生物硫醇荧光探针的设计、合成及应用研究

    牛卫芬　张潮　贾娟　贠克明　双少敏　董川　黄文成

    

    

    

    摘 要 以4-（4-羟基苯乙烯基）-1-甲基吡啶盐（MCY）为荧光团、4-硝基苯并恶二唑（NBD）为硫醇的反应基团，合成荧光探针（MCY-NBD），用于高灵敏、选择性检测细胞中的生物硫醇。探针与硫醇反应后，呈现显著的绿色荧光增强，荧光增强程度与硫醇浓度在0.1～4.0 μmol/L范围内呈良好的线性关系，检出限为0.03 μmol/L; 此探针具有反应速度快、选择性高、光学稳定性好等优点。激光共聚焦扫描显微成像结果表明，MCY-NBD具有优良的生物相容性、细胞膜通透性及低毒性，可用于快速检测细胞内生物硫醇的浓度。

    关键词 生物硫醇; 荧光探针; 细胞成像

    1 引 言

    生物硫醇是生物体内普遍存在的一类含硫活性物质（RSS），主要包括半胱氨酸（Cys）、同型半胱氨酸（Hcy）和谷胱甘肽（GSH），在人体的生理过程中具有关键作用，维持人体的氧化还原平衡[1～4]，作为抗氧化剂维持生物体内过氧自由基的正常水平，协助抑制细胞凋亡，参与复杂的多维蛋白结构的构建[5，6]。生物体内硫醇浓度异常会引起一系列疾病，包括癌症、阿尔茨海默氏症、骨质疏松症、肝损伤、心脏病、肠道炎症及心血管疾病等[7～10]。谷胱甘肽是细胞内含量最丰富的非蛋白硫醇（1～10 mmol/L）[11]，参与维持细胞的氧化还原活性、易生物质代谢、细胞内的信号传导及基因调节等[12]。谷胱甘肽有还原型（G-SH）和氧化型（G-S-S-G）两种形式，生理条件下以还原型谷胱甘肽占绝大多数; 还原型谷胱甘肽通过控制氧化应激维持细胞的氧化还原平衡，对细胞的生长和维持正常功能方面起着至关重要的作用[12，13]，还原型谷胱甘肽水平异常是氧化应激的潜在指标之一[14～16]。因此，生物体， 尤其是细胞中生物硫醇的高灵敏、选择性检测方法备受关注。

    在文献报道的生物硫醇的检测方法中，光学技术， 尤其是荧光探针结合激光共聚焦扫描显微成像技术，具有高灵敏度、高选择性、对生物样品的非破坏性以及高时空分辨率，能够对细胞内目标物进行实时监控[17～21]，因此，高选择性的硫醇荧光探针在近十几年发展迅速。目前，用于硫醇检测的荧光探针原理主要是基于巯基的强亲核性和对金属离子的高络合能力[22～41]。2016年，本研究组首先报道了基于线粒体靶向的比率发射双光子荧光探针，用于高选择性检测细胞和组织中的半胱氨酸[27]。2018年，Yang等[28]利用分子内电荷转移-共振能量转移共同作用，设计合成了比率型双光子荧光探针，可选择性测定细胞和肝组织中的半胱氨酸，但探针和半胱氨酸的响应时间需30 min。2019年，Xu等[29]合成了一个近红外荧光探针，可同时靶向溶酶体和线粒体，用于活體内谷胱甘肽成像研究，但响应时间较长，约需90 min反应才能达到平衡。以上探针均是基于硫醇巯基的亲核性而设计。金属配合物自1890年首次被报道以来，被广泛应用于各个领域。 Wang等[30]报道了一种铜络合物近红外荧光探针，利用半胱氨酸和铜的络合能力， 选择性测定人血浆中的半胱氨酸含量，但探针结构较复杂。综上，用于硫醇检测的荧光探针的研究仍然面临许多挑战。因此，设计合适的识别基团有效区分3种硫醇（Cys、HCY 和GSH），提高探针的生物相容性，发展低生理毒性的体内光学成像的方法，消除细胞内固有生物物质自发荧光的干扰，实现探针和硫醇快速响应，是未来的研究重点。

