脑细胞外间隙的电化学分析与成像研究进展

    金靖　吴菲　于萍　毛兰群

    

    

    

    摘?要?脑细胞外间隙（Extracellular space， ECS）是指细胞膜外充满液体的空间，约占脑体积的1/5。作为神经元和胶质细胞赖以生存的环境，ECS在为细胞输送物质的同时，又能保障神经元静息电位的稳定和动作电位的发生，与大脑的基本功能如突触传递、记忆、睡眠和疾病的过程等息息相关。本文着重介绍了ECS的基本生物物理特性，综述了利用电化学和成像方法开展体积分数和迂曲度研究的主要进展，并阐述了ECS在生理和病理过程中的变化规律。

    关键词?细胞外间隙; 电化学分析; 成像; 体积分数; 迂曲度;评述

    1?引 言

    作为人体的高级神经中枢，大脑在维持人体各项生理功能的过程中发挥着不可替代的作用，因此，脑科学研究对理解各种生命过程具有重要意义。脑神经系统的基本组成单元是神经元，人类的脑中有数千亿神经元。脑神经功能的正常行使依赖于神经纤维的电信号传递和不同神经元之间突触间隙的化学信号传递。除神经元外，脑内还存在大量的胶质细胞，占脑重量的1/2，数量是神经元的10～50倍[1]。胶质细胞虽然缺乏传递电信号的功能，但其通过营养、保护、调节等多种方式维系神经元活动，在神经活动中也扮演着重要的角色。脑作为人体最重要的器官，除脑细胞外，细胞之间的间隙（如突触间隙）也在脑神经生理和病理过程发挥着重要的作用。

    脑细胞外间隙（Extracellular space， ECS）[2]是指神经细胞膜外充满液体的空间，主要包括细胞间隙、血管和脑室等。脑室充满无色透明的液体，即脑脊液（Cerebrospinal fluid， CSF）。在人的CSF中，除葡萄糖、少量蛋白和少量的单核细胞、淋巴细胞外，还包括无机盐离子，如Na+（约150 mmol/L）、K+（约3 mmol/L）、Ca2+（约1.2 mmol/L）、Mg2+（约1.2 mmol/L）、Cl（约120 mmol/L）和HCO3（约20 mmol/L）。细胞间隙充满细胞间液，与CSF成分类似，但与CSF不同的是，细胞间液中含有长链大分子的细胞外基质，包括硫酸软骨素、硫酸肝素、透明质酸和膜蛋白质等[2～4]。此外，细胞外基质是负电性的，可能影响离子或带电分子在ECS中的传递。尽管ECS还包括血管和脑室，但ECS的研究主要是针对细胞间隙而展开，一般会忽略ECS和细胞间隙的差别。ECS特性的研究对理解和认识脑功能具有重要意义[3，4]。一方面，ECS为神经元提供丰富的离子，保证静息电位的维持和动作电位的发生，从而实现稳定的电信号传递;另一方面，ECS为细胞输送营养物质、代谢产物和信息分子，保障細胞的生存需求并介导细胞间的通讯。此外，ECS在神经突触和细胞连接的重塑过程中也发挥重要作用。

    长期以来，脑科学研究多集中于神经元和胶质细胞构成的神经网络，而对于ECS的研究却相对较少。直到20世纪中叶，ECS才受到关注。目前，ECS的研究主要集中在部分微区的结构变化和分子的扩散行为。本文介绍了ECS的生物物理特性，以ECS两个参量（体积分数和迂曲度）为研究对象，对ECS的主要研究方法以及ECS在脑生理和病理过程的变化规律研究进行了评述。

    2?生物物理特性

    ECS具有非均匀性和各向异性[5，6]。非均匀性是指不同位置的脑组织其ECS有所差别，体现在不同脑区和亚区。例如，乌龟小脑皮层的颗粒细胞层ECS和分子层ECS有明显差别[5]。ECS是各向异性的，其流体流速和分子扩散是矢量的，换言之，它们既有大小又有方向。例如，分子更容易沿着轴突束传递，而不是横向穿过轴突束[6]。目前主要通过以下若干生物物理参量对ECS的结构进行描述。

    体积分数（Volume fraction， α）代表ECS的体积占脑体积的百分比[7]，即α=VECS/Vtissue。α具有非均匀性且动态变化，不同生理和病理状态的α不同，通常α在0.15～0.30之间，但全脑发生缺血时会导致细胞发生水肿，α会下降至0.05[8，9]。

    分子在ECS中以扩散（Diffusion）的形式传递时会受到脑组织结构的阻碍，这种阻碍作用可用迂曲度（Tortuosity， λ）表示[7]。λ = （D/D*）1/2，其中，D为分子的自由扩散系数，D*为分子在脑组织中的有效扩散系数。λ反映了分子在ECS中扩散的难易程度。在健康的脑中[7]， λ≈ 1.6。

