质谱技术在糖尿病血液非酶促糖化蛋白分析中的应用进展

    李卫峰　阎德文　金宇　李海燕　马民　吴正治

    

    

    

    摘 要 糖尿病是一种以高血糖为特征的代谢紊乱性疾病，长期的高血糖生理环境会导致蛋白质非酶促糖化程度加重，进而引发一系列病理变化。因此，蛋白质非酶促糖化引起了研究者的关注。质谱技术因具有超高灵敏度、低检出限和多组分同时分析的优势，成为蛋白质定性和定量分析不可或缺的有力工具，已被应用于非酶促蛋白翻译后修饰信息的鉴定和定量分析。本文主要对蛋白质非酶促糖化的产生原理及质谱在血液中非酶促糖化蛋白的修饰鉴定分析的研究进展进行了评述，并对该领域的发展趋势进行了展望。

    关键词 质谱; 非酶促糖化; 蛋白质; 糖尿病; 评述

    1 引 言

    蛋白质非酶促糖化是指不经酶催化，糖类分子与蛋白质中氨基酸残基ε侧链或末端的α氨基的反应过程。非酶促糖化最先会生成可逆的醛亚胺（Schiff碱的中间产物），而后经分子重排形成稳定的酮胺化合物（Amadori product），再经过氧化、降解及交联等反应， 最终形成多种异质产物，即糖化终末产物（Advanced glycation end products，AGEs），详细过程如图1所示[1]。AGEs会在细胞内累积，并与其它受体作用，导致机体组织损伤，这些过程与糖尿病的发生及发展密切相关。研究AGEs的分布、周期及其代谢规律，可在微观水平研究糖尿病，助力寻找具有糖尿病诊断价值的标志物，具有重要的临床研究价值[2]。

    AGEs检测方法多样，利用光谱法可根据糖化基质的颜色变化实时监测反应过程，但无法识别糖化产物的结构[3]。高效液相色谱法可用于糖化产物的精确检测，但方法的特异性弱[4]。基于特异性抗体的免疫检测技术特异性强，在蛋白质的总体糖化水平检测中起着重要作用，但存在操作要求高、抗体制备周期长、复杂基体中易受干扰等缺点，很难实现非酶促蛋白的大规模检测，尤其不能检测未知的AGEs。近年来，基于质谱技术的蛋白质组学策略迅速发展并日渐成熟，是蛋白质及翻译后修饰定性与定量分析的强有力工具。AGEs在糖尿病人群中普遍存在，而II型糖尿病又占糖尿病患者总人数的90%以上[5]，因此，本文主要针对质谱技术在II型糖尿病患者血液中非酶促糖化蛋白的定性与定量分析研究进行评述，并对未来发展方向进行了展望。

    2 蛋白质非酶促糖化生物学原理

    蛋白质非酶促糖化不仅限于葡萄糖，核糖、半乳糖及糖代谢中间产物（如丙酮醛、乙二醛）均可进行此反应。因葡萄糖为人体主要营养物， 所以糖化反应以葡萄糖为主。研究表明，经非酶促糖化后的蛋白结构与性质均会产生变化[6]。如非酶促糖化可改变肌红蛋白（Myoglobin， Mb）的空间构象，导致Mb的各种生物功能（如氧释放、过氧化物酶以及水解酶活性等）均发生了改变[7]。此外，同一蛋白的不同糖化产物的空间结构也有差异，如Khan等[8]研究发现，与乙二醛、甘油醛相比，丙酮醛化后的人血清白蛋白（Human serum albumin，HSA）空间结构变化最为明显。已有的临床研究表明，AGEs与包括糖尿病、肾病、阿尔兹海默症等在内的多种疾病的发生及发展密切相关[8，9]，因此，研究AGEs对深入了解诸多疾病至关重要。