    为了合成具有优良的生物相容性、高灵敏度以及快速响应的生物硫醇荧光探针，设计方面应具备以下特点：探针的荧光团应有较大的摩尔吸收系数（ε）和高的荧光量子产率（F）; 传感单元应快速与硫醇响应，并且不受细胞内高浓度物种的干扰; 探针应具有低的细胞毒性和优良的细胞膜通透性。基于以上考虑，本研究选用一个部花菁4-（4-羟基苯乙烯基）-1-甲基吡啶盐（MCY，化合物1）作为荧光团，它不仅具有好的生物相容性，且羟基基团很容易修饰特定的靶向识别位点。然后，通过Williamson醚合成反应将硫醇的特异性识别基团4-硝基苯并恶二唑（NBD）偶联到荧光团中，得到了增强型荧光探针MCY-NBD。由于荧光团的羟基被硝基苯并恶二唑包裹， 降低了羟基氧原子的供电子能力，MCY-NBD发出较弱的荧光信号; 与硫醇反应后，探针的醚键断裂，释放出4号位的羟基，体系荧光增强。

    2 实验部分

    2.1 仪器与试剂

    BrukerⅢ 400核磁共振仪（瑞士Bruker BioSpin公司）; 6550 iFunnel Q-TOF 液相色谱-质谱仪（美国安捷伦科技有限公司）; Varian Cary 300紫外-可见分光光度计（美国瓦里安技术有限公司）; 稳态/瞬态荧光光谱仪（美国PTI公司）; FV1000激光共聚焦扫描显微镜（日本奥林巴斯株式会社）; Milli-Q去离子水纯化仪（美国Millipore公司）; pH计（上海雷磁设备有限公司）。

    4-甲基吡啶和4-氯-7-硝基苯并-2-氧杂-1，3-二唑（NBD-Cl，阿拉丁试剂有限公司）; 碘甲烷（西亚试剂有限公司）; 4-羟基苯甲醛（先进技术和工业有限公司）; 哌啶（美国Sigma-Aldrich公司）; 其它试剂均购于北京化学试剂公司。所用试剂均为分析纯，使用前未作进一步纯化。

    2.2 荧光探针的合成和表征

    探针的合成路线如图1所示。

    2.2.1 1，4-二甲基吡啶碘化物（2）的合成[27] 将1.96 mL 4-甲基吡啶（20 mmol）和1.56 mL碘甲烷（25 mmol） 溶于20 mL乙腈中，加热回流12 h。冷却到室温，抽滤得到淡黄色固体2 （4.14 g，产率 88%）。1H NMR （DMSO-d6， 400 MHz） δ （ppm）： 2.60 （s， 3H）， 4.28 （s， 3H）， 7.95～7.97 （d， 2H）， 8.83～8.84 （d， 2H）。13C NMR （DMSO-d6， 100 MHz）， δ （ppm）： 21.29， 47.14， 127.90， 144.44， 158.16。

    2.2.24-（4-羟基苯乙烯基）-1-甲基吡啶碘化物（1）的合成[27] 将2.35 g（10 mmol）化合物2和1.83 g（15 mmol）4-羟基苯甲醛溶于30 mL无水乙醇中，加入0.5 mL哌啶，搅拌回流10 h。冷却，过滤得到红色固体（化合物1），产率81%。1H NMR （DMSO-d6， 400 MHz）， δ （ppm）： 4.13 （s， 3H）， 6.65～6.67 （d， 2H）， 7.03～7.07 （d， 1H）， 7.50～7.52 （d， 2H）， 7.84～7.88 （d， 1H）， 7.96～7.97 （d， 2H）， 8.60～8.601（d， 2H）。 13C NMR （DMSO-d6， 100 MHz）， δ （ppm）： 46.15， 116.14， 117.65， 121.65， 131.01， 142.19， 144.02， 153.21. ESI-MS m/z： [M+] calcd for C14H14NO， 212.1075; found， 212.1137。

    2.2.3 （E）-甲基-4-（4-（7-硝基苯并[1，2，5]恶二唑-4-氧基）苯乙烯基吡啶碘化物（MCY-NBD）的合成[21] 将0.678 g（2 m mol）化合物1和0.4 g（2 m mol）NBD-Cl溶解在30 mL乙醇中，加入0.83 mL（6 mmol）三乙胺，室温搅拌，过夜。沉淀过滤，乙醇洗涤。以二氯甲烷-甲醇（5∶1，V/V）为洗脱剂，经硅胶柱分离，得到棕色固体，收率70%。