    细胞间隙的真实距离很难直接测得。电子显微镜表征细胞间隙为10～20 nm[10，11]; 而有些外源性大分子，如聚蔗糖（水合半径为20 nm）或量子点[12]（水合半径为17 nm），可在细胞间隙扩散，即至少一部分细胞间隙具有足够的距离，允许这些大分子通过。

    体流（Bulk flow）[13]的来源尚未明确，可能是血脑屏障分泌的液体在细胞间隙流动，之后汇入脑脊液或进入淋巴管。文献[14，15]提供了体流最直接的证据。Cserr研究组[16]还检测了不同分子的流出速率，虽然其扩散系数有明显差别，但流出速率基本一致。他们还认为，体流仅发生在毛细血管的周围间隙[17]。据估计，脑白质[18]体流流速约为10.5 μm/min。

    3.1?ECS的研究历史

    20世纪中叶，关于ECS的争论十分激烈[11]。一方面，通过固定脑组织，以电子显微镜为手段直接观测二维区域的ECS（图1）[19]。 然而，该方法只能测定α，且仅限于失活的脑组织; 此外，脑组织经过固定和化学处理后有可能导致ECS的变化。最初电镜显示[11，20]，ECS仅占脑体积的5%，甚至无法观测到ECS; 而脑组织通过冷冻技术固定[21]后，测得α为0.15～0.20。 但是，冷冻过程形成的冰晶有可能会增大α。另一方面，以细胞膜外探针分子或标记物的扩散分布可量化三维区域ECS[21]，该方法可同时测定α和λ。更重要的是，扩散方法可在活体上研究ECS的动态变化。然而，该方法对探针分子的要求较高。早期实验测量脑中Na+和Cl分布的结果表明，ECS可能占据高达40%的脑体积[11]。而研究人员意识到Na+和Cl在细胞内有明显的分布后，使用放射标记的蔗糖和菊粉测量ECS的α为0.15～0.20[21]。

    Rall＼， Fenstermacher和Patlak是利用扩散方法研究ECS的先驱[21～23]，他们通过研究放射性示踪剂在脑内的扩散，反映ECS的结构特征。在早期研究中，研究人员将放射标记的蔗糖或菊粉注射至动物脑室，通过脑切片获得其分布，并测得α为0.15～0.20，λ为1.52～1.64。放射性示踪剂的扩散发生在活体中，但定量是在動物处死后某一时间点进行的，因此该方法没有得到普遍使用。尽管如此，其获得的数据可为其它方法提供独立的验证。不使用放射性示踪剂的实时分析技术最早由Lux等[24]建立，后来得到了Nicholson等[7]的改进。如图2[19]所示，该方法先将探针离子或分子从玻璃毛细管中释放到脑组织后，探针在ECS发生扩散，然后在不同的位置利用离子选择性微电极或碳纤维电极，结合电位法、伏安法或安培法等电化学方法，检测所释放的探针浓度，依据Fick第二定律得到ECS的生物物理参数。该方法能够研究多种探针在可控距离的扩散，并实时监测探针在ECS的扩散和代谢情况，且不受脑区深度限制，是目前较理想的研究ECS的方法之一。

    3.2?理论基础

    探针被递送到ECS后会发生扩散，利用合适的方法对探针进行检测，可反映ECS的某些生物物理特性。通常，检测的距离约100 μm，短距离可确保ECS的均匀性。探针在ECS中的扩散基本符合Fick第二定律，但需要进行合理的修正[3，4，7，11，25]：

    Ct=Dλ[email protected]

    2C+Qα-v·[email protected]

    C-f（C）α（1）

    等号左边是给定位置探针浓度C随时间t的变化。等号右边第一项是扩散本身的贡献; 第二项是玻璃毛细管在ECS中释放探针的量Q; 第三项表示体流的可能贡献，其为速度矢量v和浓度梯度C的乘积; 最后一项f（C）表示探针在ECS中的不可逆损失。

    探针的选择非常重要，不合适的探针不能准确反映ECS。本质上，ECS的研究目的决定使用探针的类型。第一类研究通过量化两个生物物理参数（α和λ）反映ECS的性质。为此，探针应满足以下要求[4，7]：分子足够小且是水溶性的，以探索脑内所有区域的ECS; 对脑组织无毒且浓度足够低，不影响脑组织的渗透压; 与ECS无相互作用且不易被清除，能准确测定其浓度。这种理想的探针将探索ECS的所有通道，并真实反映ECS性能参数。第二类研究则使用不同于上述要求的探针，来尝试解决以下问题：细胞间隙大小; 分子之间或分子与细胞外基质的相互作用（非特异性或特异性结合）; 分子是否进入细胞或穿过血脑屏障。这样的探针可能不会到达ECS的所有通道，也可能被保留在ECS或进入细胞。

