用于毛细管二维液相色谱的微纳样品转移技术
刘娅 张博
摘 要 亲水相互作用色谱（HILIC）与反相色谱（RPLC）是目前常用的二维液相色谱分离模式，但两种色谱模式存在流动相不兼容的问题， 因而对二维液相色谱联用过程中的样品转移技术提出了较高的要求。 本研究建立了一种可用于HILIC-RPLC二维液相色谱的样品转移技术，通过溶剂补充稀释和捕集柱富集的方法解决了二维液相色谱联用过程中溶剂不兼容的问题。通过对补充液的流速进行优化，可将第一维HILIC分离的有机相比例降至5%以下，实现高达95%的样品转移效率。将此技术应用于蛋白质酶解物的二维色谱分离，理论峰容量可达680，而且峰容量可随第一维采样频率的增加而增大，表明此技术可用于复杂样品的高分辨分离分析。
关键词 二维液相色谱; 亲水相互作用色谱; 反相色谱; 样品转移; 峰容量
1 引 言
二维分离技术是解决复杂体系分离与分析最有前景的手段之一，可有效提高色谱分离的选择性和峰容量[1]。二维分离的概念最早由Giddings提出[2]，该方法通过耦联两种不同的色谱分离模式，实现复杂样品的充分分离。二维色谱的理论峰容量是两个维度色谱分离峰容量的乘积[3]，可分为在线和离线联用两种模式[4]。为了有效增加二维液相色谱分离的分辨率，要求两个维度的色谱分离具有较高的正交性[5]。亲水相互作用色谱（Hydrophilic interaction liquid chromatography，HILIC）与反相色谱（Reversed phase liquid chromatography，RPLC）正交性良好，是目前最常使用的二维液相色谱分离模式组合之一。但HILIC与RPLC联用时存在溶剂不兼容的问题[6]：HILIC使用的高有機流动相在RPLC中显现出高洗脱强度，而反相色谱使用的高水流动相也是HILIC模式的强洗脱液。因此，第一维分离使用的流动相总在第二维分离中显现出高洗脱强度，可能导致第一维分离得到的样品在转入第二维分离时难以保留，导致第二维分离的分辨率降低，所以对两种色谱模式的联用方式提出了较高的要求。
目前，常用的HILIC与RPLC二维液相色谱联用方式有离线联用[7～10]、第一维使用细内径色谱柱[11～14]、溶剂蒸发[15]和溶剂补充稀释[16～19]等。其中，离线联用是最常用的联用方式，其将第一维分离出来的样品分段接出，经干燥复溶后，再转入第二维进行分离。该方法具有较大的灵活度，可分别对两个维度的分离进行独立优化，从而有效提高整体的分离性能。但离线联用耗时耗力，并且转移过程中可能会有样品损失，所以仅适用于大体积样品的转移，较难进行微量样品的处理和转移。也有研究者尝试采用细的第一维色谱柱和粗的第二维色谱柱，以解决溶剂不兼容的问题。但这种方法的局限性在于：第一维色谱柱内径细，样品容量低;第二维分离过程中样品的度稀释高，会大大降低检测灵敏度，且与质谱联用也较不友好。Tian等[15]开发了一种结合真空蒸发的二维液相色谱系统。第一维色谱柱分离出来的样品存储在定量环中，并通过真空干燥使样品黏附在定量环内部，之后样品溶解在第二维色谱柱使用的流动相中，再进行第二维分离。通过这种方法可有效解决溶剂不兼容的问题，但仍存在样品易丢失和仪器装置复杂等缺点，所以并未得到广泛应用。通过溶剂补充稀释将第一维色谱柱分离使用的流动相转化为与第二维色谱柱分离兼容的流动相，也是一种较常用的方法。通常，在第一维色谱柱分离的出液端通过三通引入与第二维分离兼容的溶剂进行稀释，再通过捕集柱预浓缩样品，之后将捕集柱与第二维色谱柱耦联后进行第二维分离。采用这种方法可大大降低第一维流动相的影响，也不会降低检测灵敏度。但这种方法也存在一些问题，当仅使用一根捕集柱通过反复切阀进行样品捕集和分离时[16]，第一维色谱柱分离会出现停流的现象，会造成样品返混的现象，且耗时也较长。当使用两根捕集柱进行交替捕集和分离时[17～19]，第二维色谱柱分离需使用短柱进行快速分离，无法达到分离性能最大化。此外，目前大部分二维液相色谱分离方法都是基于常规色谱柱或细径柱进行的，基于毛细管色谱柱的二维液相色谱研究仍然较为有限，因而发展面向二维液相色谱的微纳样品转移技术具有重要的意义。
本研究采用单颗粒柱塞技术[20]制备HILIC、RPLC毛细管液相色谱柱和捕集柱，通过与十通道流路选择阀进行耦联，实现二维液相色谱的微纳样品转移。此技术结合了离线联用和溶剂补充稀释，实现了微量样品的高效转移，且可对两个维度的色谱分离进行独立优化，实现分离效能的最大化。
2 实验部分
2.1 仪器与试剂
P230高压恒流泵（大连依利特仪器有限公司）; TG16-WS台式高速离心机（湖南湘仪实验室仪器开发有限公司）; Ultimate 3000纳流液相色谱仪（荷兰Thermo-Dionex公司）; 488 nm激光诱导荧光检测器（美国Beckman Coulter公司）; 超声波清洗器（江苏昆山市超声仪器有限公司）; 光学显微镜（福建麦克奥迪实业集团有限公司）; Milli-Q超纯水系统（美国Millipore公司）。
色谱纯甲醇、色谱纯乙腈（ACN）、色谱纯三氟乙酸（TFA）、二硫苏糖醇（DTT）、碘乙酰胺（IAA）、胰蛋白酶、细胞色素C、牛血清白蛋白、转铁蛋白、a-酪蛋白和肌红蛋白（美国Sigma-Aldrich公司）; 荧光标记试剂NBD-F（日本TCI公司）; 二氧六环、尿素和碳酸氢铵（分析纯， 国药集团化学试剂有限公司）。