    1H NMR （DMSO-d6， 400 MHz）， δ （ppm）： 4.26（s， 3H）， 6.85～6.87 （d， 1H）， 7.52～7.59 （m， 3H）， 7.95～7.97 （d， 2H）， 8.05～8.09 （d， 1H）， 8.22～8.24 （d， 2H）， 8.66～8.68 （d， 1H）， 8.85～8.87 （d， 2H）. 13C NMR （DMSO-d6， 100 MHz）， δ （ppm）： 47.00， 110.70， 121.36， 123.64， 124.01， 130.42， 130.71， 133.70， 135.36， 139.13， 144.43， 145.22， 145.42， 152.22， 152.42， 154.36。 ESI-MS m/z： [M+] calcd for C20H15N4O+4， 375.1093; found， 375.1098。

    2.3 紫外-可見吸收光谱和荧光光谱测量

    准确称取MCY-NBD溶于二甲基亚砜（DMSO）中，配成浓度为0.01 mol/L的储备液。将生物硫醇、Na2S、各种氨基酸和阴阳离子溶于蒸馏水，配制成0.1 mol/L的溶液，备用。光谱测量时，用二甲基亚砜-磷酸盐缓冲溶液（DMSO-PBS，1∶1， V/V， pH 7.4）将MCY-NBD储备液稀释到10 μmol/L，然后测量荧光光谱和紫外-可见吸收光谱。在测定探针和硫醇的响应时，将MCY-NBD储备液用DMSO-PBS （1∶1， V/V， pH 7.4）稀释到10 μmol/L，分别加入100 μmol/L不同硫醇，室温下进行荧光光谱的测量。在用相同方法稀释的MCY-NBD（10 μmol/L）中加入不同浓度的各种硫醇溶液，室温下反应5 min后，测量荧光响应。激发和发射狭缝宽带均为2.0 nm。

    2.4 量子产率的测定

    MCY-NBD和化合物1在不同溶剂中的荧光量子产率按照公式（1）测定[42]，结果见表1。

    Φx=Φst（Dx/Dst）（Ast/Ax）（η2x/η2st） （1）

    式中， Φst为基准物质的荧光量子产率，D为荧光发射光谱的面积，A为吸光度值， η为所用溶剂的折光率，x代表被测样品，st代表基准物质。选择硫酸奎宁作为基准物，其在0.1 mol/L H2SO4中的荧光量子

    2.5 细胞毒性实验

    以HeLa细胞为模型，采用MTT实验考察MCY-NBD和MCY-NBD与GSH反应后的产物的细胞毒性。将HeLa细胞接种在96-孔板上，每孔加入200 μL DMEM细胞培养基（含10%的胎牛血清FBS），5% CO2、37℃的培养箱中孵育15 h后，实验组分别加入不同浓度的溶解在DMSO中的MCY-NBD溶液及MCY-NBD与GSH的混合溶液（[MCY-NBD]=0、1、5、10、15和20 μmol/L; [GSH]=20 μmol/L）; 同时设置对照组（细胞、200 μL DMEM培养基）和无细胞组（直接加200 μL DMEM培养基）作为调零组，96孔板边缘孔用无菌PBS填充，置于5% CO2、37℃的培养箱中。孵育24 h后，每孔加入20 μL MTT溶液（5 mg/mL，即0.5% MTT），继续培养4 h。移除培养基，在每个孔中加入150 μL DMSO，恒温振荡10 min，用酶标仪测定490 nm处各孔的吸光值（OD值）。通过公式（2）计算细胞存活率[43，44]：

    Cell viability （%）=[OD490（E）-OD490（Z）]/[OD490（C）-OD490（Z）] × 100%（2）

    其中， E代表实验组， Z代表调零组， C代表对照组。

    2.6 细胞成像

    将HeLa细胞置于DMEM培养基中（含10% FBS）培养，随后将细胞接种在培养皿中，于5% CO2、37℃条件下中培养48 h。弃去培养基，细胞用PBS缓冲溶液洗涤，分别进行如下4个实验：（1）HeLa细胞与MCY-NBD （10 μmol/L）共孵育30 min; （2）HeLa细胞与NEM （1.0 mmol/L） 共孵育30 min，然后加入MCY-NBD （10 μmol/L）共孵育30 min; （3）HeLa细胞与NEM （1.0 mmol/L） 共孵育30 min然后加入GSH （[email protected]/L）共储备1 h， 最后加入MCY-NBD （10 μmol/L）共孵育30 min; （4）HeLa细胞与H2O2 （200 μmol/L）反应30 min，接着加入MCY-NBD （10 μmol/L）共孵育30 min。孵育好的细胞用PBS洗涤3次，用激光共聚焦扫描显微镜观察细胞成像。