    4?ECS的研究方法

    ECS的研究方法按测量方法可分为形貌测量法（电子显微镜）、电化学方法（电位法、伏安法和安培法）、光学方法和磁共振成像法; 按ECS中分子传递方式可分为扩散方法和电渗方法; 按探针递送方式可分为直接注射法、离子导入法和压力导入法。本文以ECS两个主要生物物理参数（α和λ）为测定对象，对ECS的主要研究方法进行分类评述。

    4.1?体积分数（α）的测定方法

    目前，除电子显微镜和放射性示踪法，可测定α的方法还有实时离子导入法。实时离子导入法（Real?time iontophoretic method， RTI）[7，26]是通过离子导入的方法，将探针离子导入脑组织，并用离子选择性微电极（Ion?selective microelectrode， ISM）[27～33]实时监测探针离子的浓度，从而测定ECS的生物物理参数。RTI可同时测定ECS的α和λ，是目前研究ECS常用方法之一。

    离子导入是指离子在电流的作用下释放到ECS中， 优点是可通过离子导入电流精确调控离子释放。离子导入是通过玻璃毛细管实现的。玻璃毛细管尖端直径为3～6 μm，内部填充0.1～1.0 mol/L的离子溶液，并插入一根Ag/AgCl丝作为电极，然后密封毛细管尾端防止管内液体蒸发。其中，3～6 μm的尖端既能避免直接插入细胞， 不会对脑组织造成较大的损伤。如图3A所示，离子导入管中的Ag/AgCl丝与恒电流源连通，并与琼脂中的对电极构成回路，离子从玻璃毛细管尖端导出[19]。以0.3%的琼脂凝胶（含150 mmol/L NaCl）为自由扩散基质（α=1）， 计算探针的自由扩散系数和迁移数（Transport number， nt）。琼脂凝胶的使用可排除水或等渗溶液中热对流的干扰。式（1）在RTI中修正为[7，34]：

    Ct=Q8πD*αr[erfcr2?D*t+?k'texpr?k'D*+erfcr2?D*t-?k'texp-r?k'D*（2）

    式（2）为开始并保持离子导入后在距离毛细管尖端r处的离子浓度C。其中，erfc为余误差函数。

    Q=IntzF（3）

    其中，I为离子导入电流 ，nt为导入离子的迁移数， z为离子的化合价， F为法拉第常数。

    在RTI中， 常用的探针如表1所列。四乙基铵阳离子（Tetraethylammonium， TEA+）是第一个利用RTI方法研究ECS并准确测定α和λ时使用的探针。TEA+是细胞内电压门控的钾离子通道阻断剂[4]。四甲基铵阳离子（Tetramethylammonium， TMA+）由于具有比TEA+弱的K+阻断效果和小的尺寸， 被广泛应用于ECS的研究。此外，带负电荷的离子（六氟砷酸盐（Hexafluoroarsenate， AsF6

    ）、α?萘磺酸盐（α?Naphthalenesulfonate， α?NS

    由于光学方法自身的缺陷，IOI通常局限于脑最浅表的200 μm左右，且仅限于研究大脑灰质等没有明显光散射的区域[61]。目前，双光子成像[36， 61～64]已初步用于大鼠纹状体的探针扩散研究，虽然获得的信噪比比较低，但这种方法很可能成为深度脑区ECS的重要研究方法。Zheng等[64]将时间分辨荧光各向异性成像技术与双光子激发显微镜技术结合，在切片上观测到ECS中分子的扩散。他们发现，在海马脑区细胞间隙中小分子的扩散系数是自由扩散系数的70%，而突触间隙中小分子的扩散系数是自由扩散系数的54%。此外，超分辨成像也能对ECS进行更精准的描述。Godin等[60]以注入脑室的单壁碳纳米管为探针，检测单个探针的近红外发射，进而反映出ECS的宽度和局部黏度信息。Tonnesen等[65]将荧光标记技术和三维的受激发射损耗显微镜（Stimulated emission depletion， 3D?STED）相结合，建立了脑ECS的超分辨阴影成像（Super?resolution shadow imaging， SUSHI）。该方法能从一定程度上缓解传统光学成像造成的光漂白和光毒性问题，能够定量给出ECS的结构和动力学信息。

    4.2.3?磁共振成像法?作为一种非侵入性技术，磁共振成像法（Magnetic resonance imaging， MRI）[66～72]因基于水的核磁特

    征可实现人体和大脑的成像，广泛应用于临床。MRI可通过扩散加权成像（Diffusion weighted imaging， DWI）测量体内水分子的表观扩散系数和组织各向异性。基于MRI的ECS研究以水分子作为探针，但水分子扩散也同时存在于细胞内，因而无法准确描述ECS性质。而利用外源性探[73]（如苯丙醇胺、甘露醇、PEG等）得到的λ为1.75～1.83，则略高于RTI的结果。