    由于蛋白非酶促糖化涉及的反应物种类复杂，AGEs最大的特点及研究难点在于其自身的空间结构异质性，即使单一的葡萄糖修饰仍会产生不同种空间结构，因为蛋白质本身含有多个可与糖类进行结合的位点。通常认为，酸度系数值越小的氨基酸因亲和能力强会促进其糖化，然而糖化程度还受氨基酸周围环境的影响。当氨基酸（如赖氨酸）临近位置（序列临近或空间临近）存在带有正电荷的氨基酸（如组氨酸、赖氨酸＼，酸性氨基酸）时，会促进其糖化[10，11]。如糖化血红蛋白（Glycated hemoglobin，GHb）的β链-N末端缬氨酸糖化程度高于α链-N末端缬氨酸的原因在于，前者邻位氨基酸为组氨酸。Wang等[12]研究发现，血红蛋白的α链和β链中共有的HGKK肽段均因为存在组氨酸和赖氨酸，同时拥有可为糖化反应重排提供质子转移路径的磷酸三角结构（Phosphate triangle），详见图2。由图2可知，α链和β链中HGKK可获得相似的结构。由质谱结果得知，HGKK中仅临近组氨酸的β-Lys-66， α-Lys-61被糖化。由此可见，蛋白质非酶促糖化包含着丰富的生物学信息，阐明其糖化后的结构-性质-功能之间的关系及生物学意义，可为疾病发生及发展机制研究提供新的线索。

    3 质谱用于非酶促糖化蛋白的分析

    由于蛋白非酶促糖化的异常变化可导致一系列病变，因此，蛋白非酶促糖化的研究显得异常重要。质谱因具有超高灵敏度、优异检出限和多组分同时分析等优势，加之质谱软件和硬件的快速发展、各种色谱分离技术和涌现出的多种翻译后修饰的富集方法，为蛋白质翻译后修饰研究奠定了坚实的技术基础，其在非酶促糖化蛋白的定性和定量分析也获得一定进展，其中涉及的质谱技术及其特点见表1。

    3.1 MALDI-TOF MS用于非酶促糖化蛋白分析

    基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱（Matrix-assisted laser desorption/ionization time of flight mass spectrometry，MALDI-TOF MS）因其主要产生分子离子峰，具有質谱图简单、自动化高和分析通量高等优势，在化合物定性研究中发挥了重要的作用。基于MALDI技术用于蛋白分析常规的流程如图3所示。将目标蛋白分子或酶解后的多肽配制成μmol/L浓度水平，并与芥子酸（Sinapic acid，SA）或α-氰-4-羟

    基肉桂酸（α-Cyano-4-hydroxycinnamic acid， HCCA）等基质溶液以1∶1～1∶10的体积比混合，点样于样品板靶，待自然干燥形成结晶后，进行质谱分析。目前，MALDI-TOF MS已被用于血红蛋白、血浆蛋白等多种蛋白糖化的分析，并展现了潜在的临床应用价值。

    3.1.1 MALDI-TOF MS用于血浆中AGEs分析 首次将MALDI-TOF MS应用于AGEs分析要追溯至20世纪90年代，Lapolla等[13，14]研究了牛血清白蛋白分子量与孵育时间和葡萄糖浓度的关系。在糖尿病人群中，高血糖浓度会显著加快以HSA为代表的血浆蛋白的糖化过程。通过测定HSA的糖化水平，可反映2～3周前的血糖控制情况，有助于制定血糖浓度控制的短期方案。利用MALDI-TOF MS可视化地读取HSA及其糖化的分子量，可简便、快速反映患者血糖控制情况。MALDI-TOF MS同样可获取不同人血液中免疫球蛋白（Immunoglobulins，Igs）糖化程度，结果表明，Igs结合的糖分子数分布如下：血糖控制较差组>血糖控制达标组>健康组[15]。此外，MALDI-TOF MS可分析木瓜蛋白酶解产物中的抗原结合片段（Fragment of antigen binding，Fab）和可结晶段（Fragment crystallizable，Fc）。MALDI-TOF MS的结果表明，糖类分子更倾向与Fab片段结合，从微观水平上揭示了糖尿病患者免疫缺陷的原因[16]。