    3 结果与讨论

    3.1 探针与硫醇响应的紫外-可见吸收光谱和荧光光谱

    考察了探针MCY-NBD与硫醇反应前后的荧光强度随溶液pH值的变化情况。如图2所示， 当pH8，探针荧光强度增强显著。探针溶液中加入GSH后，在pH 3.9～10.2范围内，反应体系于526 nm处的荧光强度先增强后减弱，在pH=6～7时，体系的荧光强度达到最大，接近生理pH范围。因此，为了最终应用于细胞成像研究，在后续的光谱实验中，选用DMSO-PBS缓冲溶液（pH 7.4， 1∶1， V/V）作为反应介质。

    在硫醇存在下，分别采用紫外-可见吸收光谱和荧光光谱考察探针的响应情况。如图3所示，MCY-NBD在343 nm处有最大吸收，摩尔吸收系数（εmax）为4.81 × 104 L/（mol·cm）; 加入硫醇后，其最大吸收波长发生明显红移（λmax =388 nm，εmax =4.96 × 104 L （mol·cm）。

    图4A为探针MCY-NBD的激发和发射光谱，其最大激发和发射波长分别为455 nm和526 nm;

    图4B为化合物1的激发和发射光谱，最大激发和发射波长分别为390 nm和526 nm。推测的反应机理如图1所示，探针与硫醇反应后生成化合物1; 结合图3的吸收光谱，

    加入硫醇后反应体系的最大吸收峰位于388 nm，因此后续实验中，探针与硫醇反应体系的荧光光谱选择激发波长为390 nm。MCY-NBD本身的荧光量子产率很低（表1），这是由于NBD对羟基的影响降低了氧原子的供电子能力（图1）; 加入不同的硫醇（GSH、Cys和Hcy）后，荧光强度迅速增加，在2 min内达到最大值。如图5A所示，加入GSH后，体系荧光最大发射波长有约3 nm的蓝移; 而加入Cys和Hcy后，体系的最大荧光发射波长红移了2 nm，～526 nm处的荧光强度增加约8～9倍，推测是由于硫醇的SH诱导MCY-NBD的醚键断裂，释放出4号位的羟基，从而引起探针荧光信号增强。Na2S的加入使其荧光强度增加较为缓慢（图5B），因此可通过反应速率的差异区分硫醇和Na2S。

    3.2 硫醇的定量测定

    如图6所示，探针的荧光强度随硫醇（GSH（图6A）、Cys（图6B）和Hcy（图6C））浓度的增加而增强，荧光增强程度与硫醇浓度在一定范围内呈良好的线性关系，最低检测浓度均为0.1 μmol/L。图6D 为MCY-NBD与GSH反应的荧光强度隨时间的变化，探针与硫醇反应在2 min内荧光信号达到最大值，且在2 h测定时间内其荧光强度值基本保持不变，说明此探针能快速地与硫醇反应，且荧光信号稳定性良好。

    3.3 探针对硫醇响应的选择性

    考察了其它的含硫物质以及生命体系中可能存在的小分子与MCY-NBD的响应情况。如电子版文后支持信息图S1所示，当GSH、Cys、Hcy、Na2S、氨基酸（Gly、Ala、Glu、Arg、Lys、Trp、Pro、Ser、His、Leu、Thr、Val、Phe）、常见阴离子（Cl-、Br-、NO3-、NO2-、AcO-、SCN-、CO2-3、SO2-4、SO2-3）以及金属离子（K+、Na+、Ca2+、Zn2+、Mg2+、Cu2+、Al3+、Fe3+）与MCY-NBD反应5 min后，GSH、Cys、Hcy使探针的荧光强度显著增加，Na2S也有明显的增加，而其它物质未引起荧光强度明显改变。这进一步证明，MCY-NBD对硫醇具有选择性响应，可应用于细胞内硫醇的选择性检测， 且不受其它物质的干扰。