    Han研究组[74～80]开发的MRI示踪法可在全脑动态观察ECS，并获得其扩散参数。该方法采用钆?二乙三胺五乙酸（Gadolinium?diethylene triaminepentaacetic acid， Gd?DTPA）为探针，作用于距离探针0.24 nm的水分子的氢原子核。通过缩短氢核弛豫时间和动态扫描采集图像信息，进而获得ECS的扩散系数。利用该方法，他们发现大鼠尾状核和丘脑虽然邻近，但两区域的细胞间液无法相互沟通且流动速度和分布范围均不相同。这表明ECS可能存在不同脑区的分区系统[75]。此外，他们利用该方法也发现大鼠给予疼痛刺激后，丘脑和尾状核的ECS流量明显减慢[76，77]。Song等[81]用该方法研究大鼠神经胶质瘤肿块中ECS的变化。

    除Gd?DTPA为探针外，Madelin等[82， 83]提出一种基于钠磁共振成像的方法，可估算脑细胞内钠浓度，并计算出ECS的α。他们对5名健康志愿者进行细胞内钠的检测，均值为11 mmol/L，灰质的α=0.22，白质的α=0.18，与健康脑组织标准值（钠浓度： 10 ～15 mmol/L，α≈0.2）接近。

    4.2.4?电渗测量法?虽然对ECS中物质的扩散行为具有较好的理解，但对于电介导的物质传递却知之甚少。在ECS中，与负电性的细胞外基质抗衡的正离子会在电场作用下带动细胞间液发生流动，从而产生脑内的电渗流。Weber研究组[84～90]利用电渗（Electroosmosis，EO）在海马脑区测定ECS的λ和ζ?电势。如图5所示，其在脑片上引入荧光分子作为探针，施加约22 V/cm的电场，探针在电泳和电渗的共同作用下发生移动，通过下列公式，可求得ECS的λ和细胞外基质的ζ?电势。

    中，vobs为测量的速度，veo为电渗速度，vep为电泳速度， μ为迁移率，E为电场强度， η为介质黏度， ε为介电常数。实验测得海马ECS的λ=1.83±0.06， ζ?电势=（

    22±2） mV，其亚区CA1椎体细胞层、CA3椎体细胞层和齿状回的ζ?电势分别为（

    25.4±1.0） mV。此外，利用脑ECS的电渗现象，可定量检测ECS中的半胱氨酸浓度[86， 87]和酶活反应[88]等。

    5?ECS的生理和病理变化

    5.1?不同脑区ECS的差异

    脑组织结构复杂，具有不均一的各向异质性。即使是同一物种，不同脑区的α和λ也存在较大的差别。表2总结了活体原位测得的成年大鼠的皮层、胼胝体、海马、纹状体、小脑和脊髓的α和λ。總体而言，神经纤维丰富的脑组织（胼胝体）因存在较多间隙，分子扩散较快; 而在神经元与胶质细胞较为紧密的脑实质区（皮层），分子扩散常受到限制。

    5.2?发育过程中脑ECS的变化

    在发育过程中，脑ECS是动态变化的。从出生到成年再到衰老，α随个体的发育逐渐降低，但λ并无明显的变化。新生大鼠[98]在出生的第二天（P2）到第四天（P4），其α约为0.4，但是在P10～P11，α减小至0.27， P23时α和成年大鼠基本接近。然而λ在发育过程中基本保持在1.5～1.6之间，可能是因为大的ECS促进发育相关的分子的运动，并为细胞迁移提供更宽的通道。在衰老过程[95]中，α从0.21～0.22降低至0.17～0.19，而λ基本不变。此外，有研究表明，α与学习能力相关，行为学表现越良好的老年鼠α越大。总之，α随年龄增长而下降，λ基本保持不变。

    5.3?不同干预和病理模型的ECS

    5.3.1?渗透压变化?Krizaj等[103]研究了乌龟小脑的ECS在不同渗透压下的变化，发现在生理盐溶液（302 mosmol/kg）、低渗溶液（238 mosmol/kg）和一系列高渗溶液（最高渗透压为668 mosmol/kg）中，α依次为0.22、0.12和0.6（668 mosmol/kg），λ依次为1.70，1.79和1.50。Kume?Kick等[104， 105]研究了渗透压对哺乳动物ECS的影响。结果表明，大鼠皮层在生理盐溶液（305 mosmol/kg）中α=0.24， λ=1.69; 在低渗溶液（150 mosmol/kg）中，α减小至0.12，λ升高至1.86; 在高渗溶液（最高500 mosmol/kg）中，α稳定上升至0.42，而λ在渗透压为350 mosmol/kg的溶液中为1.67，之后稳定不变。

    5.3.2?腦缺血/缺氧?脑组织出现缺血或缺氧时，ECS中的离子浓度迅速发生变化，其中K+浓度急剧上升至50～70 mmol/L，Na+浓度迅速下降至48～59 mmol/L，Cl

