用，其中液接式ISE和全固態ISE在脑神经化学活体分析领域仍然占有重要的地位。Filippidis等[81]将液接式ISME和颅内压（ICP）探针植入大鼠顶叶皮层，用于实时监测大鼠局灶性脑损伤后血管加压素?1a受体（V1aR）选择性抑制剂SR49059对细胞外Na+、K+浓度和ICP的调节作用。Haj?Yasein等[82]用液接式ISME评估了水通道蛋白?4（AQP4）缺失对成年小鼠海马脑区和胼胝体急性切片中活性诱导的K+变化的影响。Yao等[83]研究了AQP4介导的细胞外K+和细胞外间隙（ECS）体积变化对野生型和AQP4缺陷型小鼠皮层扩散性抑制（CSD）去极化的速度、频率和幅度的影响。Odackal等[84]利用双管液接式ISME研究了低钠血症发生和恢复正常时冠状脑切片中Ca2+变化的幅度、时间及相应的机制。Haack等[85]演示了双管液接式ISME的制备和校准，并将该电极用于小鼠海马脑区急性脑切片，研究了外源性给与谷氨酸受体激动剂或癫痫活动期间细胞外K+浓度的变化。他们还进一步描述了同心ISME的构建，并对比了Na+敏感的双管电极和同心电极的响应特性。Moon等[86]开发了一种用于同时检测NO和K+的双电化学微型传感器。该传感器由Pt和Ag的微盘电极构成，其中采用电镀法对Pt盘表面进行改性，然后用氟化干凝胶对其进行包覆用于检测NO， 将Ag盘表面氧化成AgCl，在硅烷化后涂覆K+选择性膜， 用于K+的检测。该传感器具有良好的选择性， 响应时间快， 在体内6 h内具有稳定性，而且该电极尺寸较小，可插入生物组织，因此被用于大鼠癫痫发作时NO和K+动态变化的检测。Octeau等[87]详细讲述了液接式单极K+?ISME的制备、校准和使用，并将该电极用于成年海马脑切片电刺激引起的K+的浓度变化的检测。Zhao等[88]使用TMA+作为ECS的离子示踪剂，研究了大鼠躯体感觉皮层在SD过程中ECS体积分数α和扩散迂曲度λ的动态变化，其中TMA+的扩散采用液接式双管ISME进行检测。另外，ISE本身性能的提高也成为该领域的研究热点之一，如开发新型的离子载体[89]、 寻找合适的转导层，提高电位的稳定性和重现性[90～94]、 发展新的信号输出方法[95，96]、 发展可同时检测两种或多种离子的多通道或阵列电极[97，98]等， 这些研究将为ISE在活体分析领域提供更多的发展机会和应用前景。

    5?总结与展望

    目前，离子选择性电极的研究取得了较大的发展和进步。相较于传统ISE，SS?ISE无需特别维护、制备方法简单、使用寿命较长、响应速度更快、检测限更低，因此在活体分析领域发挥着越来越重要的作用。未来以下几个方面将倍受研究者的关注：（1）虽然在过去的几十年内SS?ISE取得了较大的进步和发展，但是获得具有可重复的标准电位仍然是的SS?ISE发展面临的一个巨大挑战，因此开发具有较大双电层电容或氧化还原电容的转导层仍是SS?ISE主要的研究方向之一; （2）SS?ISE与先进微制造技术的兼容性，为制造包含多功能传感器和可穿戴电子设备的微型化芯片提供了可能，这对于生物活体以及单细胞检测具有较大的发展前景; （3）SS?ISE有望重振离子选择性场效应晶体管领域，并与纳米线器件相结合，开辟新的可能性; （4）SS?ISE可与无线传感技术结合实现远程监控，这对于实现活体动物清醒条件下的测量也十分有效，也可与柔性器件相结合，实现对活体动物的无损伤检测。

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    Recent Advances of Ion?Selective Electrode for ?in Vivo

    Analysis in Brain Neurochemistry

    ZHAO Li?Jun1， ZHENG Wei*1， MAO Lan?Qun*2，3

    1（College of Materials Science and Chemical Engineering， Harbin Engineering University， Harbin 150001， China）

    2（Beijing National Laboratory for Molecular Science， Key Laboratory of Analytical Chemistry for Living Biosystems，

    Institute of Chemistry， Chinese Academy of Sciences， Beijing 100190， China）

    3（University of Chinese Academy of Sciences， Beijing 100049， China）

    Abstract?In the central nervous system， the realization of brain functions cannot be achieved without the participation of many ions， therefore， it is of great significance to real?time monitor the dynamic of ions in the living brain for understanding many physiological and pathological events. As a kind of electrochemical sensor， ion?selective electrode has been widely used for in vivo analysis and other fields in the past half century due to its low cost， simple operation and low energy consumption. This review mainly focuses on the development of ion?selective electrodes， and introduces its basic structure and application in the field of brain neurochemical analysis.

    Keywords?Ion?selective electrode; In vivo analysis; Brain neurochemistry; Review