    MALDI-TOF MS是获取整体血浆蛋白糖化程度的有效手段，但不能提供修饰位点的具体信息[17]。将蛋白分子酶解成多肽小分子，同时引入同位素标记技术，可有效解决以上问题。Hage研究组[18～21] 利用MALDI-TOF MS结合16O和18O標记技术实现了糖化HSA修饰肽段的定量分析（图4），但该方案只适合体外研究。利用同一肽段在NaBH4和NaBD4作用下质量数差1 Da的特征， Liu等[22]实现了体内糖化肽段鉴定及定量分析。然而，1 Da的质量数偏差易受肽段本身的同位素峰干扰，难以应用于实际分析。Tong 等[23]将糖化蛋白分别经NaBH3CN和NaBD3CN还原，并将酶解后的肽段产物分别利用CH2O和CD2O进行二甲基化，使最后同一种肽段的质量数相差变为4m+3n（其中m代表N-末端和赖氨酸残基的数目，n代表糖化位点数目），该方案可有效进行人血浆蛋白质的非酶促糖化定量分析，具体实验原理见图5。

    3.1.2 MALDI-TOF MS用于GHb分析 与糖化HSA相比，GHb半衰期周期长，其浓度只与红细胞寿命和体内血糖的平均浓度相关，且不受运动或食物的影响，在临床上代表了近2～3个月内的血糖浓度平均值，是国际公认的用于评估糖尿人病血糖状况的金标准[24]。因GHb在临床诊断中占有重要地位，所以MALDI-TOF MS对GHb以定量研究为主。虽然早期MALDI-TOF MS的结果与常规方法（液相法、免疫法等）有所区别，但证实了血红蛋白α和β链均会发生非酶促糖化反应[25～27]。

    MALDI-TOF MS的优势在于其获得的谱图简单易分析、定性分析能力强，但激光本身能量的高斯分布及基质样品结晶不均匀等因素的存在，使其很难获得理想的定量分析结果。为克服以上难点，在优化基质结晶条件基础上增加激光的采样频率可有效弥补样品结晶不均匀带来的信号波动[28]。Biroccio等[29]优化了SA与血红蛋白样品的结晶效果后通过确保每次采样获得的离子总数一致，可同时实现GHb和谷胱甘肽血红蛋白的定量分析，其日间和日内的相对标准偏差均符合国际临床化学和实验室医学联合会（International Federation of Clinical Chemistry and Laboratory Medicine，IFCC）要求。受益于仪器灵敏度的不断提高、优异的采样速度（激光频率由10 Hz增加1 kHz）和数据分析速度，Hattan等[30]将MALDI-TOF MS技术应用于糖化血红蛋白的定量分析，性能极大提升，通过高频率激光对同一样品（仅需0.5 nL血样）进行全扫描采样，并对所获得谱图进行平均处理，可使结果的精度大大提高（RSD≤2.5%），获得的β-Hb糖化结果与临床验证的HPLC的结果一致。为了充分发挥MALDI-TOF MS高通量、快速分析的本领，Li等[31]采用激光辐照技术辅助加速蛋白酶解， 并以N-末端多肽为目标，在多肽层面上实现了8 h内定量分析2000个样品中的GHb。其中，上样、酶解、激光辐照、分析等步骤全部在同一样品靶完成，避免了传统的繁琐样本预处理过程。随着质谱仪器的不断升级和激光频率的继续提升，将进一步拓宽MALDI-TOF MS在蛋白质的非酶促糖化的应用范围。

    3.2 ESI-MS用于非酶促糖化蛋白分析

    MALDI-TOF MS用于非酶促糖化蛋白的高通量定性定量分析的优势突出，但固体制样方式并不适用于分析所有蛋白。ESI-MS的液体进样方式不仅可实现蛋白的定性和定量分析，还可反映蛋白质的固有状态[32，33]。由于ESI-MS进样口可与色谱检测器末端相互兼容，尤其适用于分析复杂基体的样本，因此被广泛应用于血液中AGEs鉴定[34]，其常规的鉴定流程如图6所示，首先将细胞或组织破碎提取蛋白质，对特定的蛋白进行富集、酶解，获得多肽进入质谱进行二级或多级质谱分析，并对实验结果进行数据处理及搜库。