    浓度下降至70～75 mmol/L，Ca2+浓度下降至0.06～0.08 mmol/L，pH下降至6.4～6.6。大量Na+和Cl

    进入细胞后，水分子也进入细胞，造成细胞水肿，从而改变ECS。当大鼠发生缺血/缺氧时[8，9，57]，脊髓和皮层的α从0.20最低下降到0.05，λ则由1.5上升至2.1。

    5.3.3?帕金森综合症?帕金森综合症是一种常见的神经退行性疾病。在动物黑质或纹状体脑区注射6?羟多巴胺（6?Hydroxydopamine， 6?OHDA）能成功诱导帕金森模型，而将幼鼠的多巴胺能神经元移植到6?OHDA损伤的纹状体可使其功能恢复[106]。研究发现[100]，未注射6?OHDA之前，纹状体的α=0.19， λ=1.59; 建模后纹状体的α为0.14，λ为1.50; 而将幼鼠的多巴胺能神经元移植到损伤部位后，α=0.24， λ=1.80。

    如表3所示，其它模型中，如电刺激、扩散性抑制、癫痫、高血钠和戳伤等，ECS也会发生变化。

    6?总结与展望

    脑ECS占脑体积的20%左右，为脑细胞的生存和信息交流提供了必要的条件。与自由溶液相比，分子在ECS中扩散受到阻碍，溶液中自由扩散系数约为ECS中扩散系数的2.6倍。此外ECS是动态变化的，在大脑生理和病理状态下，ECS的α和λ均会发生改变。然而，由于对ECS的认识不足，目前对所有结果尚难有明确的解释。

    为深入理解ECS在脑功能实现过程中的作用，研究学者发展了多种活体分析方法和技术，其中以TMA+为探针的RTI是较成熟的研究方法之一。RTP和IOI则可选择多种分子作为探针，丰富了ECS的研究。MRI作为一种无损技术，极有可能发展为人脑ECS的研究方法。除探针在ECS中的扩散，电渗测量法从新的角度阐述了ECS中物质的传递。

    虽然人们逐渐认识到ECS的重要性，但ECS的研究仍面临诸多挑战：（1）目前的方法大多集中在对ECS的α和λ的研究，然而针对其它生物物理性质的研究基本空白; （2）现有方法只能测定距离脑表层200 μm深度的ECS，深部脑区的ECS活体研究方法亟需发展，而清醒自由移动动物的ECS研究目前尚无良策; （3）除MRI外，大多数方法只能研究以毛细管尖端为中心的200 μm左右的微小区域， 缺乏对全脑ECS的整体认识; （4）探针在ECS中扩散的理论弱化了体流和分子的不可逆损失部分，而分子在ECS的真实表现仍不清楚，需要进一步加强ECS中分子与细胞外基质相互作用的研究，甚至单分子行为的研究，以加深对ECS的理解和认识。

    目前，人们认为脑信息传递的途径除神经纤维的电信号传递和突触间隙的化学信号传递外，还应存在以ECS为主要途径的容积传递。建立和发展新的分析化学原理和方法，深入系统开展ECS的研究，不仅能够有助于理解物质在ECS传递，而且还能从新的角度阐述脑的生理过程和病理机制，为人类认识脑和利用脑奠定重要的基础。

    References

    1?YU Long?Chuan. Neurobiology. Beijing： Peking University Press， ?2010： 11

    于龙川. 神经生物学. ?北京： 北京大学出版社， ?2010： ?11

    2?Bunde A， Caro J， Karger J， Vogl G. Diffusive Spreading in Nature，Technology and Society. ?Cham： Spring Internaional Publishing AG， ?2017： ?93-112

    3?Nicholson C， Hrabetova S. Biophys. J.， ?2017， ?113（10）： 2133-2142

    4?Sykova E， Nicholson C. Physiol. Rev.， ?2008， ?88（4）： 1277-1340

    5?Rice M E， Okada Y C， Nicholson C. J. Neurophysiol.， 1993， ?70（5）： 2035-2044

    6?Vorisek I， Sykova E. J. Neurophysiol.， ?1997， ?78（2）： 912-919

    7?Nicholson C， Phillips J M. J. Physiol.， ?1981， ?321（DEC）： 225-257

    8?Toorn A， Sykova E， Dijkhuizen R M， Vorisek I， Vargova L， Skobisova E， Campagne M L， Reese T， Nicolay K. Magn. Reson. Med.， ?1996， ?36（1）： 52-60

    9?Vorisek I， Sykova E. J. Cereb. Blood Flow Metab.， ?1997， ?17（2）： 191-203

    10?Brightman M W. Am. J. Anat.， 1965， ?117（2）： 193-219

    11?Michael A C， Borland L M. ?Electrochemical Methods for Neuroscience. Boca Raton： CRC Press， ?2007： ?168-199

    12?Thorne R G， Nicholson C. Proc. Natl. Acad. Sci. USA， ?2006， ?103（14）： 5567-5572