熔融石英毛细管（河北永年锐沣色谱器件有限公司）; 单颗粒柱塞（厦门宜柱科技有限公司）; 毛细管切割器（日本GL Sciences公司）; TFE套管、FEP套管、PEEK套管、接头、二通、三通（美国IDEX Health & Science公司）; 10通道流路选择阀（美国Valco instrument公司）; 3 μm TSKgel Amide-80填料（日本TOSOH公司）; 5 μm Ultimate XB-C18填料（上海月旭材料科技有限公司）。
2.2 实验方法
2.2.1 毛细管液相色谱柱的制备 HILIC、RPLC毛细管填充柱和毛细管捕集柱的制备采用单颗粒柱塞技术[20]，具体步骤如下：（1）将单颗粒柱塞填入毛细管的一端作为出口塞; （2）通过高压泵将匀浆液压入带柱塞的毛细管内部，填柱压力最高达40 MPa; （3）当柱床达到需要的长度后缓慢泄压，再填入入口塞。用这种方法制备了长20 cm、内径100 μm的HILIC色谱柱，长15 cm、内径100 μm的RPLC色谱柱和100 μm内径的毛细管捕集柱（柱床长1 cm，全长7 cm）。
2.2.2 样品的制备 分别制备了5种标准蛋白质酶解物样品：称取1 mg蛋白质样品，溶解于50 mL 40 mmol/L pH 8.0碳酸盐缓冲溶液，如果蛋白质分子量较大（如牛血清白蛋白和转铁蛋白），需要使用8 mol/L尿素使蛋白质变性。再向蛋白质溶液加入16 μL 50 mmol/L DTT溶液，56℃水浴45 min，以打开蛋白质中的二硫键。待蛋白质溶液冷却到室温后，加入54 mL 55 mmol/L IAA溶液，避光放置30 min，以防止游离的巯基再次生成二硫键。之后加入适量的胰蛋白酶溶液（酶与蛋白质的质量比约为1∶50）于37℃反应2 h，再加入等量的酶溶液于37℃反应18 h。酶解溶液冷却到室温后，加入10 μL 10%甲酸溶液终止反应，离心，取上清液。
对蛋白质酶解物样品进行荧光标记：在20 μL蛋白质降解物样品中加入200 μL硼砂缓冲液（pH 8.0），再加入40 μL 1 mg/mL NBD-F溶液，混匀后在60℃下避光反应30 min，最后加入480 μL 50 mmol/L HCl溶液。
对用于HILIC分离的样品需溶解在高浓度ACN溶液中，所以蛋白质样品需要冻干后复溶到90% ACN溶液中，样品浓度为1 mg/mL。
2.2.3 色谱分离条件 在Ultiamte 3000纳流液相色谱系统上分别进行HILIC和RPLC一維液相色谱分离和二维液相色谱分离。 流动相A： 0.1% TFA，流动相B： ACN + 0.1% TFA。
对于HILIC一维色谱的分离， 流速： 350 nL/min; 样品： 细胞色素C降解物; 进样体积： 0.2 μL; 梯度洗脱： 0～5 min， 97% B; 5～35 min， 97%～65% B; 36～46 min， 60% B; 47～57 min， 97% B。对于RPLC一维色谱分离， 流速： 350 nL/min; 样品： 细胞色素C降解物; 进样体积： 0.2 mL; 梯度洗脱： 0～5 min， 5% B; 5～35 min， 5%～50% B; 36～46 min， 80% B; 47～57 min， 5% B。
对于HILIC-RPLC二维液相色谱分离， 第一维采用长20 cm的HILIC毛细管色谱柱进行分离， 流速： 200 nL/min; 样品： 5种标准蛋白质酶解物; 进样体积为1 μL; 第一维分离的梯度洗脱程序： 0～5 min， 97% B; 5～35 min， 97%～65% B; 36～50 min， 60% B; 51～70 min， 97% B。第一维分离得到的样品通过100%的水相溶剂进行补充稀释， 再分段捕集到不同的C18捕集柱上， 之后捕集柱与第二维色谱柱连接即可进行第二维分离。第二维采用15 cm长的RPLC毛细管色谱柱进行分离， 流速： 350 nL/min; 梯度洗脱程序： 0～5 min， 5% B; 5～35 min， 5%～50% B; 36～46 min， 80% B; 47～57 min， 5% B。
3 结果与讨论
3.1 面向二维液相色谱的微纳样品转移技术
在传统的HILIC-RPLC二维液相色谱分离方法中，第一维分离产生的馏分直接转入第二维色谱柱，严重的稀释效应和流动相不兼容的问题会直接影响色谱分离的分辨率和峰容量[21]，限制了HILIC-RPLC二维液相色谱的应用。在本研究中，为了解决HILIC与RPLC二维分离过程中溶剂不兼容的问题，设计了一种带有捕集柱和补充液的新型样品转移系统。此系统可避免稀释效应引起的灵敏度降低，实现微量样品的高效转移，而且两个维度的色谱柱都可以在最佳分离条件下运行。