    3.2.1 ESI-MS/MS用于血浆中AGEs分析 Lapolla等[34]利用LC-MS/MS研究发现糖化反应会降低HSA的酶解效率，并获得了5个（233K、276K、378K、545K、525K）易被糖化位点，与理论计算结果吻合。虽然酶解后的肽段可直接进行质谱分析，并获得修饰信息，但易缺失糖化程度较低的位点信息。利用硼酸亲和富集方式可提高糖化修饰位点鉴定信息[35，36]。Zhang等[37]采用该方法并结合电子转移解离技术（Electron transfer dissociation，ETD）鉴定到76种血浆蛋白和31种红细胞膜蛋白同时被糖化，其中糖尿病患者体内蛋白糖化和修饰位点数均高于健康者。在对血浆蛋白、血浆低丰度蛋白和红细胞膜蛋白富集后的糖化肽段进行阳离子交换，获取不同馏分，并进行质谱分析，可鉴定7749种肽段和3742种蛋白被糖化[38]。

    同位素标记技术发展为蛋白组学研究提供了新的选择，Priego-Capote等[39，40]利用高能碰撞解离技术（High-energy collisional dissociation，HCD）碎裂技术，结合碰撞诱导解离（Collision-induced dissociation，CID）的碎片信息，从血浆参照物中鉴定了50种糖化蛋白和161种糖化修饰位点，通过计算13C6和12C6葡萄糖作用糖化肽段信号强度比值可实现糖化修饰的定量分析，具体流程见图7。由于HSA本身的选择性糖化，利用同位素标记技术可获得难糖化肽段和易糖化肽段。Zhang等[41]通过将难糖化肽段作为内标，发展了一种无需标准品、无标记的糖化肽段的质谱分析法，利用该方法筛选到8条可进行糖尿病早期诊断的潜在标志物。

    在蛋白鉴定过程中，新型离子解离方式的引入常会改善蛋白鉴定效果，Keilhauer等[42]通过优化后的HCD对人体糖化蛋白进行了分析。新型发展HCD有利于发现新的修饰位点， 且采用1 μL血液样本、 在单次质谱分析条件下即可稳定获得101种修饰位点信息[42]。 除离子解离方式外，质谱数据的采集模式也会影响蛋白鉴定结果。Frolov等[43]发展了一种分段采集离子（Gas phase fractionation，GPF）技术，并利用该技术实现了人体AGEs肽段的定性和定量分析，其中19个糖化位点在糖尿病患者体内含量升高。Spiller等[44～46]利用多反應监测技术（Multiple reaction monitoring，MRM）精确筛选到健康者和糖尿病患者中差异表达的6种特异性糖化位点，将结合珠蛋白的Lys-141糖化信息、GHb和空腹血糖等指标联合用于糖尿病诊断，方法的敏感性和特异性分别为94%和96%。人体中的糖化反应（如羧乙基化（Carboxyethylation，CEL）和羧甲基化（Carboxymethylation， CML））被证实会参与细胞黏附、信号通路、血管再生等活动[47]。然而，上述修饰在血浆中难以检测，常规手段需要进行体外孵育[48]。Graifenhagen等[49]利用CEL、CML修饰肽段碎裂时产生的特征性碎片实现了人体血浆中CEL、CEL修饰，并进行了鉴定分析，共鉴定到17种蛋白和21种CML及CEL修饰。