    3.4 探针对硫醇传感的机理研究

    为了研究MCY-NBD的传感机理，以GSH为代表物，采用高分辨质谱分析了MCY-NBD和GSH以及二者反应后的产物。如电子版文后支持信息图S2所示，MCY-NBD和GSH的分子离子峰分别为m/z 375.1098和3080904; 在MCY-NBD和GSH反应体系的质谱图上观察到m/z 212.1114和3080942的峰，分别对应化合物1和过量的GSH，说明GSH的加入诱导MCY-NBD的醚键断裂，从而释放出4号位的羟基，生成化合物1。同时，质谱图上还观察到m/z 471.0923的峰，其为MCY-NBD和GSH反应后生成的化合物3（如图1所示），即NBD基团直接与GSH的S原子链接后的产物。这进一步证明了探针MCY-NBD荧光强度较弱，是由于NBD对羟基的影响降低了氧原子的供电子能力所致，当探针与硫醇反应后，硫醇的SH诱导MCY-NBD的醚键断裂，释放出4号位的羟基，从而引起探针荧光信号增强。

    3.5 MCY-NBD探针细胞成像

    考察了MCY-NBD对细胞中硫醇的检测和荧光成像能力。

    如图7所示，将HeLa细胞与MCY-NBD（10 μmol/L）共孵育30 min，细胞呈现明亮的绿色荧光（图7A），这是由于细胞中内生的硫醇与探针反应的结果。为了证实探针在细胞环境中对硫醇的选择性响应，选用硫醇封阻剂N-乙基马来酰亚胺[45]（1.0 mmol/L）对HeLa细胞进行预处理，30 min后与探针（10 μmol/L）共孵育，几乎观察不到细胞荧光（图7B）。将NEM预处理过的细胞与GSH（100 μmol/L）孵育1 h，然后加入MCY-NBD（10 μmol/L），细胞发出强的绿色荧光（图7C）。当HeLa细胞与H2O2（200 μmol/L）共孵育30 min，随后加入MCY-NBD（10 μmol/L），细胞的绿色荧光强度明显减弱（图7D）。结果表明，H2O2的加入引起细胞内硫醇浓度的降低，导致荧光强度减弱。因此，此探针能被用于检测细胞内硫醇浓度的改变。MTT实验证实，MCY-NBD和MCY-NBD与GSH的反应产物具有低的细胞毒性（图8）。

    以上實验结果表明，此探针有良好的生物相容性、细胞膜通透性和低毒性，能灵敏地检测细胞内硫醇的浓度。

    4 结 论

    在接近生理pH值范围（6.0～7.0）内， 本研究合成的生物硫醇荧光探针MCY-NBD对硫醇具有高灵敏和快速响应，荧光强度增加约8～9倍，并且具有好的光稳定性和对生物硫醇的选择性响应。此探针具有低毒性和良好的生物相容性，可用于细胞内硫醇的选择性检测和成像，以及监测细胞内硫醇浓度的改变。

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    Synthesis and Properties of Fluorescent Probe for Detection

    of Biothiols in Live Cells

    NIU Wei-Fen1，2， ZHANG Chao1， JIA Juan1， YUN Ke-Ming1， SHUANG Shao-Min2，

    DONG Chuan*2， WONG Man Shing*3

    1（School of Forensic Medicine， Shanxi Medical University， Taiyuan 030001， China）

    2（Institute of Environmental Science， College of Chemistry and Chemical Engineering，

    Shanxi University， Taiyuan 030006， China）

    3（Department of Chemistry and Institute of Molecular Functional Materials， Hong Kong Baptist University， Hong Kong， China）

    Abstract A highly sensitive biothiols-selective fluorescent probe （MCY-NBD） was developed based on the merocyanine fluorophore of 4-（4-hydroxy styryl）-1-methyl pyridine iodide （MCY） and nitro benzo furazan （NBD） as the biothiols-specific recognition group. Upon reacting with biothiols， the probe showed a strong fluorescence enhancement more than 8-fold and very fast response. Moreover， the fluorescence intensity change of MCY-NBD at 526 nm was found to be linearly proportional to biothiols concentrations in the range of 0.1-4.0 μmol/L with a detection limit of 0.03 μmol/L， indicating that MCY-NBD was highly sensitive to biothiols. Confocal laser scanning microscopic imaging experiment proved that MCY-NBD had excellent biocompatibility and cell membrane permeability with low cytotoxicity， which was desirable for fast detection and visualization of both endogenous and exogenous biothiols in live cells.

    Keywords Biothiols; Fluorescent probe; Cells imaging