采用C18捕集柱作为二维液相色谱联用过程中转移样品的容器，通过HILIC毛细管色谱柱、三通、十通道流路选择阀和捕集柱的连接， 构建面向HILIC-RPLC二维液相色谱的样品转移系统，装置如图1所示。其中，第一维液相色谱使用HILIC毛细管色谱柱进行分离。对于HILIC分离过程中产生的强洗脱馏分（对于RPLC是强洗脱馏分）， 在HILIC毛细管色谱柱的出液端连接三通，引入弱洗脱溶剂进行稀释。之后，通过十通道流路选择阀将稀释后的样品组分分段捕集到不同的C18捕集柱上。如将第一维分离得到的样品切割成10个组分以下，则连接上所需数量的C18捕集柱即可; 如果将第一维分离的样品切割成10个组分以上，则需将富集到样品的捕集柱依次替换成新的捕集柱进行实验。最后，将捕集柱通过二通连接到RPLC毛细管色谱柱上，即可进一步进行第二维反相液相色谱分离。
对于面向HILIC-RPLC二维液相色谱的微纳样品转移平台， 影响样品转移的效率和二维分离的性能的参数包括第一维和第二维色谱的分离条件、补充液的流速和第一维分离样品的切割频率等。对于HILIC和RPLC分离条件的选择，本研究组之前的工作中已分别对这两种固定相制备的毛细管色谱柱的性能进行了研究[22，23]，并建立和优化了相应的分离条件。
如图2所示，在选定的分离条件下， 分别用HILIC和RPLC毛细管色谱柱对细胞色素C酶解物进行一维液相色谱分离，在30 min的梯度洗脱时间内获得的峰容量分别为45和87。由此可知，两种色谱模式在进行一维液相色谱分离时获得的峰容量较为有限，无法用于复杂样品体系的高分辨分离，也证明了二维液相色谱分离的必要性。
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Microscale Sample Transfer Technology for Capillary
Two-Dimensional Liquid Chromatography
LIU Ya， ZHANG Bo*
（College of Chemistry & Chemical Engineering， Xiamen University， Xiamen 361005， China）
Abstract Hydrophilic interaction chromatography （HILIC） coupled with reverse phase liquid chromatography （RPLC） is the most commonly used two-dimensional separation mode. However， it is suffered from the incompatibility of mobile phase. To overcome this issue， a microscale sample transfer technology was developed for capillary HILIC-RPLC two-dimensional liquid chromatography in this work. The sample transfer technology was consisted of weak elution make-up liquid and trap column， so that the strong elution solvent from the first dimension could be diluted effectively. Through optimization of make-up flow rate， the organic concentration of the first dimension effluent was reduced to less than 5%， and up to 95% sample transfer efficiency was achieved. This technology was applied to the two-dimensional separation of five standard protein digest. When 8 sample fractions from the first dimension separation were transferred to the second dimension separation， a theoretical peak capacity of 680 could be obtained. In addition， the peak capacity could be improved with the increasing sampling frequency， suggesting that this technology could be effectively applied to high-resolution separation of complex mixtures.
Keywords Two dimensional liquid chromatography; Hydrophilic interaction chromatography; Reverse phase chromatography; Sample transfer; Peak capacity