    在线自动化处理技术技术的发展，推动了非酶促糖化蛋白的分析技术的进步。Zhang等[50]利用二维色谱分离串联质谱技术实现了在线分离富集血浆中糖化多肽及分析，方法的检出限为1.2×[email protected]@12 g，相对偏差小于20%，获得的糖化肽段数目是一维液相色谱的3倍。Jeon等[51]发展了一种可高通量进行蛋白前处理的系统，该系统将蛋白还原、烷基化、酶解、糖化肽段富集等多个步骤整合在一块96孔板进行，具有重现性好、通量高的分析优势，对无标记的蛋白定量分析具有重要意义。另外，随着质谱软硬件的不断升级，涌现出多种新型采集模式，包括平行反应监测（Parallel reaction monitoring，PRM）和数据非依赖性采集技术（Data-independent acquisition/Sequential window acquisition of all theoretical fragment ions，DIA/SWATH）。Korwar等[52]采用PRM、SWATH等多个定量分析策略研究了不同糖尿病表型的HSA糖化肽段的分布信息。利用PRM和SWATH技术可获得相同的结果，均可用于筛选具有糖尿病诊断的潜在标志物。与数据依赖性采集（Data-dependent acquisition，DDA）相比，DIA/SWATH技术无需指定目标肽段，可无遗漏、无差异地获得待测样本中所有蛋白组分碎裂信息，具有重现性好、通量高的优势。DDA是蛋白质鉴定最有效的手段，在通常情况下，DIA的定量分析能力发挥需依赖于DDA技术建立肽段谱库。Bruderer等[53]采用DDA模式采集并建立了肥胖症及糖尿病人群的血浆蛋白谱库。基于以上谱库，在DIA模式下实现了1508份临床样本中565种血浆蛋白的重复稳定的定量分析，并首次在未进行糖化肽段富集的情况下定量分析了234个糖化位点。根据临床资料，蛋白质的非酶促糖化比例在减肥到体重维持稳定期间会呈先上升后下降的生理现象。

    虽然Bottom-up技术是AGEs分析主流，但该技术需经历蛋白变性、还原、烷基化及酶切等步骤，会缺失肽段与蛋白质之间的归属信息，导致不同修饰之间的关联分析变得困难。自中向下（Middle-down）和自上而下（Top-down）蛋白组学技术的发展解决了上述部分问题[54]。Middle-down采用不同的酶解策略可以获得较大肽段，相比Bottom-up方法来说，可分析的肽段范围更广[55]。Top-down因不需酶切过程，直接以完整蛋白质为分析对象，提供了蛋白质更精准、更丰富的生物学信息[56～58]。由于非酶促糖化反应涉及反应物种类繁多，因此生成的AGEs均具备异质性。采用Middle-down和Top-down技术可有效地对AGEs进行规模化的蛋白质变体鉴定[59]。Liu等[60]利用Middle-down技术实现对含有FC片段蛋白的快速鉴定，有效提高了异质蛋白的多种翻译后修饰鉴定（包括糖基化、糖化及氧化等），还可用于获取抗体药物在研发及临床应用过程中糖化修饰的动态变化信息。人载脂蛋白A-I （ApoA-I）的含量与冠心病患病率负相关，是一种调节高密度脂蛋白胆固醇流出量（HDL-E）的功能蛋白，但是ApoA-I本身含有多种异构，各个异构体与HDL-E高低关系有待研究。Seckler等[61]利用Top-down策略对ApoA-I进行了研究，发现ApoA-I含有18种异构和11种翻译后修饰，包括了糖化、磷酸化、羧甲基化、棕榈酰化等，其中在18种异构体中的6种在高HDL-E值中发生了显著性上调。