    13?Abbott N J. Neurochem. Int.， ?2004， ?45（4）： 545-552

    14?Cserr H F， Ostrach L. Exp. Neurol.， ?1974， ?45（1）： 50-60

    15?Weller R O， Kida S， Zhang E. Brain Pathol.， ?1992， ?2（4）： 277-284

    16?Szentistvanyi I， Patlak C S， Ellis R A， Cserr H F. Am. J. Physiol.， ?1984， ?246（6）： F835-F844

    17?Ichimura T， Fraser P A， Cserr H F. Brain Res.， ?1991， ?545（1?2）： 103-113

    18?Rosenberg G A， Kyner W T， Estrada E. Am. J. Physiol.， ?1980， ?238（1）： F42-F49

    19?Nicholson C， Sykova E. Trends Neurosci.， ?1998， ?21（5）： 207-215

    20?Gonzalez?Aguilar F. J. Ultrastruct. Res.， ?1969， ?29（1?2）： 76-85

    21?Fenstermacher J， Kaye T. Ann. N. Y. Acad. Sci.， ?1988， ?531（1）： 29-39

    22?Rall D P， Oppelt W W， Patlak C S. Life Sci.， ?1962， ?1（2）： 43-48

    23?Patlak C S， Fenstermacher J D. Am. J. Physiol.， ?1975， ?229（4）： 877-884

    24?Lux H D， Neher E. Exp. Brain Res.， ?1973， ?17（2）： 190-205

    25?Nicholson C， Kamali?Zare P. Neurochem. Res.， ?2019： ?10.1007/s11064?019?02793?6

    26?Odackal J， Colbourn R， Odackal N J， Tao L， Nicholson C， Hrabetova S. JOVE?J. Vis. Exp.， ?2017， ?（125）： e55755

    27?CUI Guang?Wen， He Run?He， YAO Jian， WANG Jian?ping， ZHANG Xing?Xiang. Chinese J. Anal. Chem.， ?2018， ?46（10）： 1669-1676

    崔光文， 何润合， 药 健， 王建平， 张兴祥. ?分析化学， ?2018， ?46（10）： 1669-1676

    28?YANG Cheng， SONG Cai?Qiao， ZHANG Ya?Qi， QU Yao. Chinese J. Anal. Chem.， ?2019， ?47（5）： 765-771

    杨 成， 宋彩侨， 张亚旗， 曲 瑶. ?分析化学， ?2019， ?47（5）： 765-771

    29?ZHOU Shuang， GUO Yu?Shi， YAN Yu， QU Jiang?Ying， HE Chun?Xiang. Chinese J. Anal. Chem.， ?2018， ?46（1）： 81-87

    周 爽， 郭煜石， 顏 宇， 曲江英， 赫春香. ?分析化学， ?2018， ?46（1）：81-87

    30?ZHAO Fan， SHI Guo?Yue， TIAN Yang. Chinese J. Anal. Chem.， ?2019， ?47（3）： 347-354

    赵 凡， 施国跃， 田 阳. ?分析化学， ?2019， ?47（3）： 347-354

    31?Zhao L， Jiang Y， Wei H， Jiang Y， Ma W， Zheng W， Cao A， Mao L. Anal. Chem.， ?2019， ?91（7）： 4421-4428

    32?Hao J， Xiao T， Wu F， Yu P， Mao L. Anal. Chem.， ?2016， ?88（22）： 11238-11243

    33?Zhao L， Jiang Y， Hao J， Wei H， Zheng W， Mao L. Sci. China Chem.， ?2019： ?10.1007/s11426?019?9516?5

    34?Nicholson C. Rep. Prog. Phys.， ?2001， ?64（7）： 815-884

    35?Nicholson C， Rice M E. Can. J. Physiol. Pharmacol.， ?1987， ?65（5）： 1086-1091

    36?Xie L， Kang H， Xu Q， Chen M J， Liao Y， Thiyagarajan M， O'Donnell J， Christensen D J， Nicholson C， Iliff J J， Takano T， Deane R， Nedegaard M. Science， ?2013， ?342（6156）： 373-377

    37?Sykova E. Neurochem. Int.， ?2004， ?45（4）： 453-466

    38?Nicholson C. J. Neurosci. Methods， ?1993， ?48（3）： 199-213

    39?Nicholson C. Brain Res.， ?1985， ?333（2）： 325-329

    40?Rice M， Gerhardt G， Hierl P， Nagy G， Adams R. Neuroscience， ?1985， ?15（3）： 891-902

    41?Cragg S J， Nicholson C， Kume?Kick J， Tao L， Rice M E. J. Neurophysiol.， ?2001， ?85（4）： 1761-1771

    42?Dayton M A， Ewing A G， Wightman R M. J. Electroanal. Chem.， ?1983， ?146（1）： 189-200

    43?LYU Yang， ZHANG Ya?Wen， TAN Lei， JI Wen?Liang， YU Ping， MAO Lan?Qun， ZHOU Fang. Chinese J. Anal. Chem.， ?2017， ?45（11）： 1595-1599