    3.2.2 ESI-MS/MS用于GHb分析 2002年，IFCC将ESI-MS认定为GHb测定的标准。采用高压液相色谱法将GHb中β链N-末端的VHLTPE肽段进行分离，然后采用ESI-MS对GHb进行定量测定[62]。Priego-Capote等[63]采用同位素标记方法定量研究了葡萄糖对红细胞产物中蛋白的影响。研究表明，红细胞中多种蛋白糖化比例与GHb值正相关。Wang等[12]分别采用胰蛋白酶、凝乳胰蛋白酶和金黃色葡萄球菌V8蛋白酶对血红蛋白进行酶解及糖化位点鉴定。利用3种酶酶切的互补性，可深度获得血红蛋白的糖化修饰信息，且各位点在正常人和糖尿病患者体内有明显差异。血红蛋白作为红细胞中的主要成分，除了与葡萄糖作用外，同时受其它体内外代谢物作用，因此获取其它修饰位点信息对糖尿病疾病的认识具有重要的临床意义。如丙酮醛化血红蛋白在糖尿病患者的含量高于正常人[64，65]，当人体丙酮醛含量升高时，会导致胰岛素抵抗和典型的糖尿病代谢紊乱，似乎是糖尿病及并发症发生的起因[66]。此外，Jagadeeshaprasad等[67]利用PRM研究了糖化、羧甲基化及羧乙基化修饰位点与糖尿病表型的相关性，研究发现结合3种糖化修饰可有效评价糖尿病患病进程。Chen等[68～71]采用nano-LC-MS/MS系统研究了多种修饰血红蛋白在糖尿病吸烟患者和非吸烟患者之间的差异，获得了吸烟对糖尿病的影响显著性修饰信息，为研究吸烟与糖尿病的相关性提供了理论依据。

    4 总结与展望

    目前，质谱技术在AGEs分析研究中的应用日趋广泛，MALDI-TOF MS可实现蛋白整体糖化水平，Bottom-up方式可同时获得蛋白多种翻译后修饰信息。但是， 非酶促糖化是一个修饰多样性、各类修饰丰度差异大的动态反应过程，对于含量极低的修饰，同时满足高丰度和低丰度修饰信息的分析还具有很大的挑战。另外，Bottom-up以多肽为研究主体，在酶切过程中丢失了肽段与蛋白质之间的归属信息，导致不同修饰之间的关联分析变得困难。充分发挥Middle-down和Top-down技术的优点， 获取蛋白结构和功能等生物学信息， 是非酶促糖化蛋白未来研究的一个发展方向。

    获得分析速度快、稳定性高、重现性好的定量分析结果是蛋白分析的一个难题。目前，集成化的蛋白酶解策略的发展在有效降低蛋白样本处理时间，结合DIA具有重现好、通量高的优势将获得更加精确、稳定的蛋白定量信息，加上新发展的BoxCar质谱采集方法，通过将母离子的荷质比采集窗口分段成多个窗口，提高母离子注入时间，使高丰度和低丰度肽段信号强度平均化，在未进行分离富集的情况下提升了低丰度肽段信噪比，是未来AGEs定量分析的另一个发展趋势，既满足临床自动化分析策略的需求，也是顺应医学大数据时代的发展需要[72～75]。

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    Application of Mass Spectrometry in Analysis of Non-Enzymatic

    Glycation Proteins in Diabetic Blood

    LI Wei-Feng1，2， YAN De-Wen2， JIN Yu2， LI Hai-Yan2， MA Min， WU Zheng-Zhi，2，3

    1（Integrated Chinese and Western Medicine Postdoctoral Research Station， Jinan University， Guangzhou 510632， China）

    2（The First Affiliated Hospital of Shenzhen University， Shenzhen 518020， China）

    3（Shenzhen Institute of Gerontology， Shenzhen 518020， China）

    Abstract Diabetes mellitus is a metabolic disorder disease characterized by hyperglycemia. Long-term physiological environment of hyperglycemia will aggravate the degree of non-enzymatic glycation proteins. Because the abnormal changes of non-enzymatic process will cause a series of pathological changes， non-enzymatic glycation proteins have attracted researchers' attention. Mass spectrometry is an indispensable and powerful analytical tool for qualitative and quantitative analysis of proteins due to its ultra-high sensitivity， excellent detection limit， and multi-component simultaneous analysis， and has been applied to the identification and qualification of non-enzymatic glycation protein. Herein， the principle of non-enzymatic proteins and the research progress of mass spectrometry in the identification and analysis of glycated plasma proteins and hemoglobin in blood were reviewed， and the development trend of this field was prospected.

    Keywords Mass spectrometry; Non-enzymatic glycation; Proteins; Diabetes mellitus; Review