    呂 扬， 张雅文， 谭 磊， 纪文亮， 于 萍， 毛兰群， 周 方. ?分析化学， ?2017， ?45（11）： 1595-1599

    44?Xin Q， Wightman R M. Brain Res.， ?1997， ?776（1?2）： 126-132

    45?Rice M， Nicholson C. Ann. N. Y. Acad. Sci.， ?1986， ?481（1）： 381-382

    46?Nicholson C， Tao L. Biophys. J.， ?1993， ?65（6）： 2277-2290

    47?Hrabetova S， Hrabe J， Nicholson C. J. Neurosci.， ?2003， ?23（23）： 8351-8359

    48?Johnson E M， Berk D A， Jain R K， Deen W M. Biophys. J.， ?1995， ?68（4）： 1561-1568

    49?Tao L， Nicholson C. Neuroscience， ?1996， ?75（3）： 839-847

    50?Xiao T， Jiang Y， Ji W， Mao L. Anal. Chem.， ?2018， ?90（7）： 4840-4846

    51?Xiao T， Wang Y， Wei H， Yu P， Jiang Y， Mao L. Angew. Chem.Int. Edit.， ?2019， ?58（ 20）： 6616-6619

    52?Chatard C， Meiller A， Marinesco S. Electroanalysis， ?2018， ?30（6）： 977-998

    53?XU Sheng?Wei， WANG Li， SONG Xian?Teng， ZHANG Song， WANG Mi?Xia， YU Ping， MAO Lan?Qun， CAI Xin?Xia. ?Chinese J. Anal. Chem.， ?2016， ?44（9）： 1457-1463

    徐声伟， 王 力， 宋先腾， 张 松， 王蜜霞， 于 萍， 毛兰群， 蔡新霞. ?分析化学， ?2016， ?44（9）： 1457-1463

    54?QIN Tai?Xiang， LI Xiao?Gang， HAO Jie， YU Ping， MAO Lan?Qun. Chinese J. Anal. Chem.， ?2015， ?43（3）： 457-462

    秦泰香， 李晓刚， 郝 洁， 于 萍， 毛兰群. ?分析化学， ?2015， ?43（3）： 457-462

    55?LI Xiao?Gang， GUO Bin?Qian， QIN Tai?Xiang， HAO Jie， YU Ping， MAO Lan?Qun. Chinese J. Anal. Chem.， ?2016， ?44（9）： 1465-1470

    李晓刚， 郭彬乾， 秦泰香， 郝 洁， 于 萍， 毛兰群. ?分析化学， ?2016， ?44（9）： 1465-1470

    56?Wolak D J， Thorne R G. Mol. Pharm.， ?2013， ?10（5）： 1492-1504

    57?Hrabetova S， Nicholson C. J. Cereb. Blood Flow Metab.， ?2000， ?20（9）： 1306-1310

    58?Yao X， Hrabetova S， Nicholson C， Manley G T. J. Neurosci.， ?2008， ?28（21）： 5460-5464

    59?Prokopova?Kubinova S， Vargova L， Tao L， Ulbrich K， Subr V， Sykova E， Nicholson C. Biophys. J.， ?2001， ?80（1）： 542-548

    60?Godin A G， Varela J A， Gao Z， Danné N， Dupuis J P， Lounis B， Groc L， Cognet L. Nat. Nanotechnol.， ?2017， ?12（3）： 238-243

    61?Hrabetova S， Cognet L， Rusakov D A， Nagerl U V. J. Neurosci.， ?2018， ?38（44）： 9355-9363

    62?Stroh M， Zipfel W R， Williams R M， Ma S C， Webb W W， Saltzman W M. Nat. Mater.， ?2004， ?3（7）： 489-494

    63?Stroh M， Zipfel W R， Williams R M， Webb W W， Saltzman W M. Biophys. J.， ?2003， ?85（1）： 581-588

    64?Zheng K， Jensen T P， Savtchenko L P， Levitt J A， Suhling K， Rusakov D A. Sci. Rep.， ?2017， ?7： 42022

    65?Tonnesen J， Inavalli V， Nagerl U V. Cell， ?2018， ?172（5）： 1108-1121

    66?CHENG Shi， WANG Xin， LIU Bao?Lin. Chinese J. Anal. Chem.， ?2018， ?46（2）： 281-287

    成 實， 王 欣， 刘宝林. ?分析化学， ?2018， ?46（2）： 281-287

    67?GU Gui?Ying， WANG Xin， ZHOU Hua?Lan， LIU Bao?Lin. Chinese J. Anal. Chem.， ?2018， ?46（8）： 1161-1168

    谷桂英， 王 欣， 周化岚，刘宝林. ?分析化学， ?2018， ?46（8）： 1161-1168

    68?Biswal B B， Mennes M， Zuo X N， Gohel S， Kelly C， Smith S M， Beckmann C F， Adelstein J S， Buckner R L， Colcombe S， Dogonowski A M， Ernst M， Fair D， Hampson M， Hoptman M J， Hyde J S， Kiviniemi V J， Kotter R， Li S J， Lin C P， Lowe M J， Mackay C， Madden D J， Madsen K H， Margulies D S， Mayberg H S， McMahon K， Monk C S， Mostofsky S H， Nagel B J， Pekar J J， Peltier S J， Petersen S E， Riedl V， Rombouts S A， Rypma B， Schlaggar B L， Schmidt S， Seidler R D， Siegle G J， Sorg C， Teng G J， Veijola J， Villringer A， Walter M， Wang L， Weng X C， Whitfield?Gabrieli S， Williamson P， Windischberger C， Zang Y F， Zhang H Y， Castellanos F X， Milham M P. Proc. Natl. Acad. Sci. USA， ?2010， ?107（10）： 4734-4739

    90?Ou Y， Wu J， Sandberg M， Weber S G. Anal. Bioanal. Chem.， ?2014， ?406（26）： 6455-6468

    91?Cserr H， DePasquale M， Nicholson C， Patlak C， Pettigrew K， Rice M. J. Physiol.， ?1991， ?442（1）： 277-295

    92?Homola A， Zoremba N， Slais K， Kuhlen R， Sykova E. Neurosci. Lett.， ?2006， ?404（1?2）： 137-142

    93?Mazel T， Richter F， Vargova L， Sykova E. Physiol. Res.， ?2002， ?51（Suppl 1）： S85-S94

    94?Slais K， Vorisek I， Zoremba N， Homola A， Dmytrenko L， Sykova E. Exp. Neurol.， ?2008， ?209（1）： 145-154

    95?Sykova E， Mazel T， Simonova Z. Exp. Gerontol.， ?1998， ?33（7?8）： 837-851

    96?Vorisek I， Hajek M， Tintera J， Nicolay K， Sykova E. Magn. Reson. Med.， ?2002， ?48（6）： 994-1003

    97?Zoremba N， Homola A， Rossaint R， Sykova E. Exp. Neurol.， ?2007， ?203（1）： 34-41

    98?Lehmenkuhler A， Sykova E， Svoboda J， Zilles K， Nicholson C. Neuroscience， ?1993， ?55（2）： 339-351

    99?Jansson A， Mazel T， Andbjer B， Rosen L， Guidolin D， Zoli M， Sykova E， Agnati L F， Fuxe K. Neuroscience， ?1999， ?91（1）： 69-80

    100?Reum T， Olshausen F， Mazel T， Vorisek I， Morgenstern R， Sykova E. J. Neurosci. Res.， ?2002， ?70（5）： 680-693

    101?Simonova Z， Svoboda J， Orkand P， Bernard C， Lassmann H， Sykova E. Physiol. Res.， ?1996， ?45（1）： 11-22

    102?Svoboda J， Sykova E. Brain Res.， ?1991， ?560（1?2）： 216-224

    103?Krizaj D， Rice M E， Wardle R A， Nicholson C. J. Physiol.， ?1996， ?492（3）： 887-896

    104?Kume?Kick J， Mazel T， Vorisek I， Hrabetova S， Tao L， Nicholson C. J. Physiol.， ?2002， ?542（2）： 515-527

    105?Vargova L， Chvatal A， Anderova M， Kubinova S， Ziak D， Sykova E. J. Neurosci. Res.， ?2001， ?65（2）： 129-138

    106?Bjorklund A. Curr. Opin. Neurobiol.， ?1992， ?2（5）： 683-689

    107?Sykova E， Svoboda J， Polak J， Chvatal A. J. Cereb. Blood Flow Metab.， ?1994， ?14（2）： 301-311

    108?Roitbak T， Sykova E. Glia， ?1999， ?28（1）： 40-48

    Progress of Electrochemical Analysis and Imaging

    of Extracellular Space

    JIN Jing1，2， WU Fei 1，2， YU Ping1，2， MAO Lan?Qun*1，2

    1（Beijing National Laboratory for Molecular Science， Key Laboratory of Analytical Chemistry for Living Biosystems，

    Institute of Chemistry， Chinese Academy of Sciences， Beijing 100190， China）

    2（University of Chinese Academy of Sciences， Beijing 100049， China）

    Abstract?Extracellular space （ECS） is the fluid?filled space surrounding the brain cells， accounting for about one fifth of brain volume. As an essential living environment for neurons and glial cells， ECS not only transports substances for cells， but also enables stable electrical signaling. Therefore， it is closely related to the basic functions of the brain， such as synaptic transmission， memory， sleep and diseases. This review focuses on the primary biophysical characteristics of ECS and the main progress on investigating volume fraction and tortuosity with electrochemical analysis and imaging methods. The review also expounds on the variation of ECS in physiological and pathological processes.

    Keywords?Extracellular space; Electrochemical analysis; Imaging; Volume fraction; Tortuosity; Review